JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم أربع طرق لتقييم الأنشطة المضادة للميكروبات للجسيمات النانوية والأسطح ذات البنية النانوية باستخدام تقنيات المختبر . يمكن تكييف هذه الطرق لدراسة تفاعلات الجسيمات النانوية المختلفة والأسطح ذات البنية النانوية مع مجموعة واسعة من الأنواع الميكروبية.

Abstract

تم استكشاف الأنشطة المضادة للميكروبات للجسيمات النانوية والأسطح ذات البنية النانوية ، مثل الفضة وأكسيد الزنك وثاني أكسيد التيتانيوم وأكسيد المغنيسيوم ، سابقا في البيئات السريرية والبيئية وفي المنتجات الغذائية الاستهلاكية. ومع ذلك ، فإن عدم الاتساق في الأساليب والمواد التجريبية المستخدمة قد بلغ ذروته في نتائج متضاربة ، حتى بين الدراسات لنفس أنواع البنية النانوية والأنواع البكتيرية. بالنسبة للباحثين الذين يرغبون في استخدام الهياكل النانوية كمادة مضافة أو طلاء في تصميم المنتج ، فإن هذه البيانات المتضاربة تحد من استخدامها في البيئات السريرية.

لمواجهة هذه المعضلة ، نقدم في هذه المقالة أربع طرق مختلفة لتحديد الأنشطة المضادة للميكروبات للجسيمات النانوية والأسطح ذات البنية النانوية ، ومناقشة قابليتها للتطبيق في سيناريوهات مختلفة. من المتوقع أن يؤدي تكييف الأساليب المتسقة إلى بيانات قابلة للتكرار يمكن مقارنتها عبر الدراسات وتنفيذها لأنواع مختلفة من البنية النانوية والأنواع الميكروبية. نقدم طريقتين لتحديد الأنشطة المضادة للميكروبات للجسيمات النانوية وطريقتين للأنشطة المضادة للميكروبات للأسطح ذات البنية النانوية.

بالنسبة للجسيمات النانوية ، يمكن استخدام طريقة الاستزراع المشترك المباشر لتحديد الحد الأدنى من تركيزات الجسيمات النانوية المثبطة والحد الأدنى للجراثيم ، ويمكن استخدام طريقة ثقافة التعرض المباشر لتقييم نشاط الجراثيم في الوقت الفعلي مقابل نشاط مبيد للجراثيم الناتج عن التعرض للجسيمات النانوية. بالنسبة للأسطح ذات البنية النانوية ، يتم استخدام طريقة الاستزراع المباشر لتحديد صلاحية البكتيريا بشكل غير مباشر ومباشر على اتصال مع الأسطح ذات البنية النانوية ، وتستخدم طريقة التعرض للتلامس المركز لفحص النشاط المضاد للميكروبات في منطقة معينة من سطح نانوي. نناقش المتغيرات التجريبية الرئيسية التي يجب مراعاتها في تصميم الدراسة في المختبر عند تحديد الخصائص المضادة للميكروبات للجسيمات النانوية والأسطح ذات البنية النانوية. كل هذه الطرق منخفضة التكلفة نسبيا ، وتستخدم تقنيات يسهل إتقانها نسبيا وتكرارها من أجل الاتساق ، وتنطبق على مجموعة واسعة من أنواع البنية النانوية والأنواع الميكروبية.

Introduction

في الولايات المتحدة وحدها ، يصاب 1.7 مليون شخص بعدوى مكتسبة من المستشفى (HAI) سنويا ، مع واحد من كل 17 من هذه العدوى يؤدي إلى الوفاة1. بالإضافة إلى ذلك ، تشير التقديرات إلى أن تكاليف علاج HAIs تتراوح من 28 مليار دولار إلى 45 مليار دولار سنويا 1,2. تسود هذه المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA)3,4 و Pseudomonas aeruginosa4 ، والتي عادة ما يتم عزلها عن التهابات الجروح المزمنة وعادة ما تتطلب علاجا مكثفا ووقتا لإنتاج نتيجة إيجابية للمريض.

على مدى العقود العديدة الماضية ، تم تطوير فئات متعددة من المضادات الحيوية لعلاج الالتهابات المتعلقة بهذه البكتيريا المسببة للأمراض وغيرها. على سبيل المثال ، تم استخدام نظائر ريفاميسين لعلاج MRSA ، وغيرها من الالتهابات إيجابية الجرام وسالبة الجرام ، وعدوى المتفطرة النيابة. 5. في تسعينيات القرن العشرين ، لعلاج فعال لعدد متزايد من عدوى السل M. ، تم الجمع بين أدوية إضافية مع نظائر ريفاميسين لزيادة فعاليتها. ومع ذلك، فإن ما يقرب من 5٪ من حالات المتفطرة السلية لا تزال مقاومةللريفامبيسين5،6، وهناك قلق متزايد بشأن البكتيريا المقاومة للأدويةالمتعددة 7. في الوقت الحالي ، قد لا يكون استخدام المضادات الحيوية وحدها كافيا في علاج HAIs ، وقد أثار هذا بحثا مستمرا عن علاجات بديلة مضادة للميكروبات1.

تم فحص المعادن الثقيلة ، مثل الفضة (Ag) 8،9،10 والذهب (Au) 11 ، والسيراميك ، مثل ثاني أكسيد التيتانيوم (TiO 2) 12 وأكسيد الزنك (ZnO) 13 ، في شكل جسيمات نانوية (NP) (AgNP و AuNP و TiO2 NP و ZnONP ، على التوالي) لأنشطتها المضادة للميكروبات وتم تحديدها كبدائل محتملة للمضادات الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، المواد القابلة للامتصاص الحيوي ، مثل سبائك المغنيسيوم (سبائك المغنيسيوم)14،15،16 ، جسيمات أكسيد المغنيسيوم النانوية17،18،19،20،21 ، وجسيمات هيدروكسيد المغنيسيوم النانوية [nMgO و nMg (OH) 2 ، على التوالي] 22،23،24، كما تم فحصها. ومع ذلك ، فإن الدراسات السابقة المضادة للميكروبات للجسيمات النانوية استخدمت مواد وطرق بحث غير متسقة ، مما أدى إلى بيانات يصعب أو يستحيل مقارنتها وأحيانا تكون متناقضة في الطبيعة18,19. على سبيل المثال ، اختلف الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) والحد الأدنى لتركيز مبيد الجراثيم (MBC) لجسيمات الفضة النانوية بشكل كبير في دراسات مختلفة. قام Ipe et al.25 بتقييم الأنشطة المضادة للبكتيريا ل AgNPs بمتوسط حجم جسيم ~ 26 نانومتر لتحديد MICs ضد البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام. وكانت البلدان المتوسطة الدخل المحددة ل P. aeruginosa و E. coli و S. aureus و MRSA 2 ميكروغرام / مل و 5 ميكروغرام / مل و 10 ميكروغرام / مل و 10 ميكروغرام / مل ، على التوالي. في المقابل ، قام Parvekar et al.26 بتقييم AgNPs بمتوسط حجم جسيم يبلغ 5 نانومتر. في هذه الحالة ، تم العثور على AgNP MIC و MBC من 0.625 ملغ / مل لتكون فعالة ضد S. aureus. بالإضافة إلى ذلك ، قام Loo et al.27 بتقييم AgNPs بحجم 4.06 نانومتر. عندما تعرضت الإشريكية القولونية لهذه الجسيمات النانوية ، تم الإبلاغ عن MIC و MBC عند 7.8 ميكروغرام / مل. أخيرا ، قام Ali et al.28 بالتحقيق في الخصائص المضادة للبكتيريا ل AgNPs الكروية بمتوسط حجم 18 نانومتر. عندما تعرضت P. aeruginosa و E. coli و MRSA لهذه الجسيمات النانوية ، تم تحديد MIC عند 27 ميكروغرام / مل ، و 36 ميكروغرام / مل ، و 27 ميكروغرام / مل ، و 36 ميكروغرام / مل ، على التوالي ، وتم تحديد MBC عند 36 ميكروغرام / مل ، و 42 ميكروغرام / مل ، و 30 ميكروغرام / مل ، على التوالي.

على الرغم من أن النشاط المضاد للبكتيريا للجسيمات النانوية قد تمت دراسته والإبلاغ عنه على نطاق واسع خلال العقود الأخيرة ، إلا أنه لا يوجد معيار للمواد وطرق البحث المستخدمة للسماح بإجراء مقارنات مباشرة عبر الدراسات. لهذا السبب ، نقدم طريقتين ، طريقة الزراعة المشتركة المباشرة (الطريقة أ) ، وطريقة التعرض المباشر (الطريقة ب) ، لتوصيف ومقارنة الأنشطة المضادة للميكروبات للجسيمات النانوية مع الحفاظ على اتساق المواد والطرق.

بالإضافة إلى الجسيمات النانوية ، تم أيضا فحص الأسطح ذات البنية النانوية بحثا عن الأنشطة المضادة للبكتيريا. وتشمل هذه المواد القائمة على الكربون ، مثل صفائح الجرافين النانوية ، والأنابيب النانوية الكربونية ، والجرافيت29 ، بالإضافة إلى سبائك المغنيسيوم والمغنيسيوم النقية. أظهرت كل من هذه المواد آلية واحدة على الأقل مضادة للبكتيريا ، بما في ذلك الضرر المادي المفروض على أغشية الخلايا بواسطة المواد القائمة على الكربون والأضرار التي لحقت بعمليات التمثيل الغذائي أو الحمض النووي من خلال إطلاق أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) عندما يتحلل المغنيسيوم. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يتم الجمع بين الزنك (Zn) والكالسيوم (Ca) في تكوين سبائك المغنيسيوم ، يتم تحسين صقل حجم حبيبات مصفوفة Mg ، مما يؤدي إلى تقليل الالتصاق البكتيريا بأسطح الركيزة مقارنة بعينات Mg فقط14. لإثبات النشاط المضاد للبكتيريا ، نقدم طريقة الاستزراع المباشر (الطريقة C) ، والتي تحدد الالتصاق البكتيري على المواد ذات البنية النانوية وحولها بمرور الوقت من خلال القياس الكمي لوحدات تشكيل المستعمرات البكتيرية (CFUs) مع ملامسة السطح المباشرة وغير المباشرة.

يمكن أن تؤثر هندسة الهياكل النانوية على الأسطح ، بما في ذلك الحجم والشكل والاتجاه ، على أنشطة المواد المبيدة للجراثيم. على سبيل المثال ، قام Lin et al.16 بتصنيع طبقات MgO مختلفة ذات بنية نانوية على أسطح ركائز Mg من خلال الأنودة والترسيب الكهربائي (EPD). بعد فترة من التعرض للسطح النانوي في المختبر ، انخفض نمو S. aureus بشكل كبير مقارنة بالمغنيسيوم غير المعالج. يشير هذا إلى قوة أكبر للسطح ذو البنية النانوية ضد الالتصاق البكتيري مقابل سطح Mg المعدني غير المعالج. للكشف عن الآليات المختلفة للخصائص المضادة للبكتيريا لمختلف الأسطح ذات البنية النانوية ، تتم مناقشة طريقة التعرض للتلامس المركز (الطريقة D) التي تحدد تفاعلات سطح الخلية داخل منطقة الاهتمام في هذه المقالة.

الهدف من هذه المقالة هو تقديم أربع طرق في المختبر تنطبق على الجسيمات النانوية المختلفة والأسطح ذات البنية النانوية والأنواع الميكروبية. نناقش الاعتبارات الرئيسية لكل طريقة لإنتاج بيانات متسقة وقابلة للتكرار من أجل المقارنة. على وجه التحديد ، يتم استخدام طريقة الزراعة المشتركة المباشرة17 وطريقة التعرض المباشر لفحص الخصائص المضادة للميكروبات للجسيمات النانوية. من خلال طريقة الاستزراع المشترك المباشر ، يمكن تحديد الحد الأدنى من التركيزات المثبطة والحد الأدنى من الجراثيم (MIC و MBC90-99.99 ، على التوالي) للأنواع الفردية ، ويمكن تحديد التركيز الأكثر فعالية (MPC) لأنواع متعددة. من خلال طريقة التعرض المباشر ، يمكن تمييز التأثيرات البكتيرية أو المبيدة للجراثيم للجسيمات النانوية عند الحد الأدنى من التركيزات المثبطة بقراءات الكثافة البصرية في الوقت الفعلي بمرور الوقت. طريقة الاستزراعالمباشر 14 مناسبة لفحص البكتيريا الملامسة بشكل مباشر وغير مباشر للأسطح ذات البنية النانوية. أخيرا ، يتم تقديم طريقة التعرض للتلامسالمركز 16 لفحص النشاط المضاد للبكتيريا لمنطقة معينة على سطح ذو بنية نانوية من خلال التطبيق المباشر للبكتيريا وتوصيف نمو البكتيريا في واجهة البنية النانوية الخلوية. تم تعديل هذه الطريقة من المعيار الصناعي الياباني JIS Z 2801: 200016 ، وتهدف إلى التركيز على تفاعلات سطح الميكروب واستبعاد آثار تحلل العينات السائبة في الثقافة الميكروبية على الأنشطة المضادة للميكروبات.

Protocol

لتقديم الثقافة المشتركة المباشرة وطرق التعرض المباشر ، نستخدم جسيمات أكسيد المغنيسيوم النانوية (nMgO) كمادة نموذجية لإظهار التفاعلات البكتيرية. لتقديم الثقافة المباشرة وطرق التعرض للتلامس المركز ، نستخدم سبيكة Mg مع أسطح ذات بنية نانوية كأمثلة.

1. تعقيم المواد النانوية

ملاحظة: يجب تعقيم جميع المواد النانوية أو تطهيرها قبل الزراعة الميكروبية. تشمل الطرق التي يمكن استخدامها الحرارة والضغط والإشعاع والمطهرات ، ولكن يجب تحديد تحمل المواد لكل طريقة قبل التجارب في المختبر .

  1. الجسيمات النانوية
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات في مذيب عضوي مثل الإيثانول أو تعبئتها في طبق أو صندوق متبوعا بالتعقيم أو التطهير بطريقة مناسبة. تم تعقيم الجسيمات النانوية باستخدام الطريقة التالية لتوضيح طريقة الاستزراع المشتركالمباشر 17 وطريقة التعرض المباشر.
    1. تعقيم جسيمات MgO النانوية في فرن حراري 200 درجة مئوية30 لمدة 60 دقيقة قبل كل تجربة في المختبر .
      ملاحظة: تم اختيار هذه الطريقة لأن بخار الماء والأشعة فوق البنفسجية قد يؤثران على هياكل جسيمات MgO النانوية (nMgO)17.
  2. المواد السائبة
    ملاحظة: تم تعقيم المواد ذات البنية النانوية بالطريقة التالية لتوضيح طريقة الاستزراع المباشر.
    1. بالنسبة لطريقة الاستزراع المباشر14 ، قم بتطهير عينات ZC21 و Mg و T64 المحضرة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 4 ساعات قبل بدء الدراسات في المختبر .
    2. بالنسبة لطريقة التعرض للتلامس المركز16 ، قم بتطهير جميع العينات باستخدام الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 ساعة قبل بدء الدراسات في المختبر .
  3. بدلا من ذلك ، استخدم أكسيد الإيثيلين (EtO) لتعقيم المواد الحساسة للحرارة.

2. طريقة الاستزراع المشترك المباشر (الطريقة أ)

ملاحظة: في الطريقة أ ، يتم خلط البكتيريا في مزرعة البذر في مرحلة التأخر مباشرة مع الجسيمات النانوية بتركيزات معينة. لفحص الأنشطة المضادة للميكروبات للجسيمات النانوية ، نتبع بروتوكولا وصفه Nguyen et al.17.

  1. توصيف الجسيمات النانوية والهياكل النانوية
    ملاحظة: تم تأكيد تكوين البنية النانوية وشكلها باستخدام حيود مسحوق الأشعة السينية.
    1. قياس الجسيمات النانوية
      1. وزن الجسيمات النانوية بمعدل 9 أضعاف الكتلة المطلوبة لكل مل لاستيعاب 3 عينات مل في ثلاث نسخ. على سبيل المثال ، تزن 0.2 مجم / مل nMgO عند 1.8 مجم / مل.
        ملاحظة: هذا يضمن التوزيع المتسق للجسيمات النانوية في الثقافات البكتيرية والمرق.
      2. قم بقياس جميع الجسيمات النانوية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 5.0 مل تم وزنه مسبقا وقطره باستخدام ميزان تحليلي.
  2. تحضير وزراعة مزارع البكتيريا
    1. لكل تجربة في المختبر ، استرجع مخزون خلايا البكتيريا من التخزين عند -80 درجة مئوية. أضف 10 ميكرولتر من كل مخزون خلية بكتيرية إلى 5 مل من وسط نمو مناسب.
    2. ضع الوسط الملقح في شاكر حاضنة عند 37 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة تقريبا طوال الليل.
      1. إذا نمت أنواع المكورات العنقودية ، يتم الاستزراع الفرعي عن طريق وضع 400 ميكرولتر من كل مزرعة ليلية في 20 مل من وسط النمو الطازج (100 ميكرولتر / 5 مل متوسط) واحتضانها بالاهتزاز عند 37 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة لمدة 4-6 ساعات إضافية.
  3. غسل وعد خلايا البكتيريا لتحديد كثافة البذر
    ملاحظة: تم تحديد كثافة البذر المرغوبة البالغة 7.8 × 106 CFU / mL على أنها رقم الخلية أكبر مما هو مطلوب لتأكيد عدوى المسالك البولية.
    1. اجمع البكتيريا المستزرعة عن طريق إدخال 1 مل من زراعة البكتيريا الليلية في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل. قم بإنشاء أعداد كافية من الحصصات من المزارع البكتيرية الليلية وطردها مركزيا لمدة 10 دقائق عند 1956 × جم للوصول إلى كثافة البذر المطلوبة.
    2. بعد الطرد المركزي ، ماصة لإزالة المادة الطافية من الخلايا المحببة ووضع المادة الطافية في وعاء تجميع. أعد تعليق كريات الخلية في 0.5 مل من وسط النمو الطازج. اجمع بين تعليقين سعة 0.5 مل لإنشاء 1 مل من المعلق لتقليل عدد حصص 1 مل من الخلايا المعاد تعليقها إلى ستة. كرر الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1956 × جم.
    3. أكمل دورة الغسيل الثانية باستخدام وسط نمو جديد ، كما في الخطوة 2.3.2 ، لتقليل عدد 1 مل من حصص الخلايا المغسولة المعاد تعليقها إلى ثلاثة.
    4. أكمل الدورة الثالثة ، كما في الخطوة 2.3.2 ، باستثناء إعادة تعليق كريات الخلية في 0.33 مل من محلول Tris (هيدروكسي ميثيل) أمين الميثان العازل (Tris buffer ، الرقم الهيدروجيني 8.5). اجمع بين المعلقات الثلاثة ، كل منها بحجم 0.33 مل ، في جهاز طرد مركزي صغير واحد سعة 1.5 مل. كرر الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1956 × جم.
      ملاحظة: لا يحتوي المخزن المؤقت Tris على أيونات Mg 2+ أو Ca2+ 31. هذا مهم لاستخدام مطياف الانبعاث البصري للبلازما المقترن بالحث (ICP-OES) لقياس أيونات Mg 2+ و Ca2+ في مرق ما بعد الاستزراع. في المقابل ، فإن الفوسفات الموجود في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 32 ، على سبيل المثال ، يعزل أيونات Mg 2+ أو Ca2+ 33،34،35 ويسبب ارتباكا في تفسير بيانات ICP-OES.
    5. إزالة طاف من الخلايا المحببة. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من محلول Tris الطازج ، والمعروف باسم تعليق الخلية - ثقافة البذر البكتيري في مرحلة التأخر.
    6. حدد تركيز تعليق الخلية (الخلايا / مل) باستخدام مقياس الدم.
  4. إنشاء ثقافة بكتيريا البذر
    ملاحظة: يبلغ الحجم الإجمالي للعينة 3 مل ويتم إكمالها في ثلاث نسخ (إجمالي 9 مل).
    1. تحديد الحجم الكلي لثقافة بذر البكتيريا اللازمة. لإنشاء مزرعة البذر ، استخدم C 1V1 = C 2 V2لحساب حجم تعليق الخلية اللازم لإنشاء مزرعة بذر تبلغ 7.8 × 106 خلايا / مل. أضف الحجم المحسوب لتعليق الخلية (V1) إلى الحجم المطلوب لوسائط النمو (V2).
    2. تحديد كثافة بذر البكتيريا الفعلية في CFU / mL. إنشاء تخفيف تسلسلي عشرة أضعاف إلى 10-4. انشر لوحة التخفيف 10-4 على أجار النمو المناسب واحتضانها بين عشية وضحاها. بعد الحضانة ، احسب عدد المستعمرات ، واحسب CFU / mL.
  5. تشكيل البكتيريا ومزارع الجسيمات النانوية
    1. في ألواح البوليسترين غير المعالجة بالأنسجة المكونة من 12 بئرا ، قسمة 2 مل من مزرعة البذر البكتيرية في كل بئر لعدد الآبار المطلوبة.
    2. لكل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 5 مل يحتوي على nMgO مسبق الوزن ، أضف 3 مل من مزرعة البذر البكتيرية. دوامة لفترة وجيزة لخلط nMgO مع البكتيريا. قسمة 1 مل من الخليط في ثلاثة آبار منفصلة لإنشاء عينات ثلاثية لكل وزن تم قياسه مسبقا من nMgO. ماصة خليط البكتيريا / nMgO 2-3x قبل كل 1 مل من القسمة للحفاظ على nMgO في التعليق.
      ملاحظة: ستتألف عينات التحكم من 3 مل من الخلايا فقط ، و 3 مل من الوسائط فقط ، و 3 مل تحتوي على أدنى وأعلى تركيزات الجسيمات النانوية المستخدمة. وقد أعدت هذه التوصيات كما في الخطوة 2-5-2. يتم الانتهاء من جميع عينات التحكم في ثلاث نسخ.
    3. احتضان جميع لوحات 12 بئرا عند 37 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
  6. تحديد نمو الخلايا البكتيرية بعد التعرض ل nMgO
    1. بعد حضانة الثقافات البكتيرية طوال الليل ، اجمع كل عينة سعة 3 مل عن طريق السحب في أنبوب مخروطي فردي سعة 15 مل.
    2. استخدم لوحة 96 بئرا لإنشاء تخفيفات تسلسلية 1:10. حدد عدد الأعمدة اللازمة لتخفيف جميع العينات التي تحتوي على البكتيريا بشكل متسلسل. أضف 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris إلى كل بئر في الصف B إلى الصف G للعدد المناسب من الأعمدة.
    3. دوامة لفترة وجيزة كل أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على عينات بكتيرية ، وأضف 50 ميكرولتر إلى بئر فردي في الصف A.
    4. لكل بئر في الصف A ، انقل 20 ميكرولتر إلى الصف B (على سبيل المثال ، A1 إلى B1) ، واخلطه لفترة وجيزة عن طريق السحب للحصول على حجم 200 ميكرولتر. باستخدام طرف ماصة معقم ، انقل 20 ميكرولتر من البئر في الصف B إلى البئر في الصف C. استمر في هذا النمط حتى يحتوي البئر في الصف G على 200 ميكرولتر ، إكمال التخفيف التسلسلي من 10−1 في الصف B إلى 10−6 في الصف G.
    5. ماصة 100 ميكرولتر من كل بئر على صفيحة أجار نمو مناسبة وتنتشر عبر اللوحة لتفريق ثقافة الخلية. ضع الأطباق في شاكر حاضنة طوال الليل عند 37 درجة مئوية. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    6. فحص لوحات وحساب تلك التي لديها ما يقرب من 25-300 مستعمرة. إذا أمكن ، اختر لوحات من نفس قيمة التخفيف. استخدم عدد المستعمرات لكل لوحة لحساب CFU / mL.
  7. تقييم درجة الحموضة بعد الحضانة
    ملاحظة: اتبع تعليمات الشركة المصنعة لكل طراز من طرازات مقياس الأس الهيدروجيني.
    1. قم بالمعايرة المسبقة لمقياس الأس الهيدروجيني باستخدام محاليل توحيد الأس الهيدروجيني 4 والأس الهيدروجيني 7 والأس الهيدروجيني 10. اقرأ كل عينة بكتيرية عن طريق وضع مسبار الأس الهيدروجيني في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  8. إعداد عينات لبرنامج المقارنات الدولية - مكتب خدمات المقارنات الدولية
    ملاحظة: يستخدم ICP-OES لتحديد تركيز أيونات Mg 2+ و Ca2+. تعتبر هذه الكاتيونات مهمة ، حيث يشارك كل منها في عملية التمثيل الغذائي الخلوي.
    1. جهاز طرد مركزي كل أنبوب مخروطي سعة 15 مل تم تحضيره في الخطوة 2.6.1 لمدة 5 دقائق عند 5724 × جم لتكسير الحطام الخلوي والجسيمات النانوية.
    2. باستخدام أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، قم بتخفيف 30 ميكرولتر من المادة الطافية إلى 2.97 مل من 18.2 Ω من الماء المصفى لإنشاء تخفيف 1: 100.
      ملاحظة: يمكن تعديل عامل التخفيف بناء على تركيزات الأيونات المسقطة وحد الكشف عن أداة مقياس الطيف.
    3. اقرأ العينات باستخدام ICP-OES.

3. طريقة التعرض المباشر (الطريقة ب)

ملاحظة: إذا كان معدل نمو البكتيريا المختارة غير معروف ، فيجب إكمال توحيد منحنى النمو قبل تنفيذ هذه الطريقة.

  1. تحديد الأنشطة الجراثيم والجراثيم في الوقت الحقيقي عند التعرض للجسيمات النانوية ذات الأهمية.
    1. تحضير التركيزات المطلوبة من الجسيمات النانوية باستخدام الطرق الموصوفة في الخطوة 2-1-2-1-2-2. تحضير مجموعتين من كل وزن من الجسيمات النانوية لاستخدامها: واحدة تضاف إلى 3 مل من حصص زراعة البكتيريا في مرحلة النمو اللوغاريتمي ، والأخرى تضاف إلى 3 مل من حصص وسط النمو بدون البكتيريا كمجموعات تحكم.
    2. تحديد المضادات الحيوية المناسبة للجراثيم والجراثيم لأنواع البكتيريا المراد اختبارها.
      ملاحظة: مطلوب معرفة الحد الأدنى من التركيز المثبط لكل مضاد حيوي.
  2. احسب الحجم الكلي للمزرعة البكتيرية اللازمة لعينات ثلاثية 3 مل لجميع عينات الجسيمات النانوية والمضادات الحيوية والتحكم.
    ملاحظة: مطلوب حجم متساو من وسط النمو المعقم. إذا تم التخطيط لاستخدام القياس الطيفي ، فإن هذا يتطلب إجراء تعديلات على الحجم الإجمالي اللازم لاستيعاب حجم 0.5 مل إلى 1.0 مل اللازمة ل cuvettes.
  3. اليوم الأول: لكل تجربة في المختبر ، قم بإنشاء أسهم ليلية باتباع الخطوة 2.2.1-2.2.2.
  4. اليوم 2: تأكد من أن إعدادات قارئ اللوحة يمكن أن تستوعب لوحة 96 بئرا بكثافة بصرية تبلغ 600 نانومتر. قم بقياس العينات في حصص 200 ميكرولتر باستخدام لوحة 96 بئرا.
    1. تحديد مزرعة بكتيرية أولية OD600 عند 0.01 - الكثافة المستخدمة لبدء فترة الحضانة الأولية قبل إضافة الجسيمات النانوية والمضادات الحيوية.
    2. جمع ثقافة البكتيريا بين عشية وضحاها من شاكر الحاضنة.
      1. لكل مادة (على سبيل المثال ، الجسيمات النانوية المقاسة مسبقا أو المضادات الحيوية) المراد اختبارها ، قم بإنشاء مزرعة بكتيرية منفصلة عند OD600 من 0.01. استخدم حاوية كبيرة بما يكفي لاستيعاب حجم زراعة الخلايا المطلوبة (على سبيل المثال ، دورق Erlenmeyer معقم أو أنابيب مخروطية سعة 50 مل).
      2. قم بتخفيف العينات البكتيرية الليلية باستخدام وسط النمو عن طريق وضع ثلاث حصص 200 ميكرولتر من وسط النمو في ثلاثة آبار وثلاثة حصص 200 ميكرولتر من المستنبتة البكتيرية في آبار إضافية (على سبيل المثال ، A1 إلى A6).
      3. ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا في قارئ اللوحة وامسحها ضوئيا.
        ملاحظة: يتم حساب متوسط القراءات لكل بئر ممسوحة ضوئيا لإنتاج قيمة متوسطة.
      4. لحساب كثافة البكتيريا في التعليق ، قم بحساب متوسط القيمة لكل بئر يحتوي على عينة ثلاثية.
      5. لتحديد الكثافة البصرية للبكتيريا ، اطرح متوسط عينة المرق من المتوسط البكتيري.
      6. إذا كان من الضروري الاستمرار في ضبط التعليق البكتيري ، فاستمر في إضافة المرق أو الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها حسب الحاجة ، وكرر المسح في قارئ اللوحة حسب الضرورة حتى يتم الوصول إلى OD600 من 0.01 تقريبا.
      7. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز عند 150 دورة في الدقيقة حتى يتم الوصول إلى النمو اللوغاريتمي.
  5. إزالة الثقافات البكتيرية من شاكر الحاضنة.
    1. القسمة 3 مل من الثقافة البكتيرية OD600 0.01 في أنابيب مخروطية 15 مل للاختبار والتحكم في عينات ثلاثية.
    2. القسمة 200 ميكرولتر من المستنبتة البكتيرية في ثلاثة آبار من صفيحة 96 بئرا وقياس العينات باستخدام قارئ اللوحة.
    3. احسب القراءات كما هو موضح سابقا في الخطوة 3.4.2.2 والخطوة 3.4.2.6 - "قراءة -0.5 ساعة".
  6. إنشاء وقياس مخاليط البكتيريا / الجسيمات النانوية
    1. القسمة 3 مل من وسط النمو المعقم بأعداد متساوية للمزارع البكتيرية في أنابيب مخروطية 15 مل لعينات التحكم (في ثلاث نسخ).
    2. لتحضير معلقات البكتيريا / الجسيمات النانوية والوسائط المعقمة / معلقات الجسيمات النانوية ، قم بإزالة 1 مل من الثقافة البكتيرية أو الوسط من كل مجموعة ثلاثية من الأنابيب المخروطية سعة 15 مل.
      1. ضع القسمة 1 مل في أنبوب طرد مركزي سعة 5 مل يحتوي على جسيمات نانوية تم قياسها مسبقا ، ودوامة لفترة وجيزة للخلط.
      2. من أنبوب الطرد المركزي سعة 5 مل ، أعد 1 مل من قسمات البكتيريا / الجسيمات النانوية أو المعلقات المتوسطة / الجسيمات النانوية إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 مل لتوزيع الجسيمات النانوية بشكل متجانس.
        ملاحظة: يتم سحب خليط البكتيريا / الجسيمات النانوية 2x-3x قبل كل 1 مل من القسمة للحفاظ على الجسيمات النانوية في التعليق.
  7. إنشاء وقياس مخاليط البكتيريا / المضادات الحيوية
    1. لإنشاء مزارع بكتيرية / مضادات حيوية ، قم بتخصيص 3 مل من المستنبتة البكتيرية المحتضنة في الأنابيب المخروطية ذات العلامات المقابلة 15 مل.
    2. بعد إعداد جميع العينات ، قم بتخصيص 200 ميكرولتر من كل عينة في الآبار الفردية للوحة 96 بئرا.
    3. ضع اللوحة (اللوحات) في قارئ اللوحة ، وابدأ المسح الضوئي - قراءة "0 h".
    4. ضع الأنابيب المخروطية سعة 15 مل التي تحتوي على العينات في شاكر حاضنة عند 37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة. سجل جميع البيانات كما هو موضح سابقا في الخطوة 3.4.2.2 والخطوة 3.4.2.6.
  8. بعد حوالي 15 دقيقة من إكمال قراءة 0 ساعة ، كرر الخطوات الموضحة في الخطوة 3.7.2-3.7.3 - قراءة "0.5 ساعة".
    1. بعد 0 ساعة المحددة ، كرر الخطوات الموضحة في الخطوة 3.7.2 - الخطوة 3.7.3 كل 90 دقيقة لمدة ست دورات ؛ كاملة في 9 ساعات.
    2. بعد اكتمال الدورة السادسة ، ضع العينات في شاكر الحاضنة لمدة 15 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة. كرر الخطوات الموضحة في الخطوة 3.7.2-3.7.3 للحصول على قراءة 24 ساعة. سجل جميع البيانات كما هو موضح سابقا في الخطوة 3.4.2.2 والخطوة 3.4.2.6.

4. طريقة الاستزراع المباشر (الطريقة ج)

ملاحظة: في الطريقة C ، يتم وضع البكتيريا في ثقافة البذر في مرحلة التأخر مباشرة على الأسطح ذات البنية النانوية ذات الأهمية. لفحص أنشطة مضادات الميكروبات ذات البنية النانوية ، نتبع بروتوكولا وصفه Zhang et al.14. لإثبات طريقة الاستزراع المباشر هذه ، تم استخدام ZC21 (سبائك Mg-Zn-Ca) ودبابيس Mg كعينات.

  1. تحضير وتنمية مزارع البكتيريا
    1. لكل تجربة في المختبر ، قم بإنشاء أسهم ليلية باتباع الخطوة 2.2.1-2.2.2.
  2. غسل وعد البكتيريا لتحديد كثافة البذر
    ملاحظة: تم تحديد كثافة البذر المرغوبة البالغة 7.5 × 105 CFU / mL على أنها تركيز الخلية المبلغ عنه الذي يسبب التهابات العظام14.
    1. استرجع الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها من شاكر الحاضنة.
    2. اغسل البكتيريا واجمع ، باتباع الخطوة 2.3.2-2.3.2.3 ، ولكن استبدل الوسط الطازج بسائل الجسم المحاكي المنقح (rSBF) لكل خطوة من خطوات الغسيل.
      ملاحظة: rSBF هو محلول عازل يحاكي التركيز الأيوني لبلازما الدم البشري. ومع ذلك ، يحتوي rSBF على مركبات غير عضوية فقط ، ولا يحتوي على أي مركبات عضوية حيوية مثل البروتينات. من أجل حل هذه المشكلة ، يتم دمج مصل الجنين البقري (FBS) مع rSBF لمحاكاة تكوين الدم البشري لمحاكاة التكوين الطبيعي للأباتيت بشكل أفضل في الأنسجة المتكلسة في ظل الظروف التجريبية36.
    3. إزالة طاف من الخلايا المحببة. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من rSBF المكمل ب 10٪ FBS - تعليق الخلية.
    4. حدد تركيز تعليق الخلية (الخلايا / مل) باستخدام مقياس الدم. خفف معلق الخلية إلى تركيز 7.5 × 105 خلايا / مل في rSBF المكمل ب 10٪ FBS. قم بإنشاء ثقافة البذر باتباع الخطوة 2.4.1.
    5. حدد كثافة البذر الفعلية باتباع الخطوة 2.4.2.
  3. توزيع معلق الخلايا البكتيرية على العينات في آبار الاستزراع.
    1. ضع كل من العينات وعينات التحكم في الآبار الفردية للوحة البوليسترين غير المعالجة بالأنسجة المكونة من 48 بئرا.
    2. القسمة 0.75 مل من تعليق الخلية في كل بئر تحتوي على العينات والضوابط. ضع اللوحة (اللوحات) المكونة من 48 بئرا في شاكر حاضنة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 120 دورة في الدقيقة.
  4. توصيف التركيز البكتيري
    1. بعد 24 ساعة من الحضانة ، اجمع العينات وضعها في أنابيب تجميع منفصلة تحمل علامات.
    2. اجمع عينتين من كل مجموعة وضعها بشكل فردي في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 5.0 مل. أضف 2 مل من rSBF إلى كل أنبوب.
    3. ضع العينات التي تم جمعها في الخطوة 4.4.2 في حمام صوتنة ، وصوتنة لمدة 10 دقائق. بعد كل فترة 5 دقائق ، دوامة كل عينة لمدة 5 ثوان.
    4. اجمع rSBF الذي يحتوي على الخلايا البكتيرية المنفصلة حديثا وضع المعلق في أنبوب طرد مركزي جديد مسمى.
  5. التخفيفات التسلسلية وطلاء البكتيريا
    1. قم بتخفيف المعلق البكتيري وطبقه بشكل متسلسل باتباع الخطوة 2.6.2-2.6.6.
  6. قم بتقييم الأس الهيدروجيني لوسائط الاستزراع بعد الحضانة باتباع الخطوة 2.7.
  7. قم بإعداد وسيط ما بعد الاستزراع لبرنامج المقارنات الدولية - OES باتباع الطرق الموضحة في الخطوة 2.8.

5. طريقة التعرض للتلامس المركز (الطريقة د)

ملاحظة: في الطريقة D ، يتم وضع البكتيريا الموجودة على ورق ترشيح النيتروسليلوز على اتصال مباشر بمنطقة ذات أهمية على الأسطح ذات البنية النانوية. تقلل هذه الطريقة من تداخل تدهور العينات السائبة في الثقافات البكتيرية مع الأنشطة البكتيرية. لفحص الأنشطة المضادة للميكروبات على السطح النانوي ، نتبع بروتوكولا وصفه Lin et al.16.

  1. اتبع الإجراءات الواردة في الخطوة 2.2.1-2.2.2.1 لإنشاء مزرعة بذر بكتيرية. قم بتأكيد كثافة البذر الفعلية باتباع الخطوة 2.4.2.
  2. تحضير العينات إلى حجم 1 × 1 سم2 في شكل مربع. تحضير جميع أنواع العينات في ثلاث نسخ. إذا لزم الأمر ، ضع العينات على حامل ثلاثي الأبعاد (3D) يبلغ قطره 15 مم وارتفاعه 10 مم. ضع العينة والحامل في بئر من لوحة بئر البوليسترين غير المعالجة بزراعة الأنسجة.
  3. تحضير أوراق النيتروسليلوز المعقمة عن طريق تقليم كل منها بقطر 1 سم. ضع أوراق النيتروسليلوز المحضرة على طبق أجار يحتوي على الوسط المناسب.
  4. ماصة 50 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية المخففة على ورق الترشيح.
  5. ماصة 50 ميكرولتر من وسط مناسب على مركز كل سطح عينة.
  6. باستخدام ملاقط معقمة ، التقط ورق النيتروسليلوز من سطح أجار. اقلب ورق النيتروسليلوز بعناية وضعه على سطح العينة بحيث تتلامس البكتيريا مع 50 ميكرولتر من الوسط والسطح النانوي محل الاهتمام.
  7. أضف 1 مل من مخزن Tris المؤقت إلى كل بئر يحتوي على عينة للحفاظ على الرطوبة. احتضان لوحة بئر البوليسترين التي تحتوي على جميع العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  8. اجمع ورق النيتروسليلوز من كل سطح عينة. ضع كل منها في 5 مل من مخزن Tris المؤقت. دوامة أوراق الترشيح التي تم جمعها وعينات المواد النانوية لمدة 5 ثوان.
  9. قم بتدوين كل عينة لمدة 10 دقائق. دوامة لمدة 5 ثوان بعد 5 دقائق ومرة أخرى بعد 10 دقائق.
  10. اجمع معلقات Tris العازلة من جميع العينات وضع كل وحدة تخزين في أنابيب تجميع جديدة فردية.
  11. قم بتخفيف العينات وطبقها بشكل تسلسلي باتباع الخطوة 2.6.2-2.6.6.

6. توصيف ما بعد الاستزراع للبكتيريا والمواد النانوية

  1. فحص الالتصاق البكتيري والتشكل باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)
    1. بعد الحضانة طوال الليل ، أضف 10٪ جلوتارالدهيد في كل بئر من صفيحة البوليسترين غير المعالجة بالأنسجة المكونة من 48 بئرا حتى يتم تغطية العينات بالكامل. احتضان العينات لمدة 1 ساعة لإصلاح الخلايا البكتيرية.
    2. نضح الجلوتارالدهيد في زجاجة نفايات وشطف جميع العينات 3x بمحلول عازل تريس لإزالة البكتيريا غير الملتصقة.
    3. جفف العينات باستخدام 30٪ و 75٪ و 100٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة لكلمنها 16.
      ملاحظة: يوصى باستخدام مجفف النقاط الحرجة لتجفيف العينات. ليس من المثالي تجفيف العينات بالهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
    4. استخدم أشرطة لاصقة موصلة ، مثل الأشرطة النحاسية أو الكربونية ، لتثبيت العينات على كعب SEM. قم بتغطية أسطح العينة عن طريق طلاء الرش لتوفير الموصلية قبل التصوير (على سبيل المثال ، قم بتغطية ألواح Mg بالبكتيريا الملتصقة تحت البلاتين / البلاديوم (Pt / Pd) لمدة 45 ثانية عند 20 مللي أمبير16).
      ملاحظة: قد تختلف مواد الطلاء ووقت المعالجة وتيار التشغيل حسب أنواع العينات.
    5. التقط صورا للبكتيريا على العينات باستخدام SEM بمسافة عمل مناسبة وجهد متسارع وبتكبير مطلوب. على سبيل المثال ، استخدم SEM مع كاشف إلكترون ثانوي لالتقاط الصور على مسافة عمل تبلغ 5 مم وجهد متسارع يبلغ 10 كيلو فولت16.
  2. فحص التشكل السطحي لعينات المواد النانوية بعد الاستزراع باستخدام SEM.
    1. بالنسبة للمواد النانوية ، اغسل العينات باستخدام Tris buffer 3x لإزالة البكتيريا الحرة غير المرتبطة بالعينة. بالنسبة للجسيمات النانوية ، قم بتفريق الجسيمات إلى مذيب لا يؤثر على خصائص العينة من خلال الموجات فوق الصوتية لتحقيق تشتت أفضل عند الحاجة.
    2. تجفيف العينات بعد إجراء الغسيل.
    3. استخدم أشرطة لاصقة من الكربون أو النحاس على الوجهين للصق العينات على كعب SEM.
    4. قم بإنشاء طبقة سطحية موصلة من Pt / Pd باستخدام طلاء الرش ، كما هو موضح في الخطوة 6.1.4 ، قبل التصوير. خذ عينة الصور كما هو موضح في الخطوة 6.1.5.
    5. قم بتحليل التركيب الأولي السطحي باستخدام EDS بجهد متسارع مناسب وعند التكبير المطلوب (على سبيل المثال ، عند 10 كيلو فولت بعد إجراء تحليل SEM16).
  3. التصوير الفلوري للالتصاق البكتيري
    1. قم بإعداد العينات المراد تصورها باستخدام الفحص المجهري الفلوري عن طريق غسلها أولا باستخدام Tris buffer 3x. جفف العينات في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بتلطيخ كل عينة بصبغة مضان 10 ميكرومتر ثيوفلافين T باتباع البروتوكولالمعمول به 37.
    3. قم بإجراء تصوير مضان للالتصاق البكتيري باستخدام مجهر مقلوب مقترن بكاميرا رقمية لجهاز مضاعفة الشحنة بالإلكترون.

النتائج

تم تحديد النشاط المضاد للبكتيريا لجسيمات أكسيد المغنيسيوم النانوية والأسطح ذات البنية النانوية باستخدام أربع طرق في المختبر قابلة للتطبيق عبر أنواع مختلفة من المواد والأنواع الميكروبية.

تفحص الطريقة A والطريقة B الأنشطة البكتيرية عند تعرضها للجسيمات النانوية في مرح?...

Discussion

لقد قدمنا أربع طرق في المختبر (A-D) لتوصيف الأنشطة المضادة للبكتيريا للجسيمات النانوية والأسطح ذات البنية النانوية. في حين أن كل طريقة من هذه الطرق تحدد النمو البكتيري وصلاحيته بمرور الوقت استجابة للمواد النانوية ، يوجد بعض الاختلاف في الطرق المستخدمة لقياس كثافة البذر البكتيري الأول...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يقدر المؤلفون الدعم المالي المقدم من مؤسسة العلوم الوطنية الأمريكية (جائزة NSF CBET 1512764 و NSF PIRE 1545852) ، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH NIDCR 1R03DE028631) ، وزمالة تطوير أعضاء هيئة التدريس بجامعة كاليفورنيا (UC) Regents ، ولجنة منحة البذور البحثية (Huinan Liu) ، ومنحة برنامج إرشاد أبحاث الخريجين بجامعة كاليفورنيا في ريفرسايد الممنوحة لباتريشيا هولت توريس. يقدر المؤلفون المساعدة المقدمة من المرفق المركزي للفحص المجهري المتقدم والتحليل المجهري (CFAMM) في جامعة كاليفورنيا ريفرسايد لاستخدام SEM / EDS والدكتور بيري تشيونغ لاستخدام XRD. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا مورغان إليزابيث ناتور وسامهيثا تومكور على مساعدتهم في التجارب وتحليل البيانات. أي آراء أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات معبر عنها في هذه المقالة هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة آراء المؤسسة الوطنية للعلوم أو المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeMilipore SigmaZ336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven MTI CorporationBPG-7082https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer Sigma-Aldrich 42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADEFisher Scientific50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera HamamatsuC9100-13
Falcon 15 mL conical tubesFisher Scientific14-959-49B
GluteraldehydeSigma-Aldrich G5882
HemocytometerBrightline, Hausser Scientific1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES)PerkinElmer8000
Inverse microscopeNikonEclipse Ti-S
Luria Bertani BrothSigma Life Science L3022
Luria Bertani Broth + agarSigma Life Science L2897
MacroTube 5.0  Benchmark ScientificC1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticlesUS Research Nanomaterials, IncStock #: US3310   MMgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro BalanceMettler ToledoMS105D
Nitrocellulose paperFisherbrand09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plateFalcon Corning Brand 351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plateFalcon Corning Brand 351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plateFalcon Corning Brand 351172
Petri dish 100 mmVWR470210-568
Petri dish, 15 mmFisherbrandFB0875713A
pH meterVWRSP70P
Scanning electron microscopy (SEM)TESCAN Vega3 SBH
SonicatorVWR97043-936
Table top centrifugeFisher ScientificaccuSpin Micro 17
Table top centrifuge EppendorfCentrifuge 5430
Tryptic Soy AgarMP1010617
Tryptic Soy BrothSigma-Aldrich22092-500G
UV-Vis spectrophotometer TecanInfinite 200 PROhttps://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10LVWRN/A
X-ray power defraction PanalyticalN/APANalytical Empyrean Series 2

References

  1. Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections - An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
  2. O'Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials. Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).
  3. Li, B., Webster, T. J. Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).
  4. Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).
  5. Adams, R. A. Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure. The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).
  6. Harding, E. WHO global progress report on tuberculosis elimination. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19 (2020).
  7. Baptista, P. V. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-"A battle of the titans". Frontiers in Microbiology. 9, 1441 (2018).
  8. Seong, M., Lee, D. G. Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction. Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).
  9. Dasgupta, N., Ramalingam, C. Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).
  10. Su, H. L. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay. Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).
  11. Cui, Y. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).
  12. Ranjan, S., Ramalingam, C. Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).
  13. Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).
  14. Zhang, C. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).
  15. Lock, J. Y. Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).
  16. Lin, J., Nguyen, N. -. Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates. ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).
  17. Nguyen, N. -. Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms. Scientific Reports. 8 (1), 16260 (2018).
  18. Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications. Materials Letters. 166, 19-22 (2016).
  19. He, Y. Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54 (2016).
  20. Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties. Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).
  21. Hayat, S. In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria. Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).
  22. Dong, C. Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent. Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).
  23. Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles. Biomimetics. 4 (2), 41 (2019).
  24. Pan, X. Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2. ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).
  25. Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics. Frontiers in Microbiology. 11, 1074 (2020).
  26. Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus. Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).
  27. Loo, Y. Y. In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 9, 1555 (2018).
  28. Ali, K. Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates. PLoS One. 10 (7), e0131178 (2015).
  29. Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures. Materials. 10 (9), 1066 (2017).
  30. MTI Corporation. . 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18"x16"x18", 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) - BPG-7082. , (2022).
  31. CHEBI. . Tris (CHEBI:9754). , (2023).
  32. . Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).
  33. Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems. Water Research. 45, 3744-3752 (2011).
  34. Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems. Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).
  35. Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-Römer, R., Feyerabend, F. Magnesium degradation under physiological conditions - Best practice. Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).
  36. Oyane, A., et al. Preparation and assessment of revised simulated body fluids. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).
  37. Xia, B., et al. Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging. Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).
  38. Pankey, G. A., Sabath, L. D. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).
  39. Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions. Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

194 MIC MBC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved