体外评估纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性

摘要

我们介绍了四种使用 体外 技术评估纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性的方法。这些方法可以适用于研究不同纳米颗粒和纳米结构表面与各种微生物物种的相互作用。

摘要

纳米颗粒和纳米结构表面（如银、氧化锌、二氧化钛和氧化镁）的抗菌活性以前已在临床和环境环境以及消费品中探索过。然而，所使用的实验方法和材料缺乏一致性，最终导致了相互矛盾的结果，即使在相同纳米结构类型和细菌种类的研究中也是如此。对于希望在产品设计中使用纳米结构作为添加剂或涂层的研究人员来说，这些相互矛盾的数据限制了它们在临床环境中的使用。

为了应对这一困境，在本文中，我们提出了四种不同的方法来确定纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性，并讨论了它们在不同场景中的适用性。调整一致的方法有望产生可重复的数据，这些数据可以在研究中进行比较，并针对不同的纳米结构类型和微生物物种实施。我们介绍了两种确定纳米颗粒抗菌活性的方法和两种纳米结构表面抗菌活性的方法。

对于纳米颗粒，直接共培养方法可用于确定纳米颗粒的最小抑制和最小杀菌浓度，直接暴露培养方法可用于评估纳米颗粒暴露引起的实时抑菌与杀菌活性。对于纳米结构表面，直接培养方法用于确定与纳米结构表面间接和直接接触的细菌的活力，并且聚焦接触暴露方法用于检查纳米结构表面特定区域的抗菌活性。我们讨论了在确定纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌特性时要考虑的 体外 研究设计的关键实验变量。所有这些方法的成本都相对较低，采用相对容易掌握和可重复的技术以实现一致性，并且适用于广泛的纳米结构类型和微生物物种。

引言

仅在美国，每年就有 170 万人发生医院获得性感染 （HAI），其中每 17 例感染中就有 1 例导致死亡¹。此外，据估计，HAI的治疗费用每年从280亿美元到450亿美元不等^1，2。这些 HAI 主要由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （MRSA）³，4 和铜绿假单胞菌 ⁴ 为主，它们通常从慢性伤口感染中分离出来^，通常需要广泛的治疗和时间才能产生良好的患者预后。

在过去的几十年中，已经开发了多种抗生素类别来治疗与这些和其他致病菌相关的感染。例如，利福霉素类似物已被用于治疗MRSA，其他革兰氏阳性和革兰氏阴性菌感染以及分枝杆菌属感染⁵。在1990年代，为了有效治疗越来越多的结核分枝杆菌感染，额外的药物与利福霉素类似物联合使用以提高其有效性。然而，大约 5% 的结核分枝杆菌病例仍然对利福平⁵，⁶ 耐药^，并且人们越来越关注多重耐药细菌⁷。 目前，单独使用抗生素可能不足以治疗HAI，这引发了对替代抗菌疗法的持续寻找^1。

重金属，如银（Ag）⁸，⁹，¹⁰和金（Au）11，以及陶瓷，如二氧化钛（TiO 2）¹²和氧化锌（ZnO）¹³，以纳米颗粒（NP）形式（分别为AgNP，AuNP，TiO₂ NP和ZnONP）已被检查其抗菌活性^，并已被确定为潜在的抗生素替代品。此外，生物可吸收材料，如镁合金（Mg合金）14，15，¹⁶，氧化镁纳米颗粒¹⁷，^18，19，20，21和氢氧化镁纳米颗粒[分别为nMgO和nMg（OH）₂]²²，^23，24，也进行了检查。然而，以前对纳米颗粒的抗菌研究使用了不一致的材料和研究方法，导致数据难以或不可能比较，有时本质上是矛盾^的18，19。例如，银纳米颗粒的最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）在不同的研究中差异很大。Ipe等人²⁵评估了平均粒径为~26nm的AgNPs的抗菌活性，以确定MIC对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的抵抗力。鉴定出的铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和MRSA的MIC分别为2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL和10 μg/mL。相比之下，Parvekar等人²⁶评估了平均粒径为5nm的AgNPs。在这种情况下，发现AgNP MIC和0.625 mg / mL的MBC对金黄色葡萄球菌有效。此外，Loo等人²⁷评估了尺寸为4.06nm的AgNP。当大肠杆菌暴露于这些纳米颗粒时，报告的MIC和MBC为7.8μg/ mL。最后，Ali等人28研究了平均尺寸为¹⁸ nm的球形AgNPs的抗菌性能。当铜绿假单胞菌、大肠杆菌和MRSA暴露于这些纳米颗粒时，MIC的鉴定分别为27 μg/mL、36 μg/mL、27 μg/mL和36 μg/mL，MBC分别为36 μg/mL、42 μg/mL和30 μg/mL。

尽管近几十年来纳米颗粒的抗菌活性已被广泛研究和报道，但用于直接比较研究的材料和研究方法没有标准。出于这个原因，我们提出了两种方法，直接共培养方法（方法A）和直接暴露方法（方法B），以表征和比较纳米颗粒的抗菌活性，同时保持材料和方法的一致性。

除纳米颗粒外，还研究了纳米结构表面的抗菌活性。这些包括碳基材料，如石墨烯纳米片、碳纳米管和石墨²⁹，以及纯镁和镁合金。这些材料中的每一种都表现出至少一种抗菌机制，包括碳基材料对细胞膜的物理损伤，以及当镁降解时通过释放活性氧（ROS）对代谢过程或DNA的损害。此外，当锌（Zn）和钙（Ca）结合形成镁合金时，镁基体晶粒尺寸的细化增强，与仅镁样品相比，这导致细菌对基材表面的粘附减少¹⁴。为了证明抗菌活性，我们提出了直接培养方法（方法C），该方法通过定量具有直接和间接表面接触的细菌菌落形成单位（CFU）来确定细菌随时间推移对纳米结构材料及其周围的粘附。

表面纳米结构的几何形状，包括尺寸、形状和方向，可能会影响材料的杀菌活性。例如，Lin等人¹⁶ 通过阳极氧化和电泳沉积（EPD）在镁衬底表面制备了不同的纳米结构MgO层。在 体外暴露于纳米结构表面一段时间后，与未处理的Mg相比， 金黄色葡萄球菌 的生长显着减少。这表明纳米结构表面对细菌粘附的效力高于未处理的金属镁表面。为了揭示各种纳米结构表面抗菌性能的不同机制，本文讨论了一种确定感兴趣区域内细胞-表面相互作用的聚焦接触暴露方法（方法D）。

本文的目的是介绍四种适用于不同纳米颗粒、纳米结构表面和微生物物种的体外方法。我们讨论了每种方法的关键考虑因素，以产生一致、可重复的数据以提高可比性。具体地，直接共培养方法¹⁷和直接暴露方法用于检查纳米颗粒的抗菌特性。通过直接共培养法，可以确定单个物种的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度（MIC和MBC_90-99.99），并且可以确定多个物种的最有效浓度（MPC）。通过直接暴露方法，纳米颗粒在最小抑制浓度下的抑菌或杀菌作用可以通过随时间推移的实时光密度读数来表征。直接培养^方法14适用于直接和间接检查与纳米结构表面接触的细菌。最后，提出聚焦接触曝光¹⁶方法，通过直接应用细菌和表征细胞-纳米结构界面上的细菌生长来检查纳米结构表面上特定区域的抗菌活性。该方法从日本工业标准JIS Z 2801:2000¹⁶修改而来，旨在关注微生物-表面相互作用，并排除微生物培养中大宗样品降解对抗菌活性的影响。

研究方案

为了介绍直接共培养和直接暴露方法，我们使用氧化镁纳米颗粒（nMgO）作为模型材料来证明细菌相互作用。为了介绍直接培养和聚焦接触暴露方法，我们以具有纳米结构表面的镁合金为例。

1. 纳米材料的灭菌

注意:在微生物培养之前，所有纳米材料必须经过灭菌或消毒。可以使用的方法包括热、压力、辐射和消毒剂，但必须在 体外 实验之前确定每种方法的材料耐受性。

1. 纳米粒子
   注意:样品可以储存在乙醇等有机溶剂中，也可以包装到培养皿或盒子中，然后以适当的方式进行灭菌或消毒。使用以下方法对纳米颗粒进行灭菌，以演示直接共培养方法¹⁷ 和直接暴露方法。
   1. 在每次体外实验之前，在200°C对流炉³⁰中对MgO纳米颗粒灭菌60分钟。
      注意:选择这种方法是因为水蒸气和紫外线可能会影响MgO纳米颗粒（nMgO）的结构¹⁷。
2. 散装物料
   注意:纳米结构材料通过以下方法灭菌，以演示直接培养方法。
   1. 对于直接培养方法¹⁴，在开始 体外 研究之前，使用紫外线（UV）辐射对制备好的ZC21，Mg和T64样品进行4小时的消毒。
   2. 对于聚焦接触暴露方法¹⁶，在开始 体外 研究之前，使用紫外线辐射对所有样品进行消毒2小时。
3. 或者，使用环氧乙烷（EtO）对热敏材料进行灭菌。

2.直接共培养法（方法A）

注意:在方法A中，滞相播种培养物中的细菌直接与一定浓度的纳米颗粒混合。为了检查纳米颗粒抗菌活性，我们遵循Nguyen等人描述的方案¹⁷。

1. 纳米颗粒和纳米结构的表征
   注意:纳米结构组成和形状使用X射线粉末衍射确认。
   1. 纳米颗粒的测量
      1. 称量纳米颗粒，重量为每毫升所需质量的 9 倍，以容纳 3 mL 样品一式三份。例如，称量 0.2 毫克/毫升 nMgO 和 1.8 毫克/毫升。
         注意:这确保了纳米颗粒在细菌培养物和肉汤中的一致分布。
      2. 测量 5.0 mL 微量离心管中的所有纳米颗粒，该管已使用分析天平预先称重和去皮。
2. 制备和培养细菌培养物
   1. 对于每个 体外 实验，从-80°C的储存中取出细菌细胞原液。 将 10 μL 每种细菌细胞原液加入 5 mL 适当的生长培养基中。
   2. 将接种的培养基放入37°C和250rpm的培养箱摇床中约16小时过夜。
      1. 如果生长 葡萄 球菌属，通过将 400 μL 每个过夜培养物放入 20 mL 新鲜生长培养基（100 μL/5 mL 培养基）中进行传代培养，并在 37 °C 和 250 rpm 下振荡孵育 4-6 小时。
3. 洗涤和计数细菌细胞以确定接种密度
   注意:将所需的接种密度7.8×10⁶ CFU / mL鉴定为大于确认尿路感染所需的细胞数。
   1. 通过将 1 mL 的过夜细菌培养物等分到 1.5 mL 微量离心管中来收集培养的细菌。从过夜细菌培养物中产生足够数量的等分试样，并以 1，956 × g 离心 10 分钟以达到所需的接种密度。
   2. 离心后，移液以从沉淀细胞中除去上清液，并将上清液放入收集容器中。将细胞沉淀重悬于0.5mL新鲜生长培养基中。将两个 0.5 mL 悬浮液合并以产生 1 mL 悬浮液，将重悬细胞的 1 mL 等分试样数量减少到 6 个。以1，956× g重复离心10分钟。
   3. 使用新鲜生长培养基完成第二个洗涤周期，如步骤2.3.2所示，将重悬洗涤细胞的1 mL等分试样数量减少到3个。
   4. 完成第三个循环，如步骤2.3.2所示，除了将细胞沉淀重悬于0.33mL的Tris缓冲液（羟甲基）氨基甲烷缓冲液（Tris缓冲液，pH 8.5）中。将三种悬浮液（每种体积为 0.33 mL）合并到一台 1.5 mL 微量离心机中。以1，956× g重复离心10分钟。
      注意:Tris缓冲液不含Mg 2+或Ca²⁺离子³¹。这对于使用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测量培养后肉汤中的Mg 2+和Ca²⁺离子非常重要。相反，例如，磷酸盐缓冲盐水（PBS）³²中存在的磷酸盐会螯合Mg 2+或Ca²⁺离子33，^34，35，^并在ICP-OES数据的解释中引起混淆。
   5. 从沉淀细胞中除去上清液。将细胞沉淀重悬于 1 mL 新鲜 Tris 缓冲液中，称为细胞悬液 - 滞后期细菌接种培养物。
   6. 使用血细胞计数器测定细胞悬液浓度（细胞/mL）。
4. 创建播种细菌培养物
   注意:样品的总体积为 3 mL，一式三份完成（总共 9 mL）。
   1. 确定所需的细菌接种培养物总量。要创建接种培养物，请使用C 1V₁ = C 2 V₂计算创建7.8×10⁶个细胞/ mL的接种培养物所需的细胞悬液体积。将计算出的细胞悬液体积（V₁）添加到所需的生长培养基体积（V₂）中。
   2. 确定实际细菌接种密度（以 CFU/mL 为单位）。创建十倍系列稀释至^10-4。将 ^10-4 稀释液铺在适当的生长琼脂上并孵育过夜。孵育后，计数菌落数，并计算CFU/mL。
5. 细菌和纳米颗粒培养物的形成
   1. 在 12 孔、非组织处理的聚苯乙烯板中，将 2 mL 细菌接种培养物等分到每个孔中，以获得所需的孔数。
   2. 对于每个含有预称重 nMgO 的 5 mL 微量离心管，加入 3 mL 细菌接种培养物。短暂涡旋以将nMgO与细菌混合。将 1 mL 的混合物等分到三个单独的孔中，以创建每个预先测量重量的 nMgO 的三份样品。在每 1 mL 等分试样之前移取细菌/nMgO 混合物 2-3 倍，以保持 nMgO 悬浮液。
      注意:对照样品将仅由 3 mL 细胞、3 mL 培养基和 3 mL 包含所用最低和最高浓度纳米颗粒组成。这些按照步骤2.5.2制备。所有对照样品一式三份完成。
   3. 将所有12孔板在37°C和120rpm下孵育24小时。
6. 测定暴露于nMgO后的细菌细胞生长
   1. 细菌培养物孵育过夜后，通过移液到单独的 15 mL 锥形管中收集每 3 mL 样品。
   2. 使用 96 孔板创建 1:10 连续稀释液。确定连续稀释所有含有细菌的样品所需的色谱柱数。向B行至G行的每个孔中加入180 μL Tris缓冲液，以获得适当的列数。
   3. 短暂涡旋每个含有细菌样品的 15 mL 锥形管，并向 A 行的单个孔中加入 50 μL。
   4. 对于 A 行中的每个孔，将 20 μL 转移到 B 行（例如，A1 至 B1）中，并通过移液短暂混合以获得 200 μL 的体积。 使用无菌移液器吸头，将 20 μL 从 B 行的孔转移到 C 行的孔中。 继续此模式，直到G行中的孔含有200μL， 完成从B行的10⁻¹ 到G行的^10-6 的连续稀释。
   5. 将每个孔的 100 μL 移液到适当的生长琼脂平板上，并铺在平板上以分散细胞培养物。将板放入培养箱 - 振荡器中，在37°C下过夜。 将板在37°C孵育24小时。
   6. 检查平板并计数具有大约25-300个菌落的平板。如果可能，选择具有相同稀释值的板。使用每个平板的菌落数来计算CFU/mL。
7. 评估孵育后的pH值
   注:请遵循每个pH计型号的制造商说明。
   1. 使用 pH 4、pH 7 和 pH 10 的标准化溶液预校准 pH 计。通过将pH探针放入15 mL锥形管中来读取每个细菌样品。
8. ICP-OES 样品的制备
   注意:ICP-OES用于测定Mg 2 +和Ca^{2 +}离子的浓度。这些阳离子被认为是重要的，因为每个阳离子都参与细胞代谢。
   1. 将步骤2.6.1中制备的每个15mL锥形管以5，724× g 离心5分钟，以沉淀细胞和纳米颗粒碎片。
   2. 使用 15 mL 锥形管，将 30 μL 上清液稀释到 2.97 mL 的 18.2 Ω过滤水中，以产生 1:100 的稀释度。
      注意:稀释因子可以根据光谱仪仪器的投影离子浓度和检测限进行调整。
   3. 使用 ICP-OES 阅读示例。

3. 直接曝光法（方法B）

注意:如果所选细菌的生长速率未知，则必须在实施此方法之前完成生长曲线的标准化。

1. 确定暴露于目标纳米颗粒时的实时抑菌和杀菌活性。
   1. 使用步骤2.1-2.1.2.2中描述的方法制备所需浓度的纳米颗粒。准备两组每种重量的纳米颗粒以供使用:一组在对数生长阶段添加到3mL等分试样的细菌培养物中，另一组添加到3mL等分试样的生长培养基中，没有细菌作为对照组。
   2. 确定适合待测细菌种类的抑菌和杀菌抗生素。
      注意:需要了解每种抗生素的最低抑菌浓度。
2. 计算所有纳米颗粒、抗生素和对照样品一式三份 3 mL 样品所需的细菌培养总量。
   注意:需要等体积的无菌生长培养基。如果计划使用分光光度法，则需要调整容纳比色皿所需的 0.5 mL 至 1.0 mL 体积所需的总体积。
3. 第1天:对于每个体 外 实验，按照步骤2.2.1-2.2.2创建隔夜储备液。
4. 第 2 天:确认酶标仪设置可以容纳光密度为 600 nm 的 96 孔板。使用 96 孔板以 200 μL 等分试样测量样品。
   1. 确定初始细菌培养物OD₆₀₀ 的密度为0.01 - 用于在添加纳米颗粒和抗生素之前开始初始孵育期的密度。
   2. 从培养箱摇床收集过夜的细菌培养物。
      1. 对于要测试的每种材料（例如，预先测量的纳米颗粒或抗生素），在OD₆₀₀ 为0.01时创建单独的细菌培养物。使用足够大的容器来容纳所需的细胞培养量（例如，灭菌的锥形瓶或 50 mL 锥形管）。
      2. 将三个 200 μL 等分试样的生长培养基放入三个孔中，将三个 200 μL 等分试样的细菌培养物放入其他孔中（例如，A1 至 A6），用生长培养基稀释过夜细菌样品。
      3. 将96孔板放入读板器并扫描。
         注意:对每个扫描孔的读数进行平均，以产生平均值。
      4. 要计算悬浮液中细菌的密度，请平均包含一式三份样品的每个孔的平均值。
      5. 要确定细菌的光密度，请从细菌平均值中减去肉汤样品平均值。
      6. 如果需要继续调整细菌悬浮液，请根据需要继续添加肉汤或过夜细菌培养物，并根据需要在读板器中重复扫描，直到达到约0.01的OD₆₀₀ 。
      7. 在37°C下以150rpm振荡孵育，直到达到对数生长。
5. 从培养箱摇床中取出细菌培养物。
   1. 将 3 mL OD₆₀₀ 0.01 细菌培养物分装到标记的 15 mL 锥形管中，一式三份用于测试和控制样品。
   2. 将 200 μL 细菌培养物等分到 96 孔板的三个孔中，并使用酶标仪测量样品。
   3. 按照前面的步骤3.4.2.2和步骤3.4.2.6-"-0.5小时读数"中所述计算读数。
6. 细菌/纳米颗粒混合物的创建和测量
   1. 将 3 mL 与细菌培养物数量相等的无菌生长培养基等分到标记的 15 mL 锥形管中，用于对照样品（一式三份）。
   2. 要制备细菌/纳米颗粒悬浮液和无菌培养基/纳米颗粒悬浮液，请从每组 15 mL 锥形管中取出 1 mL 细菌培养物或培养基。
      1. 将 1 mL 等分试样放入含有预先测量的纳米颗粒的 5 mL 离心管中，短暂涡旋混合。
      2. 从 5 mL 离心管中，将 1 mL 等分试样的细菌/纳米颗粒或培养基/纳米颗粒悬浮液返回到 15 mL 锥形管中，以均匀分布纳米颗粒。
         注意:在移液每 1 mL 等分试样之前，将细菌/纳米颗粒混合物移液 2x-3x，以保持纳米颗粒悬浮。
7. 细菌/抗生素混合物的创建和测量
   1. 为了创建细菌/抗生素培养物，将 3 mL 孵育的细菌培养物等分到相应标记的 15 mL 锥形管中。
   2. 制备完所有样品后，将每个样品的 200 μL 等分到 96 孔板的各个孔中。
   3. 将板放入读板器中，并开始扫描 - "0小时"读数。
   4. 将含有样品的15 mL锥形管放入37°C和150rpm的培养箱摇床中。按照前面的步骤3.4.2.2和步骤3.4.2.6中所述记录所有数据。
8. 完成0小时读数后约15分钟，重复步骤3.7.2-3.7.3-"0.5小时"读数中描述的步骤。
   1. 建立的0小时后，每90分钟重复步骤3.7.2-步骤3.7.3中所述的步骤，持续六个周期;9小时内完成。
   2. 第六个循环完成后，将样品置于培养箱 - 振荡器中，在37°C和150rpm下再放置15小时。重复步骤3.7.2-3.7.3中描述的步骤以获得24小时读数。按照前面的步骤3.4.2.2和步骤3.4.2.6中所述记录所有数据。

4. 直接培养法（方法C）

注意:在方法C中，将滞相接种培养物中的细菌直接放置在感兴趣的纳米结构表面上。为了检查纳米结构的抗菌活性，我们遵循Zhang等人描述的方案¹⁴。为了演示这种直接培养方法，使用了ZC21（Mg-Zn-Ca合金）和Mg针作为样品。

1. 制备和培养细菌培养物
   1. 对于每个体 外 实验，按照步骤2.2.1-2.2.2创建隔夜储备液。
2. 洗涤和计数细菌以确定接种密度
   注意:所需的接种密度 7.5 ×^{10 5} CFU/mL 被确定为导致骨科感染的报告细胞浓度¹⁴。
   1. 从培养箱摇床中取出过夜细菌培养物。
   2. 按照步骤2.3.2-2.3.2.3洗涤并收集细菌，但在每个洗涤步骤中用修订的模拟体液（rSBF）替换新鲜培养基。
      注意:rSBF是一种缓冲溶液，模拟人血浆的离子浓度。然而，rSBF仅含有无机化合物，并且不含任何生物有机化合物，例如蛋白质。为了解决这个问题，将胎牛血清（FBS）与rSBF结合使用，以模拟人体血液的组成，以更好地模拟实验条件下钙化组织中磷灰石的自然形成³⁶。
   3. 从沉淀细胞中除去上清液。将细胞沉淀重悬于补充有 10% FBS（细胞悬液）的 1 mL rSBF 中。
   4. 使用血细胞计数器测定细胞悬液浓度（细胞/mL）。将细胞悬液稀释至7.5×10⁵ 个细胞/ mL的浓度在补充有10%FBS的rSBF中。按照步骤 2.4.1 创建种子设定区域性。
   5. 按照步骤2.4.2确定实际播种密度。
3. 将细菌细胞悬液分布到培养孔中的样品上。
   1. 将样品和对照样品放入48孔非组织处理聚苯乙烯板的各个孔中。
   2. 将 0.75 mL 的细胞悬液等分到包含样品和对照的每个孔中。将48孔板放入培养箱 - 振荡器中，在37°C下以120rpm振荡24小时。
4. 细菌浓度的表征
   1. 孵育24小时后，收集样品并将其放入单独的标记收集管中。
   2. 从每组中收集两个样品，并将它们单独放入标记的 5.0 mL 微量离心管中。向每个试管中加入 2 mL rSBF。
   3. 将步骤4.4.2中收集的样品放入超声浴中，超声处理10分钟。每5分钟周期后，涡旋每个样品5秒。
   4. 收集含有新分离的细菌细胞的rSBF，并将悬浮液放入标记的新鲜微量离心管中。
5. 连续稀释和电镀细菌
   1. 按照步骤2.6.2-2.6.6连续稀释和铺板细菌悬浮液。
6. 按照步骤2.7评估培养基的孵育后pH值。
7. 按照步骤2.8中描述的方法制备ICP-OES的培养后培养基。

5. 聚焦接触曝光法（方法D）

注意:在方法D中，硝酸纤维素滤纸上的细菌与纳米结构表面上的感兴趣区域直接接触。该方法最大限度地减少了细菌培养物中大容量样品降解对细菌活性的干扰。为了检查纳米表面抗菌活性，我们遵循Lin等人描述的方案¹⁶。

1. 按照步骤2.2.1-2.2.2.1中的步骤创建细菌接种培养物。按照步骤 2.4.2 确认实际播种密度。
2. 将样品制备成 1 × 1 cm² 的正方形尺寸。一式三份制备所有样品类型。如有必要，将样品放在直径为15毫米，高度为10毫米的三维（3D）支架上。将样品和支架放入非组织培养处理的聚苯乙烯孔板的孔中。
3. 通过将每张纸修剪成直径 1 厘米来制备无菌硝酸纤维素纸。将制备的硝酸纤维素纸放在含有适当培养基的琼脂平板上。
4. 将 50 μL 稀释的细菌培养物移液到滤纸上。
5. 将 50 μL 的适当培养基移液到每个样品表面的中心。
6. 使用无菌镊子，从琼脂表面拿起硝酸纤维素纸。小心地翻转硝酸纤维素纸并将其放在样品表面上，使细菌与50μL培养基和感兴趣的纳米结构表面接触。
7. 向每个含有样品的孔中加入 1 mL Tris 缓冲液以保持湿度。将含有所有样品的聚苯乙烯孔板在37°C孵育24小时。
8. 从每个样品表面收集硝化纤维素纸。将每个放入 5 mL Tris 缓冲液中。涡旋收集的滤纸和纳米表面材料样品5秒。
9. 超声处理每个样品10分钟。5分钟后涡旋5秒，10分钟后再次涡旋。
10. 从所有样品中收集Tris缓冲液悬浮液，并将每个体积放入单独的新鲜收集管中。
11. 按照步骤2.6.2-2.6.6连续稀释和铺板样品。

6. 细菌和纳米材料的培养后表征

1. 使用扫描电子显微镜（SEM）检查细菌粘附和形态
   1. 孵育过夜后，将10%戊二醛添加到48孔，非组织处理的聚苯乙烯板的每个孔中，直到样品完全覆盖。孵育样品1小时以固定细菌细胞。
   2. 将戊二醛吸入废瓶中，并用Tris缓冲溶液冲洗所有样品3倍，以去除非粘附细菌。
   3. 使用30%，75%和100%乙醇使样品脱水30分钟，每次¹⁶。
      注意:建议使用临界点干燥器干燥样品。在室温下风干样品24小时并不理想。
   4. 使用导电胶带（如铜或碳带）将样品固定在 SEM 短截上。在成像之前，通过溅射涂层 涂 覆样品表面以提供导电性（例如，在铂/钯（Pt/Pd）下涂覆粘附细菌的镁板45秒，20mA¹⁶）。
      注意:涂层材料、处理时间和操作电流可能因样品类型而异。
   5. 使用SEM以适当的工作距离和加速电压以及所需的放大倍率拍摄样品上的细菌图像。例如，使用带有二次电子检测器的 SEM 在 5 mm 的工作距离和 10 kV¹⁶ 的加速电压下拍摄图像。
2. 使用SEM检查培养后纳米材料样品的表面形态。
   1. 对于纳米材料，使用Tris缓冲液3x洗涤样品，以去除未附着在样品上的游离细菌。对于纳米颗粒，通过超声将颗粒分散到不影响样品特性的溶剂中，以在需要时实现更好的分散。
   2. 洗涤程序后干燥样品。
   3. 使用碳或铜双面胶带将样品粘附在 SEM 短截上。
   4. 在成像之前，如步骤6.1.4中所述，使用溅射镀膜机创建Pt/Pd的导电表面层。按照步骤 6.1.5 中所述获取示例图像。
   5. 使用EDS以适当的加速电压和所需的放大倍率（例如，在执行SEM分析后在10 kV下）分析表面元素组成¹⁶。
3. 细菌粘附的荧光成像
   1. 首先用Tris缓冲液3x洗涤，准备使用荧光显微镜观察的样品。在室温下风干样品。
   2. 按照建立的方案³⁷用10μM硫黄素T荧光染料对每个样品进行染色。
   3. 使用倒置显微镜与电子倍增电荷耦合器件数码相机耦合进行细菌粘附的荧光成像。

结果

氧化镁纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性鉴定已使用适用于不同材料类型和微生物物种的四种 体外 方法提出。

方法A和方法B在滞后期（方法A）和对数期（方法B）暴露于纳米颗粒时检查细菌活性24小时或更长时间。方法A提供了有关MIC和MBC的结果，而方法B确定了纳米颗粒的抑制作用与杀菌效果。方法C检查与纳米结构表面直接和间接接触的细菌活性，方法D检查细胞 - ?...

讨论

我们提出了四种体外方法（A-D）来表征纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性。虽然这些方法中的每一种都量化了细菌随时间推移对纳米材料的生长和活力，但用于测量初始细菌接种密度、生长和活力随时间变化的方法存在一些差异。其中三种方法，直接共培养方法（A）¹⁷，直接培养方法（C）14和聚焦接触暴露方法（D）¹⁶，通过计算每单位体积

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Milipore Sigma	Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven	MTI Corporation	BPG-7082	https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer	Sigma-Aldrich	42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE	Fisher Scientific	50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera	Hamamatsu	C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Hemocytometer	Brightline, Hausser Scientific	1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES)	PerkinElmer	8000
Inverse microscope	Nikon	Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth	Sigma Life Science	L3022
Luria Bertani Broth + agar	Sigma Life Science	L2897
MacroTube 5.0	Benchmark Scientific	C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles	US Research Nanomaterials, Inc	Stock #: US3310   M	MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance	Mettler Toledo	MS105D
Nitrocellulose paper	Fisherbrand	09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351172
Petri dish 100 mm	VWR	470210-568
Petri dish, 15 mm	Fisherbrand	FB0875713A
pH meter	VWR	SP70P
Scanning electron microscopy (SEM)	TESCAN	Vega3 SBH
Sonicator	VWR	97043-936
Table top centrifuge	Fisher Scientific	accuSpin Micro 17
Table top centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar	MP	1010617
Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
UV-Vis spectrophotometer	Tecan	Infinite 200 PRO	https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L	VWR	N/A
X-ray power defraction	Panalytical	N/A	PANalytical Empyrean Series 2