Rezeke Edilen İnsan Tümör Örneklerinden Ex Vivo Organotipik Psödomiksoma Peritonei Tümör Dilimlerinin Kültürü ve Görüntülenmesi

Özet

Periton yüzeylerine metastaz yapmış insan kanserlerinin üretimi, kültürü ve görselleştirilmesi için bir protokol tanımlıyoruz. Rezeke edilen tümör örnekleri bir vibratom kullanılarak kesilir ve oksijenasyon ve canlılığın artması için geçirgen ekler üzerinde kültürlenir, ardından konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak görüntüleme ve aşağı akış analizleri yapılır.

Özet

Psödomiksoma peritonei (PMP), müsinöz primer tümörün yayılması ve bunun sonucunda periton boşluğunda müsin salgılayan tümör hücrelerinin birikmesi sonucu ortaya çıkan nadir bir durumdur. PMP, apendiks, yumurtalık ve kolorektal dahil olmak üzere çeşitli kanser türlerinden kaynaklanabilir, ancak apendiks neoplazmları en yaygın etiyolojidir. PMP'nin (1) nadirliği, (2) sınırlı murin modelleri ve (3) müsinöz, asellüler histolojisi nedeniyle incelenmesi zordur. Burada sunulan yöntem, tümör mikroçevresinin (TME) bozulmadan kaldığı bir preparatta hasta kaynaklı ex vivo organotipik dilimler kullanılarak bu tümör tiplerinin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine ve sorgulanmasına izin verir. Bu protokolde, ilk önce bir vibratom ve ardından uzun süreli kültür kullanarak tümör dilimlerinin hazırlanmasını tarif ediyoruz. İkincisi, tümör dilimlerinin konfokal görüntülemesini ve canlılık, kalsiyum görüntüleme ve lokal proliferasyonun fonksiyonel okumalarının nasıl izleneceğini açıklıyoruz. Kısacası, dilimler görüntüleme boyaları ile yüklenir ve konfokal mikroskop üzerine monte edilebilen bir görüntüleme odasına yerleştirilir. Hızlandırılmış videolar ve konfokal görüntüler, ilk canlılığı ve hücresel işlevselliği değerlendirmek için kullanılır. Bu prosedür aynı zamanda TME'deki translasyonel hücresel hareketi ve parakrin sinyal etkileşimlerini de araştırır. Son olarak, akış sitometri analizi için kullanılacak tümör dilimleri için bir ayrışma protokolünü tanımladık. Kantitatif akış sitometri analizi, bağışıklık manzarasında ve epitel hücre içeriğinde meydana gelen değişiklikleri belirlemek için tezgahtan başucuna terapötik testler için kullanılabilir.

Giriş

Psödomiksoma peritonei (PMP^{), yılda 1} milyon kişi başına 1 insidans oranı ile nadir görülen bir sendromdur. PMP vakalarının çoğu apendiks neoplazmlarından metastazlardan kaynaklanır. Farelerin insan benzeri bir eki olmadığı göz önüne alındığında, bu tür kanserlerin modellenmesi son derece zor olmaya devam etmektedir. Primer hastalık sıklıkla cerrahi rezeksiyon ile tedavi edilebilirken, metastatik hastalık için tedavi seçenekleri sınırlıdır. Bu nedenle, bu yeni organotipik dilim modelini geliştirmenin mantığı, PMP'nin patobiyolojisini incelemektir. Bugüne kadar, sürekli olarak kültürlenebilecek apendiks organoid modelleri yoktur; Bununla birlikte, yeni bir modelin terapötik ajanların farmakolojik testleri ve immünoterapi² için yararlı olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, beyin, meme, pankreas, akciğer, yumurtalık ve diğerleri gibi diğer insan kanseri türlerinde kullanılan organotipik bir dilim kültür sistemini uyarladık ^3,4,5,6.

Apendiks neoplazmlarına ek olarak, PMP bazen yumurtalık kanserleri⁷ ve nadir durumlarda intraduktal papiller müsinöz neoplazmlar⁸ ve kolon kanseri⁹ dahil olmak üzere diğer tümör tiplerinden kaynaklanır. Ek olarak, bu tümörler yavaş büyüme eğilimindedir, hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modellerinde zayıf engraft oranları^10,11. Bu zorluklar göz önüne alındığında, PMP'nin patobiyolojisini ve bu kanser hücrelerinin periton yüzeylerine nasıl alındığını, çoğaldığını ve bağışıklık gözetiminden nasıl kaçtığını anlamaya başlamak için bu hastalığı incelemek için modeller geliştirmek için karşılanmamış bir ihtiyaç vardır.

Sistemik vasküler dolaşımdan kesilirken, tümör dilimleri hücre dışı matriks, stromal hücreler, bağışıklık hücreleri, kanser hücreleri, endotel hücreleri ve sinirler dahil olmak üzere hücresel ve asellüler bileşenler içerir. Bu yarı bozulmamış mikro ortam, sadece kanser hücrelerinden oluşan 3D organoid kültürlere kıyasla benzersiz bir şekilde avantajlı olan bu hücre tiplerinin işlevsel olarak araştırılmasına izin verir¹². Organotipik dilim kültürleri bazı açılardan avantajlı olsa da, genişletilebilen 3D organoidlere kıyasla doğal olarak düşük verime dayalı bir yaklaşımdır ve çok katlı araştırma terapötik ilaç taraması için uygundur^13,14,15. PMP durumunda, PMP türevi organoidlerin güvenilir bir şekilde kurulduğunu ve sürekli olarak geçtiğini belgeleyen hiçbir rapor bulunmamaktadır¹⁶. Bu muhtemelen PMP kaynaklı tümör hücrelerinin yavaş büyüyen doğasının yanı sıra bu müsinöz tümörlerde bulunan düşük sayıda malign epitel hücresinden kaynaklanmaktadır. PMP'yi incelemek için modeller geliştirme ihtiyacı göz önüne alındığında, organotipik dilimler bu hastalığı incelemek için benzersiz bir şekilde uygundur. İnsan örneklerinden PMP'nin hazırlanması, görüntülenmesi ve analiz edilmesi için bir protokol sunuyoruz.

Protokol

Tüm dokuların tanımlanması ve edinilmesi, San Diego'daki Kaliforniya Üniversitesi'nde IRB onaylı bir protokol kapsamında gerçekleştirildi.

1. Doku işleme ve kültür için insan PMP dokularının hazırlanması

1. Tümör dokularının taşınması ve mikrodiseksiyon
   1. Taşıma ve kültür ortamını hazırlayın: %10 (v/v) Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), %10 FBS, 2 mM L-Glutamin, %1 Penisilin/Streptomisin (Pen Strep) ile tamamlayın.
   2. Doku varışında ve kurumsal IRB onaylı bir protokole göre, PMP tümör dokularını tam DMEM içeren 6 cm çapında 35 kaba aktarın.
   3. Bir neşter kullanarak tümörün katı bölgelerini sıvılaştırılmış müsinden mikro-disseke edin. Dokunun katı kısımlarına gömülü müsin nodülleri kesilebilirken, tümörün tüm sıvılaşmış bölgelerini çıkarın. Herhangi bir sıvılaştırılmış müsin veya yüksek derecede müsinöz doku bölgelerini çıkarmaya ek olarak, bir neşterle kesilmesi zor olan herhangi bir dokuyu çıkarın. Doku nodüllerini kabaca 1^cm3 büyüklüğünde daha küçük parçalara ayırın.
      NOT: Müsin ve yoğun ECM'den temizlenmiş tümör nodüllerinin elde edilmesi, vibratom kullanılarak başarılı bir kesim için gerekli olacaktır. Kalite kontrol olarak, araştırma laboratuvarına gelen tümör dokusu önce bir patolog tarafından kesilir, daha sonra UCSD biyodeposu tarafından dağıtılır. Omental kekin palyatif debulizasyonuna tabi tutulan doku donörleri, yüksek bir hastalık yükü göz önüne alındığında, bu protokol için en uygun vakalardır ve bu da araştırma için artan doku mevcudiyeti kütlesinden daha fazla dilim üretimi sağlar.
      DİKKAT: İnsan dokularıyla çalışmak, Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL2) sertifikası gerektirir. BSL2 prosedürleri hakkında eğitim almak için kuruma danışın.
2. Agaroz hazırlama ve doku gömme
   1. Doku varışının aynı gününde FBS'siz PBS'de% 5'lik bir düşük erimeli agaroz çözeltisi hazırlayın. Hızlı bir şekilde kaynama eğiliminde olduğu için agaroz çözeltisine çok dikkat edin.
      NOT: Düşük erimeli agaroz, doku parçalarının gömülmesi için gereklidir. Yüksek eriyik agaroz, daha yüksek sıcaklıklarda katılaşacak ve gömülürse doku dilimlerinin yaşayabilirliğini azaltacaktır. Ek olarak, çözünme çözeltisindeki FBS, çökeltilerin oluşmasına neden olacaktır.
   2. Elde edilen mendil parçalarını sıvı olmadan 6 cm'lik tabaklara yerleştirin. 6 cm'lik tabak başına en fazla 2-3 parça yerleştirin, böylece diğer dokuları rahatsız etmeden veya dokunmadan agaroz küpleri olarak çıkarılabilirler.
   3. Sıvı% 5 agaroz çözeltisini, 1 cm3 tümör örneklerini içeren 6^cm'lik tabaklara ekleyin. Sadece örneği örtmek için yeterli agaroz ekleyin. Eklendikten sonra, gömülü dokuları 30 dakika boyunca 4 ° C'lik bir buzdolabına yerleştirin.
3. Doku örneklerinin vibratom üzerine montajı
   1. Katılaşmış agar'ı buzdolabından çıkarın ve agaroz küplerini bir neşter kullanarak dokunun genişliğinden biraz daha büyük kesin.
   2. Vibratom aşamasına süper yapıştırıcı uygulayın ve agaroz küpünü yavaşça süper yapıştırıcının üzerine yerleştirin. Tutkalın katılaşması için 1-2 dakika bekleyin. Bu noktada, dokulu agaroz küpü sahneye sabitlenmelidir.
   3. Bıçağı vibratoma sabitleyin ve doku bölümünün istenen kalınlığını ayarlayın. Konfokal mikroskopi kullanılarak optimal aşağı akış görüntülemesi için, bölümler kabaca 150 ila 250 mikron olmalıdır. Başlat düğmesine basın ve doku tamamen kesilene kadar agaroz doku bloğunun kesilmesi yoluyla dönmeye devam edin.
      NOT: Doku kesilmiyorsa veya agaroz küpünden ayrılıyorsa, dokuyu daha yüksek konsantrasyonlu bir agaroza gömmeyi düşünün ve vibratom bıçağına kesmek veya yapışmak için çok yoğun olabilecek ek doku parçalarını kesin.
4. Geçirgen uçlar üzerinde doku dilimlerinin kültürlenmesi
   1. Geçirgen membranın üstüne 2 mL tam DMEM ortamı ve altına 3 mL ekleyerek kültür için geçirgen bir kesici uç plakası hazırlayın.
   2. İnce bir boya fırçası kullanarak doku dilimlerini vibratomun kesme odasından yavaşça kaldırın ve iki ila dört dilimi tam DMEM ortamı içeren geçirgen kültür kaplarına yerleştirin. 24 saat sonra, bir pipet kullanarak ortamı aspire edin ve ortamı taze kültür ortamıyla değiştirin.
   3. Dilimleri 37 °C/%5 CO_2'de 7 güne kadar kültürleyin ve ortamı her 24 saatte bir değiştirin. Bu zaman noktasında, farmakolojik müdahale gerçekleştirmek için kültür ortamına hücre öldürme (bortezomib) ve test edilebilir kemoterapiler 5-florurasil (5-FU) için kontroller ekleyin.
   4. 7 günlük kültürlemeden sonra, ilaçla tedavi edilmeyen koşullar altında (tam DMEM) gün 0 zaman noktasına (kesimden hemen sonra) kıyasla yaklaşık% 15 -% 25'lik bir canlılık kaybı bekleyin. Kalsein (canlı) ve propidyum İyodür (ölü) gibi canlı-ölü canlılık boyalarını kullanarak canlılığı ölçün.

2. Canlı insan doku dilimlerinin konfokal görüntülenmesi

NOT: Organotipik tümör dilimleri hazırlandıktan sonra, etkili ve optimize edilmiş bir aşağı akış analizi gerçekleştirmek için doku canlılığını belirlemek önemlidir. Tümör örneklerinin 150-250 μm kalınlığında olduğu göz önüne alındığında, konfokal veya iki foton mikroskopisi, in situ çalışmaları belirlemek için geniş alan mikroskoplarına göre şiddetle tavsiye edilir. Akış sitometrisi, canlılığı ve hücresel popülasyonları belirlemek için de kullanılabilir (yöntemler aşağıdadır). Bununla birlikte, akış sitometri analizi sırasında uzamsal çözünürlük kaybolur ve tümör dilimlerini mekanik ve kimyasal yöntemlerle ayırma ihtiyacı göz önüne alındığında canlılık muhtemelen hafife alınmaktadır.

1. Reaktif hazırlama ve deney kurulumu
   1. Konfokal görüntüleme analizi için tümör dilimlerini,% 1 FBS içeren PBS içeren 12 delikli bir kabın tek bir kuyucuğuna yerleştirin. Kalsiyum görüntüleme deneyleri için, PBS yerine, dilimleri aşağıdaki gibi hazırlanmış hücre dışı kalsiyum çözeltisinde inkübe edin: 125 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 2.56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl₂, 25 mM HEPES,% 0.1 BSA, pH 7.4, 3 mM glikoz, steril filtrelenmiş. Bu çözümü önceden hazırlayın ve 4 °C'de 1 aya kadar saklayın (bkz. bölüm 2.1.8).
   2. Üretici tarafından önerilen konsantrasyonları ve protokolleri takiben, doku dilimlerinin yaşayabilirliğini belirlemek için görüntüleme boyaları ile numuneleri lekeleyin (bkz. Canlılık boyasını ekledikten sonra 10 dakika-1 saat boyunca görüntü.
   3. İnkübasyondan sonra, dilimleri konfokal bir görüntüleme cihazında görüntüleme için kullanılmak üzere% 1 FBS içeren PBS içeren optik olarak berrak, cam tabanlı bir Petri kabına aktarın.
      NOT: Konfokal görüntüleme için Nikon A1R Konfokal platformu kullanılmıştır.
   4. Konfokal görüntüleme yazılımını açın. Görüntülemeye 10x'te başlayın ve XYZ görüntüleme modunu seçin. Ardından, alma ayarlarını aşağıdaki gibi yapılandırın.
      1. Aşağıdaki lazerleri açın: 488 nm ve 561 nm. Kazancı% 1'de lazer gücüyle 100'e ayarlayın. Görüntü yakalama sırasında lazer gücünü ve kazancı gerektiği gibi ayarlayın. İstenen görüntü kalitesine bağlı olarak, daha yüksek çözünürlük için 512 x 512 piksel veya 1024 x 1024 piksel seçeneğini belirleyin.
   5. Kilidi Kaldır'ı seçin ve ardından görüntülemeyi başlatmak için Tara'yı seçin.
   6. Kalsiyum görüntüleme için, doku dilimlerini ışıktan korunan 1 saat boyunca Fluo-4-ile inkübe edin. DMSO'da Fluo-4-'yi çözmek için üreticinin protokolünü takip edin. 1 saat sonra, dilimleri hücre dışı kalsiyum çözeltisi ile 3x yıkayın ve 2.1.4-2.1.5 adımlarında görüntüleme protokolünü izleyin.
   7. Fluo-4-kullanan kalsiyum görüntüleme deneyleri için XYZT'yi seçin ve edinme hızını artırmak için 561 nm lazerin seçimini kaldırın. Ek olarak, görüntüleme hızını daha da artırmak için rezonans tarayıcısını kullanın.

3. Akış sitometrisi için canlı dilimlerin ayrılması

NOT: Canlı doku dilimlerinin ayrışması, immünotipleme, canlılığın değerlendirilmesi ve farmakolojik müdahaleden sonra hücre popülasyonlarındaki değişikliklerin sorgulanması dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir. Ayrışma işlemi sırasında doku kalitesinin ve hücre canlılığının korunmasını sağlayacak adımlar atılmalıdır.

1. 1 dakika boyunca pipetleme yaparak güçlü mekanik ayrışmaya izin vermek üzere açıklığı genişletmek için 1 mL'lik pipet ucunun ucundan küçük bir parça kesin.
2. Yüksek glikozlu DMEM, %10 nazik kollajenaz/hyaluronidaz (GCH), %10 FBS ve %10 DNaseI (1 mg/mL stok) içeren 1 mL sindirim tamponunda 5-15 dakika rotasyonla 37 °C'de dilimleri inkübe edin.
   NOT: Kollajenaz / hyaluronidazın partiye bağlı değişiklikleri sıklıkla bulunur.
3. İnkübasyon sırasında 2-3 kez mekanik ayrışma kullanarak dokunun kuvvetli bir şekilde bozulmasını gerçekleştirin. Tam sindirim kanıtı için her 5 dakikada bir sindirimi gözle kontrol ettiğinizden emin olun. Gerekirse, adım 3.1.4'e geçerek enzimatik sindirimi durdurun.
4. Sindirildikten sonra, dilimleri ve sindirim ortamını 50 mL'lik bir konik tüpün üzerine yerleştirilen 70 μm'lik bir filtrenin üzerine pipetleyin. Steril forseps veya pipet kullanarak daha büyük parçalar seçin.
5. Plastik 5 mL'lik bir şırınganın künt arka ucunu kullanarak, daha büyük ayrışmamış dilimleri ezin ve% 2 FBS içeren 4 mL PBS ile yıkayın.
6. İlişkisiz hücre süpernatantını 50 mL'lik bir konik tüpte alın ve 5-10 dakika boyunca 300 x g'de döndürün. Süpernatantı çıkarın ve peleti% 2 FBS içeren 1 mL PBS ile yıkayın.
7. Numuneyi akış sitometrisine hazırlamak için, 50 μL insan Fc-bloğu içeren bloke edici tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika bekletin. %2 FBS içeren 50 μL PBS'de ilgili antikorları kullanarak hücre dışı boyama yapın.
   NOT: Birçok akış sitometri sistemi vardır. Numune akış sitometrisi için hazırlandıktan sonra, cihazın çalışması için üreticinin protokolüne başvurun.

4. Canlılık ve proliferasyon analizi için canlı doku dilimleri kullanılarak farmakolojik müdahale

NOT: Organotipik tümör dilimleri hazırlandıktan sonra, ilaç testi, siRNA ve canlı doku dilimlerinin viral enfeksiyonu da dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak girişimsel yaklaşımlar gerçekleştirilebilir. Burada uyuşturucu testlerinin yanı sıra yerel proliferasyon kullanılarak canlılık analizini içeren aşağı akış fonksiyonel okumalarını tartışacağız.

1. %10 FBS, 2 mM L-Glutamin, %1 Pen Strep ile 10 mL %10 v/v tam DMEM hazırlayın.
2. Kontrol ve tedavi koşulları için Aliquot 5 mL komple ortam. Kalan 5 mL ortama, pozitif bir kontrol olarak tümör dilimlerinde hücre ölümünü indüklemek için bortezomib (2 μM) ekleyin.
   NOT: Bortezomib, yüksek konsantrasyonlarda, hücre ölümüne neden olan sitotoksik bir ilaçtır. Diğer sitotoksik ilaçlar hücre öldürme için pozitif kontrol olarak kullanılabilir.
3. Geçirgen tabakların üzerine kaplanmış iki ila dört doku dilimi kullanarak, adım 4.2'de hazırlanan ortamı yemeğe ekleyin, ayrıca adım 2.1.2'de açıklandığı gibi konfokal mikroskopi kullanılarak aşağı akış canlılığı CANLI / ÖLÜ analizi için kullanılacak ek kombinasyon terapilerini ekleyin veya sıralı olarak eşleşen dilimleri kullanarak ticari bir ışıldayan canlılık analizi kullanın.
   NOT: Sıralı dilim eşleştirme, ışıldayan canlılık testinin hücresel ATP içeriğine dayandığı göz önüne alındığında, ışıldayan canlılık analizi için gereklidir. Hücre lizisi sırasında iç kontroller kaybedildiğinden, sonuçlar canlı hücrelerin başlangıç sayısına bağlı olduğundan benzer büyüklükteki dilimler gereklidir (yani, dengesiz dilimler dengesiz sonuçlara neden olur). Kullanıcı sıralı dilimler elde etmezse, ışıldayan canlılık analizi mümkün değildir ve bu nedenle başka bir canlılık değerlendirme yöntemi gerekecektir (akış sitometrisi veya konfokal görüntüleme tabanlı canlı hücre analizi).
4. Tam DMEM içeren kültürde doku dilimlerini 2-5 gün bekletin, her gün bortezomib ve 5-FU'yu değiştirin.
5. Işıldayan canlılık analizi için, 12 delikli bir kaba 500 μL PBS ekleyin ve sırayla eşleşen doku dilimlerini bir boya fırçası kullanarak PBS çözeltisine aktarın veya bunları aktarmak için nazikçe 1 mL'lik bir pipetin emiş gücünü kullanın.
6. PBS'yi çıkarın ve hazırlanan ışıldayan canlılık analizi çözeltisini ekleyin. Reaktifin hazırlanması için kullanım kılavuzuna bakın.
7. Koşul başına 500 μL ışıldayan canlılık çözeltisi ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde yavaş bir dönüşle inkübe edin. Bir lüminesans plaka okuyucu kullanarak lüminesansı okuyun.

Sonuçlar

Kısacası, PMP'den insan tümör örnekleri IRB onaylı bir protokol altında elde edilir. Doku hazırlanır, mikro-disseke edilir ve bir vibratom kullanılarak kesilmek üzere bir agaroz kalıbında katılaşır (Şekil 1A; Video 1). Kesildikten sonra, doku dilimleri geçirgen uç membranlara yerleştirilir ve kültürlenir (Şekil 1B), bu da in situ görüntüleme tahlillerinin yanı sıra akış sitometrisi, konfokal görüntüleme analizi v...

Tartışmalar

Bu makalede, insan psödomiksoma peritonei (PMP) tümör örneklerini kültürlemek, sorgulamak ve analiz etmek için kullanılabilecek bir teknik açıklanmaktadır. Tümör immün mikro çevresini sorgulamak için çok sayıda aşağı akış fonksiyonel tahlili ve tezgahtan başucu testi için bir platform kullandık.

Yöntem ellerimizde oldukça verimli olsa da, bir vibratom kullanarak tümör örneklerini kesmek için biraz pratik gerektirecektir. Yani, yüksek derecede müsinöz örnekle...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
100 micron filter	ThermoFisher	22-363-549
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
3 M KCl solution	Sigma	60135
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
ATPγS	Tocris	4080
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Calcein-AM	Invitrogen	L3224
CD11b	Biolegend	101228
CD206	Biolegend	321140
CD3	Biolegend	555333
CD4	Biolegend	357410
CD45	Biolegend	304006
CD8	Biolegend	344721
CellTiter-Glo	Promega	G9681
DMEM	Thermo Fisher	11965084
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
Fc-block	BD Biosciences	564220
Fluo-4	Thermo Fisher	F14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stem Cell	7912
Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26
Imaging Chamber Platform	Warner Instruments	PH-1
LD-Blue	Biolegend	L23105
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
LIVE/DEAD imaging dyes	Thermofisher	R37601
Nikon Ti microscope	Nikon		Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.
Peristaltic pump	Isamtec	ISM832C
Propidium Iodide	Invitrogen	L3224
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA