JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем четыре метода оценки антимикробной активности наночастиц и наноструктурированных поверхностей с использованием методов in vitro . Эти методы могут быть адаптированы для изучения взаимодействия различных наночастиц и наноструктурированных поверхностей с широким спектром микробных видов.

Аннотация

Антимикробная активность наночастиц и наноструктурированных поверхностей, таких как серебро, оксид цинка, диоксид титана и оксид магния, ранее изучалась в клинических и экологических условиях, а также в потребляемых пищевых продуктах. Однако отсутствие согласованности в используемых экспериментальных методах и материалах привело к противоречивым результатам, даже среди исследований одних и тех же типов наноструктур и видов бактерий. Для исследователей, которые хотят использовать наноструктуры в качестве добавки или покрытия в дизайне продукта, эти противоречивые данные ограничивают их использование в клинических условиях.

Чтобы противостоять этой дилемме, в этой статье мы представляем четыре различных метода определения антимикробной активности наночастиц и наноструктурированных поверхностей и обсуждаем их применимость в различных сценариях. Ожидается, что адаптация последовательных методов приведет к воспроизводимым данным, которые можно будет сравнивать в разных исследованиях и внедрять для различных типов наноструктур и видов микробов. Мы представляем два метода определения антимикробной активности наночастиц и два метода антимикробной активности наноструктурированных поверхностей.

Для наночастиц метод прямого совместного культивирования может быть использован для определения минимальных ингибирующих и минимальных бактерицидных концентраций наночастиц, а метод культивирования прямого воздействия может быть использован для оценки бактериостатической и бактерицидной активности в реальном времени, возникающей в результате воздействия наночастиц. Для наноструктурированных поверхностей метод прямого культивирования используется для определения жизнеспособности бактерий, косвенно и непосредственно контактирующих с наноструктурированными поверхностями, а метод воздействия с фокусированным контактом используется для изучения антимикробной активности на определенном участке наноструктурированной поверхности. Мы обсуждаем ключевые экспериментальные переменные, которые следует учитывать при дизайне исследования in vitro при определении антимикробных свойств наночастиц и наноструктурированных поверхностей. Все эти методы относительно недороги, используют методы, которые относительно просты в освоении и воспроизводимы для согласованности, и применимы к широкому спектру типов наноструктур и микробных видов.

Введение

Только в США у 1,7 миллиона человек ежегодно развивается внутрибольничная инфекция (ИСМП), причем каждая 17-я из этих инфекций приводит к смерти1. Кроме того, по оценкам, затраты на лечение ИСМП варьируются от 28 до 45 миллиардов долларов в год 1,2. В этих ИСМП преобладают метициллин-резистентные золотистые стафилококки (MRSA)3,4 и Pseudomonas aeruginosa4, которые обычно выделяются из хронических раневых инфекций и обычно требуют обширного лечения и времени для получения благоприятного исхода для пациента.

За последние несколько десятилетий было разработано несколько классов антибиотиков для лечения инфекций, связанных с этими и другими патогенными бактериями. Например, аналоги рифамицина использовались для лечения MRSA, других грамположительных и грамотрицательных инфекций и инфекций Mycobacterium spp.5. В 1990-х годах для эффективного лечения растущего числа инфекций, вызванных M. tuberculosis, дополнительные препараты были объединены с аналогами рифамицина для повышения их эффективности. Тем не менее, примерно 5% случаев M. tuberculosis остаются устойчивыми крифампицину5,6, и растет обеспокоенность в отношении бактерий с множественной лекарственной устойчивостью7. В настоящее время использование одних только антибиотиков может быть недостаточным для лечения ИСМП, и это спровоцировало постоянный поиск альтернативных антимикробных методов лечения1.

Тяжелые металлы, такие как серебро (Ag)8,9,10 и золото (Au)11, а также керамика, такая как диоксид титана (TiO2)12 и оксид цинка (ZnO)13, в форме наночастиц (NP) (AgNP, AuNP, TiO2 NP и ZnONP соответственно)были исследованы на предмет их антимикробной активности и были идентифицированы как потенциальные альтернативы антибиотикам. Кроме того, биорезорбируемые материалы, такие как магниевые сплавы (сплавы Mg)14,15,16, наночастицы оксида магния 17,18,19,20,21 и наночастицы гидроксида магния [nMgO и nMg(OH)2, соответственно]22,23,24, также были изучены. Однако в предыдущих антимикробных исследованиях наночастиц использовались противоречивые материалы и методы исследования, в результате чего данные, которые трудно или невозможно сопоставить, а иногда и противоречивы по своей природе18,19. Например, минимальная ингибирующая концентрация (MIC) и минимальная бактерицидная концентрация (MBC) наночастиц серебра значительно варьировались в разных исследованиях. Ipe et al.25 оценили антибактериальную активность AgNP со средним размером частиц ~ 26 нм для определения МИК против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Идентифицированные MIC для P. aeruginosa, E. coli, S. aureus и MRSA составляли 2 мкг / мл, 5 мкг / мл, 10 мкг / мл и 10 мкг / мл соответственно. Напротив, Parvekar et al.26 оценили AgNP со средним размером частиц 5 нм. В этом случае было обнаружено, что AgNP MIC и MBC 0,625 мг / мл эффективны против S. aureus. Кроме того, Loo et al.27 оценили AgNP размером 4,06 нм. Когда E. coli подвергалась воздействию этих наночастиц, сообщалось, что MIC и MBC составляют 7,8 мкг / мл. Наконец, Ali et al.28 исследовали антибактериальные свойства сферических AgNP со средним размером 18 нм. Когда P. aeruginosa, E. coli и MRSA подвергались воздействию этих наночастиц, MIC был идентифицирован при 27 мкг / мл, 36 мкг / мл, 27 мкг / мл и 36 мкг / мл соответственно, а MBC был идентифицирован при 36 мкг / мл, 42 мкг / мл и 30 мкг / мл соответственно.

Несмотря на то, что антибактериальная активность наночастиц широко изучалась и освещалась в течение последних десятилетий, не существует стандарта для используемых материалов и методов исследования, позволяющих проводить прямые сравнения между исследованиями. По этой причине мы представляем два метода: метод прямого совместного культивирования (метод А) и метод прямого воздействия (метод Б), чтобы охарактеризовать и сравнить антимикробную активность наночастиц при сохранении согласованности материалов и методов.

В дополнение к наночастицам, наноструктурированные поверхности также были исследованы на антибактериальную активность. К ним относятся материалы на основе углерода, такие как графеновые нанолисты, углеродные нанотрубки и графит29, а также чистые сплавы Mg и Mg. Каждый из этих материалов проявляет по крайней мере один антибактериальный механизм, включая физическое повреждение, налагаемое на клеточные мембраны материалами на основе углерода, и повреждение метаболических процессов или ДНК посредством высвобождения активных форм кислорода (АФК) при разложении Mg. Кроме того, при объединении цинка (Zn) и кальция (Ca) при образовании сплавов Mg улучшается уточнение размера зерна матрицы Mg, что приводит к снижению адгезии бактерий к поверхностям подложки по сравнению с образцами14, содержащими только Mg. Чтобы продемонстрировать антибактериальную активность, мы представляем метод прямого культивирования (метод C), который определяет адгезию бактерий к наноструктурированным материалам и вокруг них с течением времени путем количественного определения бактериальных колониеобразующих единиц (КОЕ) с прямым и косвенным поверхностным контактом.

Геометрия наноструктур на поверхностях, включая размер, форму и ориентацию, может влиять на бактерицидную активность материалов. Например, Lin et al.16 изготовили различные наноструктурированные слои MgO на поверхностях подложек Mg путем анодирования и электрофоретического осаждения (EPD). После периода воздействия на наноструктурированную поверхность in vitro рост S. aureus был существенно снижен по сравнению с необработанным Mg. Это указывает на большую эффективность наноструктурированной поверхности против бактериальной адгезии по сравнению с необработанной металлической поверхностью Mg. Для выявления различных механизмов антибактериальных свойств различных наноструктурированных поверхностей в данной статье обсуждается метод сфокусированного контактного воздействия (метод D), определяющий взаимодействия клетки с поверхностью в пределах исследуемой области.

Целью данной статьи является представление четырех методов in vitro, применимых к различным наночастицам, наноструктурированным поверхностям и микробным видам. Мы обсудим ключевые соображения для каждого метода для получения согласованных, воспроизводимых данных для сопоставимости. В частности, метод прямого совместного культивирования17 и метод прямого воздействия используются для изучения антимикробных свойств наночастиц. С помощью метода прямого совместного культивирования минимальные ингибирующие и минимальные бактерицидные концентрации (MIC и MBC90-99,99 соответственно) могут быть определены для отдельных видов, а наиболее мощная концентрация (MPC) может быть определена для нескольких видов. С помощью метода прямого воздействия бактериостатические или бактерицидные эффекты наночастиц при минимальных ингибирующих концентрациях могут быть охарактеризованы показаниями оптической плотности в реальном времени с течением времени. Метод прямого культивирования14 пригоден для исследования бактерий, непосредственно и косвенно контактирующих с наноструктурированными поверхностями. Наконец, представлен метод16 фокусированного контактного воздействия для изучения антибактериальной активности конкретной области на наноструктурированной поверхности посредством прямого применения бактерий и характеристики роста бактерий на границе раздела клетка-наноструктура. Этот метод является модифицированным по сравнению с японским промышленным стандартом JIS Z 2801:200016 и предназначен для сосредоточения внимания на взаимодействии микробов с поверхностью и исключения влияния разложения объемного образца в микробной культуре на антимикробную активность.

протокол

Чтобы представить методы прямого совместного культивирования и прямого воздействия, мы используем наночастицы оксида магния (nMgO) в качестве модельного материала для демонстрации бактериальных взаимодействий. Для представления методов прямого культивирования и сфокусированного контактного воздействия в качестве примеров мы используем сплав магния с наноструктурированными поверхностями.

1. Стерилизация наноматериалов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все наноматериалы должны быть стерилизованы или продезинфицированы перед микробной культурой. Методы, которые могут быть использованы, включают тепло, давление, излучение и дезинфицирующие средства, но допуск материалов для каждого метода должен быть определен до экспериментов in vitro .

  1. Наночастицы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить в органическом растворителе, таком как этанол, или упаковывать в посуду или коробку с последующей стерилизацией или дезинфекцией соответствующим образом. Наночастицы стерилизовали с использованием следующего метода для демонстрации метода прямого совместного культивирования17 и метода прямого воздействия.
    1. Стерилизуйте наночастицы MgO в конвекционной печи с температурой 200 °C30 в течение 60 минут перед каждым экспериментом in vitro .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был выбран потому, что водяной пар и ультрафиолетовый свет могут влиять на структуры наночастиц MgO (nMgO)17.
  2. Сыпучие материалы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наноструктурированные материалы стерилизовали следующим методом для демонстрации метода прямого культивирования.
    1. Для метода прямого культивирования14 дезинфицируют подготовленные образцы ZC21, Mg и T64 с использованием ультрафиолетового (УФ) излучения в течение 4 часов перед началом исследований in vitro .
    2. Для метода16 фокусированного контактного воздействия дезинфицируют все образцы с помощью УФ-излучения в течение 2 ч до начала исследований in vitro .
  3. В качестве альтернативы используйте окись этилена (EtO) для стерилизации термочувствительных материалов.

2. Метод прямого совместного культивирования (метод А)

ПРИМЕЧАНИЕ: В методе А бактерии в посевной культуре с лаг-фазой непосредственно смешиваются с наночастицами определенных концентраций. Для изучения антимикробной активности наночастиц мы следуем протоколу, описанному Nguyen et al.17.

  1. Характеристика наночастиц и наноструктур
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав и форма наноструктуры подтверждены с помощью дифракции рентгеновского порошка.
    1. Измерение наночастиц
      1. Взвесьте наночастицы в 9 раз больше желаемой массы на мл, чтобы разместить образцы объемом 3 мл в трех экземплярах. Например, весить 0,2 мг/мл nMgO при 1,8 мг/мл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает равномерное распределение наночастиц в бактериальных культурах и бульонах.
      2. Измерьте все наночастицы в микроцентрифужной пробирке объемом 5,0 мл, которая была предварительно взвешена и тарирована с помощью аналитических весов.
  2. Подготовка и выращивание бактериальных культур
    1. Для каждого эксперимента in vitro извлеките запасы клеток бактерий из хранилища при -80 ° C. Добавьте 10 мкл каждого запаса клеток бактерий в 5 мл подходящей питательной среды.
    2. Поместите инокулированную среду в инкубатор-шейкер при температуре 37 °C и 250 об/мин примерно на 16 часов в течение ночи.
      1. Если выращиваются виды стафилококка , субкультурируйте, помещая 400 мкл каждой ночной культуры в 20 мл свежей питательной среды (100 мкл / 5 мл среды) и инкубируйте с встряхиванием при 37 ° C и 250 об/мин в течение дополнительных 4-6 часов.
  3. Промывка и подсчет клеток бактерий для определения плотности посева
    ПРИМЕЧАНИЕ: Желаемая плотность посева 7,8 × 106 КОЕ/мл была идентифицирована как количество клеток, превышающее то, что требуется для подтверждения инфекции мочевыводящих путей.
    1. Соберите культивируемые бактерии, аликвотируя 1 мл ночной культуры бактерий в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Создайте достаточное количество аликвот из ночных бактериальных культур и центрифугируйте их в течение 10 мин при 1,956 × г , чтобы достичь желаемой плотности посева.
    2. После центрифугирования проводят пипетку, чтобы удалить надосадочную жидкость из гранулированных клеток и поместить надосадочную жидкость в емкость для сбора. Ресуспендируют клеточные гранулы в 0,5 мл свежей питательной среды. Объедините две суспензии по 0,5 мл, чтобы создать 1 мл суспензии, чтобы уменьшить количество аликвот 1 мл ресуспендированных клеток до шести. Повторить центрифугирование в течение 10 мин при дозе 1,956 × г.
    3. Завершите второй цикл промывки, используя свежую питательную среду, как показано на шаге 2.3.2, чтобы уменьшить количество 1 мл аликвот ресуспендированных промытых клеток до трех.
    4. Завершите третий цикл, как на этапе 2.3.2, за исключением ресуспендирования клеточных гранул в 0,33 мл трис-буфера (гидроксиметил)аминометанового буфера (трис-буфер, рН 8,5). Объедините три суспензии, каждая объемом 0,33 мл, в одну микроцентрифугу объемом 1,5 мл. Повторить центрифугирование в течение 10 мин при дозе 1,956 × г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трис-буфер не содержит ионов Mg 2+ или Ca2+ 31. Это важно для использования индуктивно-связанной плазменно-оптической эмиссионной спектрометрии (ICP-OES) для измерения ионов Mg 2+ и Ca2+ в посткультуральных бульонах. Напротив, фосфаты, присутствующие в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS)32, например, связывают ионы Mg 2+ или Ca2+ 33,34,35 и вызывают путаницу в интерпретации данных ICP-OES.
    5. Удалите надосадочную жидкость из гранулированных ячеек. Ресуспендируют клеточную гранулу в 1 мл свежего буфера Tris, известного как клеточная суспензия - бактериальная посевная культура с лаг-фазой.
    6. Определите концентрацию клеточной суспензии (клеток/мл) с помощью гемоцитометра.
  4. Создание посевной культуры бактерий
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец имеет общий объем 3 мл и заполняется в трех экземплярах (всего 9 мл).
    1. Определите общий объем бактерий, необходимых для посева культуры. Чтобы создать посевную культуру, используйте C 1V1 = C 2 V2, чтобы рассчитать объем клеточной суспензии, необходимый для создания посевной культуры, 7,8 × 106 клеток / мл. Расчетный объем клеточной суспензии (V1) прибавьте к требуемому объему питательных сред (V2).
    2. Определите фактическую плотность посева бактерий в КОЕ/мл. Создайте десятикратное серийное разведение до 10-4. Нанесите 10-4 разбавления на соответствующий ростовой агар и инкубируйте в течение ночи. После инкубации подсчитайте количество колоний и рассчитайте КОЕ/мл.
  5. Образование культур бактерий и наночастиц
    1. В 12-луночных полистирольных пластинах, не обработанных тканью, аликвот 2 мл бактериальной посевной культуры в каждую лунку для необходимого количества лунок.
    2. На каждую микроцентрифужную пробирку объемом 5 мл, содержащую предварительно взвешенный nMgO, добавляют 3 мл бактериальной посевной культуры. Кратковременно вихните, чтобы смешать nMgO с бактериями. Аликвотируйте 1 мл смеси в три отдельные лунки для создания тройных образцов каждой предварительно измеренной массы nMgO. Пипетка смесь бактерий / nMgO 2-3 раза перед каждым 1 мл аликвоты для поддержания nMgO в суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольные образцы будут состоять только из 3 мл клеток, 3 мл только среды и 3 мл, содержащих самые низкие и самые высокие концентрации используемых наночастиц. Они подготовлены, как показано на шаге 2.5.2. Все контрольные образцы комплектуются в трех экземплярах.
    3. Инкубируйте все 12-луночные планшеты при 37 °C и 120 об/мин в течение 24 часов.
  6. Определение роста бактериальных клеток после воздействия nMgO
    1. После ночной инкубации бактериальных культур соберите каждые 3 мл образца путем пипетки в индивидуальную коническую пробирку объемом 15 мл.
    2. Используйте 96-луночную пластину для создания последовательных разведений 1:10. Определите количество колонок, необходимых для последовательного разведения всех образцов, содержащих бактерии. Добавьте 180 мкл буфера Tris в каждую лунку в строке B в строке G для соответствующего количества столбцов.
    3. Кратковременно встряхните каждую коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую бактериальные образцы, и добавьте 50 мкл в отдельную лунку в ряду А.
    4. Для каждой лунки в ряду А перенесите 20 мкл в ряд B (например, от A1 до B1) и кратковременно перемешайте пипеткой, чтобы получить объем 200 мкл. Используя стерильный наконечник пипетки, перенесите 20 мкл из лунки в ряду B в лунку в ряду C. Продолжайте эту схему до тех пор, пока лунка в ряду G не будет содержать 200 мкл, завершение последовательного разбавления от 10−1 в ряду В до 10−6 в ряду G.
    5. Нанесите по 100 мкл каждой лунки на соответствующую пластину с ростовым агаром и распределите по пластине, чтобы диспергировать клеточную культуру. Поместите тарелки в инкубатор-шейкер на ночь при температуре 37 °C. Выдерживают пластины при 37 °C в течение 24 часов.
    6. Изучите таблички и посчитайте те, которые имеют примерно 25-300 колоний. Если возможно, выбирайте пластины с одинаковым значением разбавления. Используйте количество колоний на планшете для расчета КОЕ/мл.
  7. Оценка рН после инкубации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям производителя для каждой модели pH-метра.
    1. Предварительно откалибруйте рН-метр с помощью стандартизирующих растворов рН 4, рН 7 и рН 10. Считайте каждый бактериальный образец, поместив датчик pH в коническую пробирку объемом 15 мл.
  8. Подготовка проб для ИСП-ОЭС
    ПРИМЕЧАНИЕ: ICP-OES используется для определения концентрации ионов Mg 2+ и Ca2+. Эти катионы считаются важными, так как каждый из них участвует в клеточном метаболизме.
    1. Центрифугу каждую коническую пробирку объемом 15 мл, приготовленную на этапе 2.6.1, в течение 5 мин при 5,724 × г для гранулирования клеточного мусора и наночастиц.
    2. Используя коническую трубку объемом 15 мл, разбавьте 30 мкл надосадочной жидкости в 2,97 мл 18,2 Ω фильтрованной воды, чтобы получить разведение 1:100.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент разбавления может быть скорректирован на основе прогнозируемых концентраций ионов и предела обнаружения спектрометрического прибора.
    3. Ознакомьтесь с примерами с помощью ICP-OES.

3. Метод прямого воздействия (метод Б)

ПРИМЕЧАНИЕ: Если скорость роста выбранных бактерий неизвестна, то стандартизация кривой роста должна быть завершена до внедрения этого метода.

  1. Определите бактериостатическую и бактерицидную активность в реальном времени при воздействии интересующих наночастиц.
    1. Получают желаемые концентрации наночастиц с использованием способов, описанных в шаге 2.1-2.1.2.2. Подготовьте два набора каждой массы наночастиц для использования: один для добавления к 3 мл аликвот культуры бактерий в логарифмической фазе роста, а другой для добавления к 3 мл аликвот питательной среды без бактерий в качестве контрольных групп.
    2. Определите подходящие бактериостатические и бактерицидные антибиотики для тестируемых видов бактерий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется знание минимальной ингибирующей концентрации для каждого антибиотика.
  2. Рассчитайте общий объем бактериальной культуры, необходимый для трех образцов объемом 3 мл для всех образцов наночастиц, антибиотиков и контрольных образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется равный объем стерильной питательной среды. Если планируется использование спектрофотометрии, это требует корректировки общего объема, необходимого для размещения объема от 0,5 мл до 1,0 мл, необходимого для кювет.
  3. День 1: Для каждого эксперимента in vitro создайте ночные запасы, следуя шагу 2.2.1-2.2.2.
  4. День 2: Убедитесь, что настройки считывателя пластин могут вместить 96-луночную пластину с оптической плотностью 600 нм. Измерьте образцы в аликвотах 200 мкл с помощью 96-луночного планшета.
    1. Определяют начальную бактериальную культуру OD600 при 0,01-й плотности, используемой для начала начального инкубационного периода до добавления наночастиц и антибиотиков.
    2. Соберите ночную культуру бактерий из инкубатора-шейкера.
      1. Для каждого материала (например, предварительно измеренных наночастиц или антибиотиков), подлежащего испытанию, создайте отдельную бактериальную культуру с OD600 0,01. Используйте контейнер, достаточно большой, чтобы вместить необходимый объем клеточной культуры (например, стерилизованную колбу Эрленмейера или конические пробирки объемом 50 мл).
      2. Разбавляют ночные бактериальные образцы питательной средой, помещая три 200 мкл аликвот питательной среды в три лунки и три аликвоты бактериальной культуры по 200 мкл в дополнительные лунки (например, от A1 до A6).
      3. Поместите пластину с 96 лунками в считыватель пластин и отсканируйте ее.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Показания усредняются для каждой сканируемой скважины, чтобы получить среднее значение.
      4. Чтобы рассчитать плотность бактерий во взвешенном состоянии, усредните среднее значение для каждой лунки, содержащей образец в трех экземплярах.
      5. Чтобы определить оптическую плотность бактерий, вычтите среднее значение образца бульона из среднего бактериального значения.
      6. Если необходимо продолжать регулировать бактериальную суспензию, продолжайте добавлять бульон или бактериальную культуру на ночь по мере необходимости и повторяйте сканирование в считывателе планшетов по мере необходимости до тех пор, пока OD600 не будет достигнут приблизительно 0,01.
      7. Инкубировать при 37 °C при встряхивании при 150 об/мин до достижения логарифмического роста.
  5. Извлеките бактериальные культуры из шейкера инкубатора.
    1. Аликвота 3 мл бактериальной культуры OD600 0,01 в меченые конические пробирки объемом 15 мл для тестовых и контрольных образцов в трех экземплярах.
    2. Аликвот 200 мкл бактериальной культуры в три лунки 96-луночного планшета и измерьте образцы с помощью планшетного считывателя.
    3. Рассчитайте показания, как описано ранее на шаге 3.4.2.2 и этапе 3.4.2.6 - "показания -0,5 ч".
  6. Создание и измерение смесей бактерий и наночастиц
    1. Аликвотировать 3 мл стерильной питательной среды в равных количествах с бактериальными культурами в меченые конические пробирки по 15 мл для контрольных образцов (в трех экземплярах).
    2. Для приготовления суспензий бактерий / наночастиц и стерильных сред / суспензий наночастиц удалите 1 мл бактериальной культуры или среды из каждого тройного набора конических пробирок объемом 15 мл.
      1. Поместите аликвоты объемом 1 мл в центрифужную пробирку объемом 5 мл, содержащую предварительно измеренные наночастицы, и ненадолго перемешайте.
      2. Из центрифужной пробирки объемом 5 мл верните 1 мл аликвот суспензий бактерий/наночастиц или среды/наночастиц в коническую пробирку объемом 15 мл для однородного распределения наночастиц.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетируйте смесь бактерий и наночастиц 2x-3x перед тем, как каждая аликвота объемом 1 мл будет пипетирована, чтобы поддерживать наночастицы во взвешенном состоянии.
  7. Создание и измерение смесей бактерий и антибиотиков
    1. Для создания бактериальных/антибиотических культур аликвотируют 3 мл инкубированной бактериальной культуры в соответственно меченые конические пробирки объемом 15 мл.
    2. После того, как все образцы подготовлены, аликвотируйте 200 мкл каждого образца в отдельные лунки 96-луночного планшета.
    3. Поместите планшет(ы) в считыватель пластин и начните сканирование - показания «0 ч».
    4. Поместите конические пробирки объемом 15 мл с образцами в инкубатор-шейкер при температуре 37 °C и 150 об/мин. Запишите все данные, как описано ранее на шагах 3.4.2.2 и 3.4.2.6.
  8. Примерно через 15 минут после завершения показаний 0 ч повторите шаги, описанные в шагах 3.7.2-3.7.3 - показания «0,5 ч».
    1. По истечении установленных 0 ч повторяйте шаги, описанные в шаге 3.7.2-шаге 3.7.3 каждые 90 мин в течение шести циклов; Завершите за 9 ч.
    2. После завершения шестого цикла поместите образцы в инкубатор-шейкер еще на 15 ч при 37 °C и 150 об/мин. Повторите шаги, описанные в шагах 3.7.2-3.7.3, чтобы получить показания за 24 часа. Запишите все данные, как описано ранее на шагах 3.4.2.2 и 3.4.2.6.

4. Метод прямого культивирования (метод С)

ПРИМЕЧАНИЕ: В методе С бактерии в посевной культуре с лаг-фазой помещают непосредственно на наноструктурированные поверхности, представляющие интерес. Для изучения антимикробной активности наноструктур мы следуем протоколу, описанному Zhang et al.14. Чтобы продемонстрировать этот метод прямого культивирования, в качестве образцов использовали ZC21 (сплав Mg-Zn-Ca) и штифты Mg.

  1. Подготовка и выращивание бактериальных культур
    1. Для каждого эксперимента in vitro создайте запасы на ночь, следуя шагу 2.2.1-2.2.2.
  2. Промывка и подсчет бактерий для определения плотности посева
    ПРИМЕЧАНИЕ: Желаемая плотность посева 7,5 × 105 КОЕ/мл была идентифицирована как зарегистрированная концентрация клеток, вызывающая ортопедические инфекции14.
    1. Извлеките бактериальную культуру на ночь из инкубатора-шейкера.
    2. Вымойте и соберите бактерии, следуя шагам 2.3.2-2.3.2.3, но замените свежую среду пересмотренной смоделированной жидкостью организма (rSBF) для каждого этапа промывки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: rSBF представляет собой буферный раствор, который имитирует ионную концентрацию плазмы крови человека. Однако rSBF содержит только неорганические соединения и не содержит каких-либо биоорганических соединений, таких как белки. Чтобы решить эту проблему, эмбриональную бычью сыворотку (FBS) комбинируют с rSBF для моделирования состава крови человека, чтобы лучше имитировать естественное образование апатита в кальцинированных тканях в экспериментальных условиях36.
    3. Удалите надосадочную жидкость из гранулированных ячеек. Ресуспендируют клеточную гранулу в 1 мл rSBF с добавлением 10% FBS-клеточной суспензии.
    4. Определите концентрацию клеточной суспензии (клеток/мл) с помощью гемоцитометра. Разбавьте клеточную суспензию до концентрации 7,5 ×10,5 клеток/мл в rSBF с добавлением 10% FBS. Создайте посевную культуру, следуя шагу 2.4.1.
    5. Определите фактическую плотность посева, выполнив шаг 2.4.2.
  3. Распределите суспензию бактериальных клеток по образцам в культуральных лунках.
    1. Поместите как образцы, так и контрольные образцы в отдельные лунки 48-луночной полистирольной пластины, не обработанной тканью.
    2. Аликвота 0,75 мл клеточной суспензии в каждую лунку, содержащую образцы и контроль. Поместите 48-луночные пластины в инкубатор-шейкер на 24 часа при 37 °C, встряхивая при 120 об/мин.
  4. Характеристика бактериальной концентрации
    1. После 24 часов инкубации соберите образцы и поместите их в отдельные пробирки с маркировкой.
    2. Соберите по два образца из каждой группы и поместите их по отдельности в маркированные микроцентрифужные пробирки объемом 5,0 мл. Добавьте 2 мл rSBF в каждую пробирку.
    3. Поместите образцы, собранные на шаге 4.4.2, в ванну для обработки ультразвуком и обрабатывайте ультразвуком в течение 10 минут. После каждых 5 минут перемешивайте каждый образец в течение 5 с.
    4. Соберите rSBF, содержащий только что отделившиеся бактериальные клетки, и поместите суспензию в маркированную свежую микроцентрифужную пробирку.
  5. Серийные разведения и нанесение гальванического покрытия бактериями
    1. Последовательно разбавляют и наносят бактериальную суспензию, следуя этапу 2.6.2-2.6.6.
  6. Оцените рН питательных сред после инкубации, выполнив шаг 2.7.
  7. Подготовьте посткультуральную среду для ICP-OES, следуя методам, описанным в шаге 2.8.

5. Метод сфокусированного контактного воздействия (метод D)

ПРИМЕЧАНИЕ: В методе D бактерии на нитроцеллюлозной фильтровальной бумаге находятся в непосредственном контакте с интересующей областью на наноструктурированных поверхностях. Этот метод сводит к минимуму вмешательство деградации объемных образцов в бактериальных культурах с бактериальной активностью. Для изучения антимикробной активности наноповерхности мы следуем протоколу, описанному Lin et al.16.

  1. Следуйте процедурам, описанным в шаге 2.2.1-2.2.2.1, чтобы создать бактериальную посевную культуру. Подтвердите фактическую плотность посева, выполнив шаг 2.4.2.
  2. Подготовьте образцы размером 1 × 1 см2 в квадратной форме. Подготовьте все типы образцов в трех экземплярах. При необходимости поместите образцы на трехмерный (3D) держатель диаметром 15 мм и высотой 10 мм. Поместите образец и держатель в лунку из полистирольной пластины, не обработанной культурой ткани.
  3. Подготовьте стерилизованную нитроцеллюлозную бумагу, обрезав каждую до диаметра 1 см. Поместите подготовленную нитроцеллюлозную бумагу на агаровую пластину, содержащую соответствующую среду.
  4. Пипетка 50 мкл разбавленной бактериальной культуры на фильтровальную бумагу.
  5. Пипетка 50 мкл соответствующей среды на центр каждой поверхности образца.
  6. С помощью стерилизованного пинцета соберите нитроцеллюлозную бумагу с поверхности агара. Осторожно переверните нитроцеллюлозную бумагу и поместите ее на поверхность образца так, чтобы бактерии находились в контакте с 50 мкл среды и интересующей наноструктурированной поверхностью.
  7. Добавьте 1 мл буфера Tris в каждую лунку, содержащую образец, для поддержания влажности. Инкубируйте пластину из полистирольной скважины, содержащую все образцы, при температуре 37 °C в течение 24 часов.
  8. Соберите нитроцеллюлозную бумагу с каждой поверхности образца. Поместите каждый в 5 мл буфера Tris. Вихревая собранные образцы фильтровальной бумаги и наноповерхностного материала в течение 5 с.
  9. Обрабатывайте ультразвуком каждый образец в течение 10 минут. Вихрь в течение 5 с через 5 мин и снова через 10 мин.
  10. Соберите суспензию буфера Tris из всех образцов и поместите каждый объем в отдельные пробирки для сбора свежих продуктов.
  11. Серийно разбавляют и накрывают образцы в соответствии с этапом 2.6.2-2.6.6.

6. Посткультуральная характеристика бактерий и наноматериалов

  1. Исследование адгезии и морфологии бактерий с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)
    1. После ночной инкубации добавьте 10% глутарового альдегида в каждую лунку 48-луночной пластины из полистирола, не обработанного тканью, до тех пор, пока образцы не будут полностью покрыты. Инкубируют образцы в течение 1 ч, чтобы зафиксировать бактериальные клетки.
    2. Аспирируйте глутаровый альдегид в мусорную бутылку и промойте все образцы 3 раза буферным раствором Tris, чтобы удалить неприлипшие бактерии.
    3. Обезвоживайте образцы, используя 30%, 75% и 100% этанол в течение 30 мин каждый16.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для сушки образцов рекомендуется использовать сушилку в критических точках. Сушка образцов на воздухе при комнатной температуре в течение 24 часов не является идеальной.
    4. Используйте проводящие клейкие ленты, такие как медные или углеродные ленты, чтобы закрепить образцы на заглушке SEM. Покройте поверхности образца напылением , чтобы обеспечить проводимость перед визуализацией (например, покройте планшеты Mg прилипшими бактериями под платиной/палладием (Pt/Pd) в течение 45 с при 20 мА16).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы покрытия, время обработки и рабочий ток могут варьироваться в зависимости от типа образца.
    5. Сделайте снимки бактерий на образцах с помощью SEM с соответствующим рабочим расстоянием и ускоряющим напряжением и с желаемым увеличением. Например, используйте СЭМ со вторичным электронным детектором для получения изображений на рабочем расстоянии 5 мм и ускоряющем напряжении10 кВ 16.
  2. Изучить морфологию поверхности образцов посткультурных наноматериалов с помощью СЭМ.
    1. Для наноматериалов промойте образцы с помощью буфера Tris 3x, чтобы удалить свободные бактерии, которые не прикреплены к образцу. Для наночастиц диспергируйте частицы в растворитель, который не влияет на свойства образца с помощью ультразвука, чтобы добиться лучшей дисперсии, когда это необходимо.
    2. Высушите образцы после процедуры стирки.
    3. Используйте углеродные или медные двусторонние клейкие ленты для приклеивания образцов к заглушке SEM.
    4. Перед получением изображения создайте проводящий поверхностный слой Pt/Pd с помощью напыляющего покрытия, как описано на шаге 6.1.4. Возьмите образцы изображений, как описано в шаге 6.1.5.
    5. Проанализируйте элементный состав поверхности с помощью EDS с соответствующим ускоряющим напряжением и при желаемом увеличении (например, при 10 кВ после выполнения СЭМ-анализа16).
  3. Флуоресцентная визуализация бактериальной адгезии
    1. Подготовьте образцы для визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии, предварительно промыв их буфером Tris 3x. Высушите образцы на воздухе при комнатной температуре.
    2. Окрашивают каждый образец флуоресцентным красителем тиофлавина Т 10 мкМ в соответствии с установленным протоколом37.
    3. Выполняйте флуоресцентную визуализацию бактериальной адгезии с помощью инвертированного микроскопа в сочетании с цифровой камерой устройства с электронно-умножающим зарядом и зарядовой связью.

Результаты

Идентификация антибактериальной активности наночастиц оксида магния и наноструктурированных поверхностей была представлена с использованием четырех методов in vitro , которые применимы к различным типам материалов и микробным видам.

Метод А и метод В исследуют акти?...

Обсуждение

Мы представили четыре метода in vitro (A-D) для характеристики антибактериальной активности наночастиц и наноструктурированных поверхностей. В то время как каждый из этих методов количественно оценивает рост и жизнеспособность бактерий с течением времени в ответ на наноматериалы, су?...

Раскрытие информации

Конфликт интересов у авторов отсутствует.

Благодарности

Авторы высоко ценят финансовую поддержку со стороны Национального научного фонда США (награда NSF CBET 1512764 и NSF PIRE 1545852), Национальных институтов здравоохранения (NIH NIDCR 1R03DE028631), стипендии Калифорнийского университета (UC) Regents Faculty Development Fellowship, гранта Комитета по исследованиям (Huinan Liu) и гранта программы наставничества для выпускников UC-Riverside, присужденного Патрисии Холт-Торрес. Авторы высоко ценят помощь, оказанную Центральным центром расширенной микроскопии и микроанализа (CFAMM) в Калифорнийском университете в Риверсайде в использовании SEM / EDS и доктором Перри Чунгом в использовании XRD. Авторы также хотели бы поблагодарить Морган Элизабет Натор и Самхиту Тумкур за их помощь в экспериментах и анализе данных. Любые мнения, выводы, заключения или рекомендации, выраженные в этой статье, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Национального научного фонда или Национальных институтов здравоохранения.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeMilipore SigmaZ336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven MTI CorporationBPG-7082https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer Sigma-Aldrich 42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADEFisher Scientific50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera HamamatsuC9100-13
Falcon 15 mL conical tubesFisher Scientific14-959-49B
GluteraldehydeSigma-Aldrich G5882
HemocytometerBrightline, Hausser Scientific1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES)PerkinElmer8000
Inverse microscopeNikonEclipse Ti-S
Luria Bertani BrothSigma Life Science L3022
Luria Bertani Broth + agarSigma Life Science L2897
MacroTube 5.0  Benchmark ScientificC1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticlesUS Research Nanomaterials, IncStock #: US3310   MMgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro BalanceMettler ToledoMS105D
Nitrocellulose paperFisherbrand09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plateFalcon Corning Brand 351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plateFalcon Corning Brand 351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plateFalcon Corning Brand 351172
Petri dish 100 mmVWR470210-568
Petri dish, 15 mmFisherbrandFB0875713A
pH meterVWRSP70P
Scanning electron microscopy (SEM)TESCAN Vega3 SBH
SonicatorVWR97043-936
Table top centrifugeFisher ScientificaccuSpin Micro 17
Table top centrifuge EppendorfCentrifuge 5430
Tryptic Soy AgarMP1010617
Tryptic Soy BrothSigma-Aldrich22092-500G
UV-Vis spectrophotometer TecanInfinite 200 PROhttps://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10LVWRN/A
X-ray power defraction PanalyticalN/APANalytical Empyrean Series 2

Ссылки

  1. Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections - An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
  2. O'Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials. Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).
  3. Li, B., Webster, T. J. Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).
  4. Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).
  5. Adams, R. A. Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure. The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).
  6. Harding, E. WHO global progress report on tuberculosis elimination. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19 (2020).
  7. Baptista, P. V. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-"A battle of the titans". Frontiers in Microbiology. 9, 1441 (2018).
  8. Seong, M., Lee, D. G. Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction. Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).
  9. Dasgupta, N., Ramalingam, C. Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).
  10. Su, H. L. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay. Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).
  11. Cui, Y. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).
  12. Ranjan, S., Ramalingam, C. Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).
  13. Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).
  14. Zhang, C. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).
  15. Lock, J. Y. Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).
  16. Lin, J., Nguyen, N. -. Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates. ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).
  17. Nguyen, N. -. Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms. Scientific Reports. 8 (1), 16260 (2018).
  18. Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications. Materials Letters. 166, 19-22 (2016).
  19. He, Y. Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54 (2016).
  20. Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties. Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).
  21. Hayat, S. In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria. Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).
  22. Dong, C. Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent. Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).
  23. Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles. Biomimetics. 4 (2), 41 (2019).
  24. Pan, X. Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2. ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).
  25. Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics. Frontiers in Microbiology. 11, 1074 (2020).
  26. Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus. Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).
  27. Loo, Y. Y. In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 9, 1555 (2018).
  28. Ali, K. Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates. PLoS One. 10 (7), e0131178 (2015).
  29. Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures. Materials. 10 (9), 1066 (2017).
  30. MTI Corporation. . 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18"x16"x18", 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) - BPG-7082. , (2022).
  31. CHEBI. . Tris (CHEBI:9754). , (2023).
  32. . Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).
  33. Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems. Water Research. 45, 3744-3752 (2011).
  34. Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems. Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).
  35. Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-Römer, R., Feyerabend, F. Magnesium degradation under physiological conditions - Best practice. Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).
  36. Oyane, A., et al. Preparation and assessment of revised simulated body fluids. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).
  37. Xia, B., et al. Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging. Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).
  38. Pankey, G. A., Sabath, L. D. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).
  39. Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions. Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

194MICMBC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены