Культура и визуализация органотипических срезов опухоли псевдомиксомы брюшины ex vivo из резецированных образцов опухолей человека

Резюме

Мы описываем протокол производства, культивирования и визуализации рака человека, который метастазировал на поверхности брюшины. Резецированные образцы опухоли разрезают с помощью вибратома и культивируют на проницаемых вставках для повышения оксигенации и жизнеспособности, после чего следует визуализация и последующий анализ с использованием конфокальной микроскопии и проточной цитометрии.

Аннотация

Псевдомиксома брюшины (ПМП) является редким заболеванием, которое возникает в результате распространения муцинозной первичной опухоли и, как следствие, накопления муцин-секретирующих опухолевых клеток в брюшной полости. ПМП может возникать при различных типах рака, включая аппендикулярный, яичниковый и колоректальный, хотя аппендикулярные новообразования на сегодняшний день являются наиболее распространенной этиологией. PMP сложно изучать из-за его (1) редкости, (2) ограниченных мышиных моделей и (3) муцинозной бесклеточной гистологии. Представленный здесь метод позволяет в режиме реального времени визуализировать и опрашивать эти типы опухолей с использованием органотипических срезов, полученных пациентом ex vivo , в препарате, где микроокружение опухоли (TME) остается нетронутым. В этом протоколе мы сначала описываем приготовление опухолевых срезов с использованием вибратома и последующего длительного посева. Во-вторых, мы описываем конфокальную визуализацию опухолевых срезов и способы мониторинга функциональных показаний жизнеспособности, визуализации кальция и локальной пролиферации. Короче говоря, срезы загружаются красителями для визуализации и помещаются в камеру визуализации, которая может быть установлена на конфокальный микроскоп. Покадровое видео и конфокальные изображения используются для оценки первоначальной жизнеспособности и клеточной функциональности. Эта процедура также исследует трансляционное клеточное движение и паракринные сигнальные взаимодействия в TME. Наконец, мы описываем протокол диссоциации опухолевых срезов, который будет использоваться для анализа проточной цитометрии. Количественный анализ проточной цитометрии может быть использован для терапевтического тестирования от скамьи до постели больного для определения изменений, происходящих в иммунном ландшафте и содержании эпителиальных клеток.

Введение

Псевдомиксома брюшины (ПМП) является редким синдромом с частотой заболеваемости 1 на миллион человек в год¹. Большинство случаев ПМП вызвано метастазами из аппендикулярных новообразований. Учитывая, что у мышей нет аппендикса, похожего на человеческий, моделирование этого типа рака остается чрезвычайно сложной задачей. В то время как первичное заболевание часто излечивается хирургической резекцией, варианты лечения метастатического заболевания ограничены. Таким образом, обоснование разработки этой новой органотипической модели среза заключается в изучении патобиологии PMP. На сегодняшний день не существует аппендикулярных моделей органоидов, ко....

протокол

Деидентификация и приобретение всех тканей были выполнены в соответствии с протоколом, одобренным IRB в Калифорнийском университете в Сан-Диего.

1. Подготовка тканей ПМП человека к тканевой обработке и культивированию

1. Транспорт опухолевых тканей и микродиссекция
   1. Подготовьте транспортную и культуральную среду: 10% (об./об.) модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM), 10% FBS, 2 мМ L-глютамина, 1% пенициллина/стрептомицина (Pen-стрептококк).
   2. По прибытии ткани и в соответствии с протоколом, одобренным IRB, перенесите опухолевые ткани PMP в 35 чашек диаметром 6 см, содержащих полный DMEM.
   ....

Результаты

Короче говоря, образцы опухолей человека из PMP получают в соответствии с протоколом, одобренным IRB. Ткань подготавливают, микропрепарируют и затвердевают в агарозной форме для разрезания с помощью вибратома (рис. 1А; Видео 1). После разрезания срезы ткани помещаю?.......

Обсуждение

В этой рукописи описывается метод, который может быть использован для культивирования, опроса и анализа образцов опухолей псевдомиксомы брюшины человека (ПМП). Мы использовали многочисленные последующие функциональные анализы для опроса иммунного микроокружения опухоли и платформу .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
100 micron filter	ThermoFisher	22-363-549
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
3 M KCl solution	Sigma	60135
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
ATPγS	Tocris	4080
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Calcein-AM	Invitrogen	L3224
CD11b	Biolegend	101228
CD206	Biolegend	321140
CD3	Biolegend	555333
CD4	Biolegend	357410
CD45	Biolegend	304006
CD8	Biolegend	344721
CellTiter-Glo	Promega	G9681
DMEM	Thermo Fisher	11965084
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
Fc-block	BD Biosciences	564220
Fluo-4	Thermo Fisher	F14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stem Cell	7912
Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26
Imaging Chamber Platform	Warner Instruments	PH-1
LD-Blue	Biolegend	L23105
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
LIVE/DEAD imaging dyes	Thermofisher	R37601
Nikon Ti microscope	Nikon		Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.
Peristaltic pump	Isamtec	ISM832C
Propidium Iodide	Invitrogen	L3224
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA