Cultura e Imagem de Cortes Extraviais de Tumor Organotípico de Pseudomixoma Peritonei Ex Vivo de Espécimes Tumorais Humanos Ressecados

Resumo

Descrevemos um protocolo para produção, cultura e visualização de cânceres humanos com metástase para as superfícies peritoneais. Os espécimes tumorais ressecados são cortados com vibratótomo e cultivados em insertos permeáveis para aumento da oxigenação e viabilidade, seguidos de análises de imagem e a jusante usando microscopia confocal e citometria de fluxo.

Resumo

O pseudomixoma peritoneal (PMP) é uma condição rara que resulta da disseminação de um tumor primário mucinoso e do consequente acúmulo de células tumorais secretoras de mucina na cavidade peritoneal. A PMF pode surgir de vários tipos de cânceres, incluindo apendicular, ovariano e colorretal, embora as neoplasias do apêndice sejam de longe a etiologia mais comum. O PMP é desafiador de estudar devido à sua (1) raridade, (2) modelos murinos limitados e (3) histologia mucinosa e acelular. O método aqui apresentado permite a visualização e interrogação em tempo real desses tipos tumorais utilizando cortes organotípicos ex vivo derivados do paciente em uma preparação onde o microambiente tumoral (TME) permanece intacto. Neste protocolo, primeiramente descrevemos o preparo de fatias tumorais utilizando um vibratomo e posterior cultura a longo prazo. Em segundo lugar, descrevemos imagens confocais de cortes tumorais e como monitorar leituras funcionais de viabilidade, imagens de cálcio e proliferação local. Em suma, as fatias são carregadas com corantes de imagem e são colocadas em uma câmara de imagem que pode ser montada em um microscópio confocal. Vídeos com lapso de tempo e imagens confocais são usados para avaliar a viabilidade inicial e a funcionalidade celular. Este procedimento também explora o movimento celular translacional e as interações de sinalização parácrina na EMT. Por fim, descrevemos um protocolo de dissociação de cortes tumorais a serem utilizados para análise por citometria de fluxo. A análise quantitativa por citometria de fluxo pode ser usada para testes terapêuticos de bancada para leito para determinar as mudanças que ocorrem na paisagem imune e no conteúdo das células epiteliais.

Introdução

O pseudomixoma peritoneal (PMP) é uma síndrome rara, com incidência de 1 por milhão de pessoas por^ano1. A maioria dos casos de PMF é causada por metástases de neoplasias do apêndice. Dado que os ratos não têm um apêndice semelhante ao humano, modelar este tipo de cancro continua a ser extremamente desafiante. Embora a doença primária seja frequentemente curável por ressecção cirúrgica, as opções de tratamento para doença metastática são limitadas. Portanto, a justificativa para o desenvolvimento deste novo modelo de fatiamento organotípico é estudar a patobiologia da PMP. Até o momento, não existem modelos organoides apendiculares que possam ser perpetuamente cultivados; entretanto, um modelo recente mostrou-se útil para o teste farmacológico de agentes terapêuticos e^{imunoterapia2}. Para tanto, adaptamos um sistema de cultura organotípica de fatias que tem sido utilizado em outros tipos de cânceres humanos, como cérebro, mama, pâncreas, pulmão, ovário, entre outros3,4,5,6.

Além das neoplasias do apêndice, a PMF ocasionalmente resulta de outros tipos de tumores, incluindo cânceres ovarianos⁷ e, em raras circunstâncias, neoplasias mucinosas papilares intraductais⁸ e câncer de cólon⁹. Além disso, esses tumores tendem a crescer lentamente, com baixas taxas de enxerto em modelos de xenoenxerto derivado do paciente (PDX)^10,11. Diante desses desafios, há uma necessidade não atendida de desenvolver modelos para estudar essa doença para começar a entender a fisiopatologia da PMP e como essas células cancerígenas são recrutadas para as superfícies peritoneais, proliferam e escapam da vigilância imunológica.

Embora cortados da circulação vascular sistêmica, os cortes tumorais contêm componentes celulares e acelulares, incluindo a matriz extracelular, células estromais, células imunes, células cancerosas, células endoteliais e nervos. Esse microambiente semi-intacto permite a investigação funcional desses tipos celulares, o que é excepcionalmente vantajoso em relação às culturas organoides 3D, que consistem apenas de células^{cancerígenas12}. Embora as culturas organotípicas de corte sejam vantajosas em alguns aspectos, elas também são inerentemente uma abordagem baseada em baixo rendimento, em comparação com organoides 3D, que podem ser expandidos e são adequados para triagem de drogas terapêuticas investigativas multiplexadas^13,14,15. No caso da PMP, não há relatos documentando o estabelecimento confiável e a passagem perpétua de organoides derivados da PMP¹⁶. Isso provavelmente se deve à natureza de crescimento lento das células tumorais derivadas do PMP, bem como ao baixo número de células epiteliais malignas encontradas dentro desses tumores mucinosos. Dada a necessidade de desenvolver modelos para estudar PMF, fatias organotípicas são especialmente adequadas para estudar esta doença. Apresentamos um protocolo para preparação, aquisição de imagens e análise de PMP de espécimes humanos.

Protocolo

A desidentificação e aquisição de todos os tecidos foram realizadas sob um protocolo aprovado pelo IRB na Universidade da Califórnia, San Diego.

1. Preparação de tecidos humanos de PMP para processamento e cultura de tecidos

1. Transporte de tecidos tumorais e microdissecção
   1. Preparar os meios de transporte e cultura: completar 10% (v/v) Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-Glutamina, 1% Penicilina/Streptomicina (Pen Strep).
   2. Após a chegada do tecido e de acordo com um protocolo institucional aprovado pelo IRB, transfira tecidos tumorais PMP para 35 placas com um diâmetro de 6 cm contendo DMEM completo.
   3. Microdissecar regiões sólidas do tumor de qualquer mucina liquefeito com bisturi. Enquanto nódulos de mucina embutidos em porções sólidas do tecido podem ser cortados, remova todas as regiões liquefeitas do tumor. Além de remover qualquer mucina liquificada, ou regiões de tecido altamente mucinoso, remova qualquer tecido que seja difícil de cortar com um bisturi. Corte os nódulos de tecido em pedaços menores, com aproximadamente 1 cm³ de tamanho.
      NOTA: A obtenção de nódulos tumorais limpos de mucina e MEC densa será essencial para o sucesso do corte com o uso de vibratome. Como controle de qualidade, o tecido tumoral que chega ao laboratório de pesquisa é primeiramente cortado por um patologista, que posteriormente é distribuído pelo biorrepositório da UCSD. Doadores de tecidos submetidos à remoção paliativa do bolo omental são casos ideais para esse protocolo, dada a alta carga de doença, o que possibilita maior produção de fatias a partir do aumento da massa de tecido disponível para pesquisa.
      CUIDADO: Trabalhar com tecidos humanos requer certificação de Nível de Biossegurança 2 (BSL2). Verifique com a instituição para treinamento sobre os procedimentos BSL2.
2. Preparação de agarose e incorporação de tecidos
   1. Preparar uma solução a 5% de agarose de baixo derretimento em PBS sem FBS no mesmo dia da chegada do tecido. Preste muita atenção à solução de agarose, pois ela tende a ferver rapidamente.
      NOTA: A agarose de baixo derretimento é essencial para incorporar peças de tecido. A agarose de alto derretimento se solidificará em temperaturas mais altas, reduzindo a viabilidade de fatias de tecido se incorporadas. Além disso, o FBS na solução de dissolução causará a formação de precipitados.
   2. Coloque os pedaços de tecido obtidos em placas de 6 cm sem líquido. Coloque não mais do que 2-3 peças por prato de 6 cm para que possam ser removidas como cubos de agarose sem perturbar ou tocar em outros tecidos.
   3. Adicione a solução líquida de agarose a 5% em pratos de 6 cm contendo os espécimes tumorais de 1 cm³ . Adicione agarose suficiente para cobrir apenas o espécime. Uma vez adicionados, coloque os lenços embutidos em um refrigerador a 4 °C por 30 min.
3. Montagem de espécimes de tecido no vibratomo
   1. Retire o ágar solidificado da geladeira e corte os cubos de agarose ligeiramente maiores que a largura do tecido usando um bisturi.
   2. Aplique super cola no estágio de vibratótomo e delicadamente coloque o cubo de agarose sobre a super cola. Deixe 1-2 min para a cola solidificar. Neste ponto, o cubo de agarose com tecido deve ser fixado ao estágio.
   3. Fixe a lâmina no vibratomo e ajuste a espessura desejada da seção de tecido. Para obter imagens a jusante ideais usando microscopia confocal, as seções devem ter aproximadamente 150 a 250 mícrons. Pressione o botão Iniciar e continue a percorrer o corte do bloco de tecido de agarose até que o tecido seja completamente cortado.
      NOTA: Se o tecido não estiver cortando, ou se deslocar do cubo de agarose, considere incorporar o tecido em uma concentração maior de agarose e apague quaisquer pedaços de tecido adicionais que possam ser muito densos para cortar ou grudar na lâmina do vibratom.
4. Corte de tecido de cultura em insertos permeáveis
   1. Preparar uma placa de inserção permeável para cultura adicionando 2 mL de meio DMEM completo acima e 3 mL abaixo da membrana permeável.
   2. Levante suavemente as fatias de tecido para fora da câmara de corte do vibratomo usando um pincel fino e coloque duas a quatro fatias em pratos de cultura permeáveis contendo meios DMEM completos. Após 24 h, aspirar o meio com pipeta e substituí-lo por meio de cultura fresco.
   3. Cultivar as fatias por até 7 dias a 37 °C/5% CO₂, substituindo o meio a cada 24 h. Neste momento, adicionar controles para morte celular (bortezomib) e quimioterapias testáveis 5-fluoruracil (5-FU) aos meios de cultura para realizar a intervenção farmacológica.
   4. Após 7 dias de cultivo, espere uma perda de viabilidade de cerca de 15%-25% em comparação com o ponto de tempo do dia 0 (imediatamente após o corte) em condições não tratadas com medicamentos (DMEM completo). Medir a viabilidade usando corantes de viabilidade vivo-mortos, como calceína AM (vivo) e iodeto de propídio (morto).

2. Imagem confocal de fatias de tecido humano vivo

NOTA: Uma vez preparados os cortes organotípicos de tumor, é essencial determinar a viabilidade tecidual para realizar uma análise eficiente e otimizada a jusante. Dado que os espécimes tumorais têm 150-250 μm de espessura, a microscopia confocal ou de dois fótons é altamente recomendada em microscópios de campo largo para determinar estudos in situ. A citometria de fluxo também pode ser usada para determinar a viabilidade e as populações celulares (os métodos estão abaixo). No entanto, a resolução espacial é perdida durante a análise por citometria de fluxo, e a viabilidade é provavelmente subestimada, dada a necessidade de dissociar os cortes tumorais por métodos mecânicos e químicos.

1. Preparação de reagentes e montagem experimental
   1. Coloque fatias tumorais para análise de imagens confocais em um único poço de uma placa de 12 poços contendo PBS com FBS a 1%. Para experimentos de imagem de cálcio, em vez de PBS, incubar as fatias em solução de cálcio extracelular preparada da seguinte forma: NaCl 125 mM, KCl 5,9 mM, CaCl₂ 2,56 mM, MgCl₂ 1 mM, HEPES 25 mM, BSA 0,1%, pH 7,4, glicose 3 mM, filtrada estéril. Preparar esta solução com antecedência e armazená-la até 1 mês a 4 °C (ver secção 2.1.8).
   2. Seguindo as concentrações e protocolos recomendados pelo fabricante, corar amostras com corantes de imagem (ver Tabela de Materiais) para determinar a viabilidade de cortes de tecido. Imagem por 10 min-1 h após a adição do corante de viabilidade.
   3. Após a incubação, transfira as fatias para uma placa de Petri com fundo de vidro opticamente transparente contendo PBS com FBS a 1% para ser usada para aquisição de imagens em um dispositivo de imagem confocal.
      OBS: Para exames de imagem confocais, foi utilizada a plataforma Nikon A1R Confocal.
   4. Abra o software de imagem confocal. Comece a criar imagens em 10x e selecione o modo de geração de imagens XYZ. Em seguida, defina as configurações de aquisição da seguinte maneira.
      1. Ligue os seguintes lasers: 488 nm e 561 nm. Ajuste o ganho para 100 com potência do laser a 1%. Ajuste a potência do laser e ganhe conforme necessário durante a aquisição da imagem. Dependendo da qualidade de imagem desejada, selecione 512 x 512 pixels ou 1024 x 1024 pixels para maior resolução.
   5. Selecione Remover intertravamento e, em seguida, selecione Fazer varredura para iniciar a geração de imagens.
   6. Para imagens de cálcio, incubar fatias de tecido com Fluo-4-AM por 1 h protegido da luz. Siga o protocolo do fabricante para dissolver o Fluo-4-AM em DMSO. Após 1 h, lavar fatias 3x com solução de cálcio extracelular e seguir o protocolo de imagem nas etapas 2.1.4-2.1.5.
   7. Para experimentos de imagem de cálcio usando Fluo-4-AM, selecione XYZT e desmarque o laser de 561 nm para aumentar a velocidade de aquisição. Além disso, use o scanner de ressonância para aumentar ainda mais a velocidade da geração de imagens.

3. Dissociação de fatias vivas para citometria de fluxo

NOTA: A dissociação de fatias de tecido vivo pode ser usada para várias aplicações a jusante, incluindo imunotipagem, avaliação da viabilidade e interrogação das mudanças nas populações celulares após intervenção farmacológica. Devem ser tomadas medidas para garantir que a qualidade do tecido e a viabilidade celular sejam mantidas durante o processo de dissociação.

1. Cortar um pequeno pedaço da extremidade de uma ponta de pipeta de 1 mL para ampliar a abertura para permitir uma dissociação mecânica vigorosa por pipetagem por 1 min.
2. Incubar fatias a 37 °C com rotação por 5-15 min em 1 mL de tampão de digestão composto por DMEM com alto teor de glicose, 10% de colagenase/hialuronidase suave (GCH), 10% de SFB e 10% de DNaseI (estoque de 1 mg/mL).
   NOTA: Alterações dependentes de lote de colagenase/hialuronidase são frequentemente encontradas.
3. Realizar ruptura vigorosa do tecido usando dissociação mecânica 2-3 vezes durante a incubação. Certifique-se de verificar a digestão, por olho, a cada 5 minutos para evidências de digestão completa. Se necessário, interromper a digestão enzimática prosseguindo para o passo 3.1.4.
4. Uma vez digeridos, pipetar as fatias e o meio de digestão em cima de um filtro de 70 μm colocado sobre um tubo cônico de 50 mL. Escolha peças maiores usando pinças estéreis ou uma pipeta.
5. Usando a extremidade traseira romba de uma seringa plástica de 5 mL, amasse quaisquer fatias maiores não dissociadas e lave com 4 mL de PBS contendo FBS a 2%.
6. Tomar o sobrenadante celular dissociado em um tubo cônico de 50 mL e girar a 300 x g por 5-10 min. Retire o sobrenadante e lave o pellet com 1 mL de PBS contendo FBS a 2%.
7. Para preparar a amostra para citometria de fluxo, adicionar o tampão de bloqueio contendo 50 μL de bloqueio Fc humano e deixar à temperatura ambiente por 15 min. Realizar coloração extracelular utilizando os respectivos anticorpos em 50 μL de PBS contendo SFB a 2%.
   NOTA: Existem muitos sistemas de citometria de fluxo. Uma vez preparada a amostra para citometria de fluxo, consulte o protocolo do fabricante para operação do dispositivo.

4. Intervenção farmacológica utilizando cortes de tecidos vivos para análise de viabilidade e proliferação

NOTA: Uma vez que os cortes de tumor organotípicos tenham sido preparados, as abordagens intervencionistas podem ser realizadas usando vários métodos, incluindo testes de drogas, siRNA, bem como infecção viral de fatias de tecido vivo. Aqui discutiremos testes de drogas, bem como leituras funcionais a jusante, que incluem análise de viabilidade usando proliferação local.

1. Preparar 10 mL de DMEM completo 10% v/v com FBS 10%, 2 mM L-Glutamina, 1% Pen Strep.
2. Alíquota 5 mL de meio completo para condições de controle e tratamento. Aos 5 mL restantes de meio, adicionar bortezomib (2 μM) para induzir morte celular em cortes tumorais como controle positivo.
   NOTA: O bortezomib, em altas concentrações, é uma droga citotóxica que induz a morte celular. As demais drogas citotóxicas podem ser utilizadas como controle positivo para morte celular.
3. Usando duas a quatro fatias de tecido, que foram plaqueadas nas placas permeáveis, adicione o meio preparado na etapa 4.2 ao prato, bem como quaisquer terapias combinadas adicionais a serem usadas para análise de viabilidade LIVE/DEAD a jusante usando microscopia confocal, conforme descrito na etapa 2.1.2, ou use uma análise de viabilidade luminescente comercial usando fatias sequencialmente combinadas.
   NOTA: A correspondência de fatias sequenciais é essencial para a análise de viabilidade luminescente, uma vez que o ensaio de viabilidade luminescente depende do conteúdo de ATP celular. Como os controles internos são perdidos durante a lise celular, fatias de tamanho semelhante são necessárias, pois os resultados dependem do número inicial de células viáveis (ou seja, fatias desbalanceadas resultarão em resultados desbalanceados). Se o usuário não obtiver cortes sequenciais, a análise de viabilidade luminescente não é possível e, como tal, outro método de avaliação de viabilidade será necessário (citometria de fluxo ou análise de células vivas baseada em imagens confocais).
4. Deixar fatias de tecido em cultura contendo DMEM completo por 2-5 dias, trocando de meio, bem como bortezomib e 5-FU a cada dois dias.
5. Para análise de viabilidade luminescente, adicione 500 μL de PBS em uma placa de 12 poços e transfira as fatias de tecido sequencialmente combinadas para a solução de PBS usando um pincel ou use a sucção de uma pipeta de 1 mL suavemente para transferi-las.
6. Remova o PBS e adicione a solução de análise de viabilidade luminescente que foi preparada. Consulte o manual de instruções para preparação do reagente.
7. Adicionar 500 μL da solução de viabilidade luminescente por condição e incubar com uma rotação lenta no agitador à temperatura ambiente durante 30 minutos. Leia a luminescência usando um leitor de placas de luminescência.

Resultados

Em suma, espécimes tumorais humanos de PMP são obtidos sob um protocolo aprovado pelo IRB. O tecido é preparado, microdissecado e solidificado em molde de agarose para ser cortado com vibratomo (Figura 1A; Vídeo 1). Uma vez cortados, os cortes de tecido são colocados e cultivados em membranas de inserção permeável (Figura 1B), que podem ser utilizadas para exames de imagem in situ, bem como para interrogação celular e funciona...

Discussão

Este manuscrito descreve uma técnica que pode ser usada para cultura, interrogação e análise de espécimes tumorais de pseudomixoma peritoneal humano (PMP). Utilizamos numerosos ensaios funcionais a jusante para interrogar o microambiente imune do tumor e uma plataforma para testes de bancada para leito.

Embora o método seja altamente eficiente em nossas mãos, será necessária alguma prática para cortar espécimes tumorais usando um vibratome. Ou seja, encontramos problemas que foram d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
100 micron filter	ThermoFisher	22-363-549
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
3 M KCl solution	Sigma	60135
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
ATPγS	Tocris	4080
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Calcein-AM	Invitrogen	L3224
CD11b	Biolegend	101228
CD206	Biolegend	321140
CD3	Biolegend	555333
CD4	Biolegend	357410
CD45	Biolegend	304006
CD8	Biolegend	344721
CellTiter-Glo	Promega	G9681
DMEM	Thermo Fisher	11965084
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
Fc-block	BD Biosciences	564220
Fluo-4	Thermo Fisher	F14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stem Cell	7912
Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26
Imaging Chamber Platform	Warner Instruments	PH-1
LD-Blue	Biolegend	L23105
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
LIVE/DEAD imaging dyes	Thermofisher	R37601
Nikon Ti microscope	Nikon		Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.
Peristaltic pump	Isamtec	ISM832C
Propidium Iodide	Invitrogen	L3224
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA