시험관 내에서 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성 평가

요약

시험관 내 기술을 사용하여 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성을 평가하는 네 가지 방법을 소개합니다. 이러한 방법은 다양한 나노 입자 및 나노 구조 표면과 광범위한 미생물 종의 상호 작용을 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

초록

은, 산화 아연, 이산화 티타늄 및 산화 마그네슘과 같은 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성은 이전에 임상 및 환경 환경과 소모성 식품에서 탐구되었습니다. 그러나 사용된 실험 방법과 재료의 일관성 부족은 동일한 나노 구조 유형과 박테리아 종에 대한 연구 사이에서도 상충되는 결과를 낳았습니다. 나노 구조를 제품 설계에서 첨가제 또는 코팅으로 사용하려는 연구자의 경우 이러한 상충되는 데이터는 임상 환경에서의 활용을 제한합니다.

이 딜레마에 맞서기 위해 이 기사에서는 나노 입자와 나노 구조 표면의 항균 활성을 결정하는 네 가지 방법을 제시하고 다양한 시나리오에서 적용 가능성에 대해 논의합니다. 일관된 방법을 적용하면 연구 전반에 걸쳐 비교하고 다양한 나노 구조 유형 및 미생물 종에 대해 구현할 수 있는 재현 가능한 데이터로 이어질 것으로 예상됩니다. 나노입자의 항균 활성을 결정하는 두 가지 방법과 나노 구조 표면의 항균 활성을 결정하는 두 가지 방법을 소개합니다.

나노 입자의 경우, 직접 공동 배양 방법을 사용하여 나노 입자의 최소 억제 및 최소 살균 농도를 결정할 수 있으며, 직접 노출 배양 방법을 사용하여 나노 입자 노출로 인한 실시간 정균 대 살균 활성을 평가할 수 있습니다. 나노 구조 표면의 경우, 직접 배양 방법은 나노 구조 표면과 간접적으로 직접 접촉하는 박테리아의 생존 가능성을 결정하는 데 사용되며, 초점 접촉 노출 방법은 나노 구조 표면의 특정 영역에서 항균 활성을 검사하는 데 사용됩니다. 우리는 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 특성을 결정할 때 시험관 내 연구 설계를 위해 고려해야 할 주요 실험 변수에 대해 논의합니다. 이러한 모든 방법은 상대적으로 비용이 저렴하고 비교적 마스터하기 쉽고 일관성을 위해 반복 가능한 기술을 사용하며 광범위한 나노 구조 유형 및 미생물 종에 적용할 수 있습니다.

서문

미국에서만 매년 170만 명이 병원 획득 감염(HAI)을 일으키며, 이 중 17건 중 1건이 사망에 이른다¹. 또한 HAI의 치료 비용은 연간 280억 달러에서 450억 달러에 이르는 것으로 추정됩니다 ^1,2. 이러한 HAI는 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)^3,4 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa⁾⁴에 의해 우세하며^, 이들은 일반적으로 만성 상처 감염으로부터 분리되며, 일반적으로 유리한 환자 결과를 얻기 위해 광범위한 치료와 시간이 필요합니다.

지난 수십 년 동안 이러한 박테리아 및 기타 병원성 박테리아와 관련된 감염을 치료하기 위해 여러 항생제 종류가 개발되었습니다. 예를 들어, 리파마이신 유사체는 MRSA, 다른 그람 양성 및 그람 음성 감염, 및 Mycobacterium spp. 감염을 치료하기 위해 사용되어 왔다⁵. 1990년대에는 증가하는 M. tuberculosis 감염을 효과적으로 치료하기 위해 추가 약물을 리파마이신 유사체와 결합하여 효과를 높였습니다. 그러나, 결핵균 감염자의 약 5%는리팜피신^에 내성이 남아 있으며^5,6, 다제내성균에 대한 우려가 증가하고 있다7. 현재, 항생제 단독으로는 HAI 치료에 충분하지 않을 수 있으며, 이로 인해 대체 항균 요법에 대한 지속적인 연구가 촉발되었다¹.

은(Ag)^8,9,10 및 금(Au)11과 같은 중금속과 이산화티타늄(TiO2)12 및 산화아연(ZnO)¹³과 같은 세라믹은 나노입자(NP) 형태(각각 AgNP, AuNP, ^TiO2 NP 및 ZnONP)는 항균 활성에 대해 조사되었으며 잠재적인 항생제 대안으로 확인되었습니다. 또한, 마그네슘 합금 (Mg 합금) 14,15,16, 산화 마그네슘 나노 입자 17,18,19,20,21 및 수산화 마그네슘 나노 입자 [각각 nMgO 및 nMg (OH) ₂]22,23,24 , 또한 조사되었습니다. 그러나 나노 입자에 대한 이전의 항균 연구는 일관되지 않은 재료와 연구 방법을 사용하여 비교하기 어렵거나 불가능하고 때로는 본질적으로 모순되는 데이터를 생성했습니다^18,19. 예를 들어,은 나노 입자의 최소 억제 농도 (MIC)와 최소 살균 농도 (MBC)는 다른 연구에서 크게 달랐다. Ipe et ^al.25는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 MIC를 결정하기 위해 ~26nm의 평균 입자 크기를 갖는 AgNP의 항균 활성을 평가했습니다. 녹농균, 대장균, 황색포도상구균 및 MRSA에 대해 확인된 MIC는 각각 2μg/mL, 5μg/mL, 10μg/mL 및 10μg/mL였습니다. 대조적으로, Parvekar et ^al.26은 평균 입자 크기가 5nm인 AgNP를 평가했습니다. 이 경우 AgNP MIC와 0.625mg/mL의 MBC가 S. 아우레우스에 효과적인 것으로 밝혀졌습니다. 또한, Loo et ^al.27은 4.06 nm 크기의 AgNPs를 평가하였다. 대장균이 이러한 나노 입자에 노출되었을 때 MIC와 MBC는 7.8 μg / mL로보고되었습니다. 마지막으로 Ali et ^al.28은 평균 크기가 18nm인 구형 AgNP의 항균 특성을 조사했습니다. 녹농균, 대장균 및 MRSA가 이들 나노입자에 노출되었을 때, MIC는 각각 27 μg/mL, 36 μg/mL, 27 μg/mL 및 36 μg/mL에서 확인되었고, MBC는 각각 36 μg/mL, 42 μg/mL 및 30 μg/mL에서 확인되었다.

나노 입자의 항균 활성은 최근 수십 년 동안 광범위하게 연구되고 보고되었지만 연구 전반에 걸쳐 직접 비교할 수 있는 재료 및 연구 방법에 대한 표준은 없습니다. 이러한 이유로 우리는 재료와 방법을 일관되게 유지하면서 나노 입자의 항균 활성을 특성화하고 비교하기 위해 직접 공동 배양 방법 (방법 A)과 직접 노출 방법 (방법 B)의 두 가지 방법을 제시합니다.

나노 입자 외에도 나노 구조 표면도 항균 활성에 대해 조사되었습니다. 여기에는 그래핀 나노시트, 탄소 나노튜브, 흑연²⁹와 같은 탄소 기반 재료와 순수 Mg 및 Mg 합금이 포함됩니다. 이들 물질 각각은 탄소 기반 물질에 의해 세포막에 가해지는 물리적 손상 및 Mg가 분해될 때 활성 산소종(ROS)의 방출을 통한 대사 과정 또는 DNA 손상을 포함하여 적어도 하나의 항균 메커니즘을 나타냈습니다. 또한, 아연(Zn)과 칼슘(Ca)이 Mg 합금의 형성에 결합될 때, Mg 매트릭스 입자 크기의 미세화가 향상되고, 이는 Mg-단독 샘플(¹⁴)에 비해 기판 표면에 대한 박테리아 접착의 감소로 이어진다. 항균 활성을 입증하기 위해 직접 및 간접 표면 접촉을 통한 박테리아 집락 형성 단위(CFU)의 정량화를 통해 시간 경과에 따른 나노 구조 물질 위와 주변의 박테리아 부착을 결정하는 직접 배양 방법(방법 C)을 제시합니다.

크기, 모양 및 방향을 포함한 표면의 나노 구조의 기하학은 재료의 살균 활성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, Lin et ^al.16 은 양극 산화 및 전기 영동 증착 (EPD)을 통해 Mg 기판의 표면에 상이한 나노 구조 MgO 층을 제조했다. 시험관 내에서 나노구조화된 표면에 일정 기간 노출된 후, S. 아우레우스 의 성장은 처리되지 않은 Mg에 비해 실질적으로 감소되었다. 이것은 처리되지 않은 금속 Mg 표면에 비해 박테리아 접착에 대한 나노 구조 표면의 더 큰 효능을 나타냅니다. 다양한 나노 구조 표면의 항균 특성의 다양한 메커니즘을 밝히기 위해 관심 영역 내에서 세포-표면 상호 작용을 결정하는 집속 접촉 노출 방법(방법 D)이 이 기사에서 논의됩니다.

이 기사의 목적은 서로 다른 나노 입자, 나노 구조 표면 및 미생물 종에 적용 할 수있는 4 가지 시험관 내 방법을 제시하는 것입니다. 비교 가능성을 위해 일관되고 재현 가능한 데이터를 생성하기 위해 각 방법에 대한 주요 고려 사항에 대해 논의합니다. 구체적으로, 나노입자의 항균성을 조사하기 위해 직접공배양법(¹⁷)과 직접노광법이 사용된다. 직접 공동 배양 방법을 통해 개별 종에 대해 최소 억제 및 최소 살균 농도(각각 MIC 및 MBC_90-99.99)를 결정할 수 있으며 여러 종에 대해 가장 강력한 농도(MPC)를 결정할 수 있습니다_. 직접 노출 방법을 통해 최소 억제 농도에서 나노 입자의 정균 또는 살균 효과는 시간 경과에 따른 실시간 광학 밀도 판독값으로 특성화할 수 있습니다. 직접 배양¹⁴ 방법은 나노 구조 표면과 직접 및 간접적으로 접촉하는 박테리아를 검사하는 데 적합합니다. 마지막으로, 박테리아의 직접 적용과 세포-나노 구조 계면에서의 박테리아 성장의 특성화를 통해 나노 구조 표면의 특정 영역의 항균 활성을 조사하기 위해 초점 접촉 노출¹⁶ 방법이 제시됩니다. 이 방법은 일본 산업 표준 JIS Z 2801:2000¹⁶에서 수정되었으며 미생물-표면 상호 작용에 초점을 맞추고 미생물 배양에서 벌크 샘플 분해가 항균 활성에 미치는 영향을 배제하기 위한 것입니다.

프로토콜

직접 공동 배양 및 직접 노출 방법을 제시하기 위해 산화 마그네슘 나노 입자 (nMgO)를 모델 재료로 사용하여 박테리아 상호 작용을 입증합니다. 직접 배양 및 집중 접촉 노출 방법을 제시하기 위해 나노 구조 표면이 있는 Mg 합금을 예로 사용합니다.

1. 나노 물질의 살균

참고: 모든 나노 물질은 미생물 배양 전에 멸균 또는 소독해야 합니다. 사용할 수 있는 방법에는 열, 압력, 방사선 및 소독제가 포함되지만 시험관 내 실험 전에 각 방법에 대한 재료의 허용 오차를 확인해야 합니다.

1. 나노 입자
   알림: 샘플은 에탄올과 같은 유기 용매에 보관하거나 접시나 상자에 포장한 다음 적절한 방식으로 멸균 또는 소독할 수 있습니다. 나노입자는 직접공배양법¹⁷ 과 직접노광법의 실증을 위해 다음과 같은 방법을 이용하여 멸균하였다.
   1. MgO 나노입자를 200°C 컨벡션 오븐^{30에서 60} 분 동안 멸균하여 각 in vitro 실험에 앞서 수행하였다.
      참고: 이 방법은 수증기와 자외선이 MgO 나노입자(nMgO)¹⁷의 구조에 영향을 미칠 수 있기 때문에 선택되었습니다.
2. 벌크 재료
   참고: 나노 구조 물질은 직접 배양 방법을 시연하기 위해 다음과 같은 방법으로 멸균되었습니다.
   1. 직접 배양 방법¹⁴의 경우, 시험관 내 연구를 시작하기 전에 자외선(UV) 방사선을 사용하여 준비된 ZC21, Mg 및 T64 샘플을 4시간 동안 소독합니다.
   2. 초점 접촉 노출 방법¹⁶의 경우, 시험관 내 연구를 시작하기 전에 2시간 동안 UV 방사선을 사용하여 모든 샘플을 소독합니다.
3. 또는 열에 민감한 물질의 살균을 위해 에틸렌 옥사이드(EtO)를 사용합니다.

2. 직접 공배양법(방법 A)

참고: 방법 A에서는 지연 단계 파종 배양의 박테리아가 특정 농도의 나노 입자와 직접 혼합됩니다. 나노 입자 항균 활성을 검사하기 위해 Nguyen et ^al.17에 의해 설명 된 프로토콜을 따릅니다.

1. 나노입자 및 나노구조의 특성화
   참고: 나노 구조 조성 및 형태는 X선 분말 회절을 사용하여 확인됩니다.
   1. 나노 입자의 측정
      1. 3mL 샘플을 세 번 수용하기 위해 mL당 원하는 질량의 9배로 나노입자의 무게를 잰다. 예를 들어, 1.8mg/mL에서 0.2mg/mL nMgO의 무게를 잰다.
         참고: 이것은 박테리아 배양물과 국물에서 나노 입자의 일관된 분포를 보장합니다.
      2. 분석 저울을 사용하여 미리 칭량하고 타르를 처리한 5.0mL 미세 원심분리기 튜브에서 모든 나노 입자를 측정합니다.
2. 박테리아 배양 준비 및 성장
   1. 각각의 시험관내 실험에 대해, -80°C에서 저장고로부터 박테리아 세포 스톡을 회수한다. 각 박테리아 세포 스톡 10μL를 적절한 성장 배지 5mL에 추가합니다.
   2. 접종된 배지를 37°C 및 250rpm에서 하룻밤 동안 인큐베이터-셰이커에 넣습니다.
      1. 포도상구균 종이 자란 경우 각 하룻밤 배양액 400μL를 20mL의 신선한 성장 배지(100μL/5mL 배지)에 넣고 추가로 4-6시간 동안 37°C 및 250rpm에서 진탕하면서 배양합니다.
3. 파종 밀도를 결정하기 위해 박테리아 세포를 세척하고 계수합니다
   참고: 7.8 × 10⁶ CFU/mL의 원하는 파종 밀도는 요로 감염을 확인하는 데 필요한 것보다 큰 세포 수로 확인되었습니다.
   1. 하룻밤 동안 배양된 박테리아 1mL를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 분취하여 배양된 박테리아를 수집합니다. 하룻밤 박테리아 배양에서 충분한 수의 분취량을 생성하고 원하는 파종 밀도에 도달하기 위해 1,956 × g 에서 10 분 동안 원심 분리합니다.
   2. 원심분리 후, 펠릿화된 세포로부터 상청액을 제거하기 위해 피펫팅하고, 상청액을 수집 용기에 넣는다. 세포 펠릿을 0.5mL의 신선한 성장 배지에 재현탁합니다. 2개의 0.5mL 현탁액을 결합하여 1mL의 현탁액을 만들어 재현탁 세포의 1mL 분취량 수를 6개로 줄입니다. 1,956 × g에서 10 분 동안 원심 분리를 반복한다.
   3. 단계 2.3.2에서와 같이 신선한 성장 배지를 사용하여 두 번째 세척 사이클을 완료하여 재현탁된 세척된 세포의 1mL 분취량 수를 3개로 줄입니다.
   4. 세포 펠렛을 0.33 mL의 트리스 완충액(Tris buffer, pH 8.5)에 재현탁시키는 것을 제외하고는 단계 2.3.2에서와 같이 3차 사이클을 완료한다. 각각 0.33mL 부피의 3개의 현탁액을 하나의 1.5mL 미세원심분리기로 결합합니다. 1,956 × g에서 10 분 동안 원심 분리를 반복한다.
      참고: 트리스 완충액에는 Mg 2+ 또는 Ca²⁺ 이온³¹이 포함되어 있지 않습니다. 이는 유도 결합 플라즈마-광학 방출 분광법(ICP-OES)을 사용하여 배양 후 배양액에서 Mg 2+ 및 Ca²⁺ 이온을 측정하는 데 중요합니다. 대조적으로, 인산염 완충 식염수(PBS)32에 존재하는 인산염은 예를 들어 Mg 2+ 또는 Ca²⁺ 이온^33,34,35를 모두 격리하고 ICP-OES 데이터의 해석에 혼란을 야기합니다.
   5. 펠렛화된 세포에서 상청액을 제거합니다. 세포 현탁액으로 알려진 1mL의 신선한 트리스 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
   6. 혈구계를 사용하여 세포 현탁액 농도(cells/mL)를 측정합니다.
4. 파종 박테리아 배양 생성
   참고: 샘플의 총 부피는 3mL이며 세 번(총 9mL) 완성됩니다.
   1. 필요한 박테리아 파종 배양의 총량을 결정합니다. 파종 배양을 생성하려면 C 1 V₁= C 2 V₂를 사용하여 7.8 ×^{10 6} cells/mL의 파종 배양을 만드는 데 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산합니다. 세포 현탁액의 계산된 부피(_V1)를 필요한 성장 배지(_V2)의 부피에 추가합니다.
   2. 실제 박테리아 파종 밀도를 CFU/mL 단위로 결정합니다. ^10-4로 10 배의 연속 희석을 만듭니다. ^10-4 희석액을 적절한 성장 한천에 펼치고 밤새 배양합니다. 배양 후 콜로니 수를 세고 CFU/mL를 계산합니다.
5. 박테리아 및 나노 입자 배양의 형성
   1. 12-웰, 비조직 처리된 폴리스티렌 플레이트에서, 필요한 웰 수에 대해 각 웰에서 박테리아 파종 배양 물 2mL를 분취합니다.
   2. 미리 칭량된 nMgO가 들어 있는 각 5mL 미세원심분리기 튜브에 박테리아 파종 배양액 3mL를 추가합니다. nMgO를 박테리아와 혼합하기 위해 잠시 소용돌이. 혼합물 1 mL를 3개의 개별 웰에 분취하여 nMgO의 미리 측정된 각 중량의 3중 샘플을 만들었다. 현탁액에서 nMgO를 유지하기 위해 각 1mL 분취량을 만들기 전에 박테리아/nMgO 혼합물을 2-3배 피펫합니다.
      참고: 대조군 샘플은 3mL의 세포만, 3mL의 배지만, 3mL의 나노입자 및 가장 낮은 농도와 가장 높은 농도의 나노입자를 포함하는 3mL로 구성됩니다. 이들은 2.5.2 단계에서와 같이 준비됩니다. 모든 대조 샘플은 세 번 완성됩니다.
   3. 모든 12-웰 플레이트를 37°C 및 120rpm에서 24시간 동안 인큐베이션합니다.
6. nMgO에 노출된 후 박테리아 세포 성장 결정
   1. 박테리아 배양물을 하룻밤 동안 배양한 후 개별 15mL 원뿔형 튜브에 피펫팅하여 3mL마다 샘플을 수집합니다.
   2. 96웰 플레이트를 사용하여 1:10 연속 희석을 만듭니다. 박테리아가 포함된 모든 샘플을 연속적으로 희석하는 데 필요한 컬럼 수를 결정합니다. 적절한 수의 컬럼에 대해 180μL의 Tris 버퍼를 행 B에서 행 G의 각 웰에 추가합니다.
   3. 박테리아 샘플이 들어 있는 각 15mL 원뿔형 튜브를 간략하게 소용돌이치고 행 A의 개별 웰에 50μL를 추가합니다.
   4. 행 A의 각 웰에 대해 20 μL를 행 B(예: A1에서 B1)로 옮기고 피펫팅으로 간단히 혼합하여 200 μL의 부피를 얻습니다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 20μL를 B열의 웰에서 C열의 웰로 옮깁니다. G열의 웰에 200μL가 포함될 때까지 이 패턴을 계속합니다. B열의 ^10-1 에서 G열의 ^10-6 까지 연속 희석을 완료합니다.
   5. 각 웰의 피펫 100 μL를 적절한 성장 한천 플레이트 상에 퍼뜨리고 플레이트를 가로질러 분산시켜 세포 배양액을 분산시켰다. 플레이트를 37°C에서 밤새 인큐베이터-셰이커에 넣습니다. 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션합니다.
   6. 판을 검사하고 약 25-300 개의 식민지가있는 판을 세십시오. 가능하면 동일한 희석 값의 플레이트를 선택하십시오. 플레이트당 콜로니 수를 사용하여 CFU/mL를 계산합니다.
7. 배양 후 pH의 평가
   알림: 각 pH 측정기 모델에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
   1. pH 4, pH 7 및 pH 10의 표준화 용액을 사용하여 pH 측정기를 사전 교정합니다. pH 프로브를 15mL 원뿔형 튜브에 넣어 각 박테리아 샘플을 판독합니다.
8. ICP-OES용 시료 준비
   참고: ICP-OES는 Mg 2+ 및 Ca²⁺ 이온의 농도를 결정하는 데 사용됩니다. 이러한 양이온은 각각 세포 대사에 참여하기 때문에 중요한 것으로 간주됩니다.
   1. 단계 2.6.1에서 제조된 각 15 mL 원뿔형 튜브를 5,724 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포 및 나노입자 파편을 펠렛화하였다.
   2. 15mL 원뿔형 튜브를 사용하여 상층액 30μL를 18.2 Ω 여과수 2.97mL에 희석하여 1:100 희석을 만듭니다.
      알림: 희석 계수는 투영된 이온 농도와 분광계 기기의 검출 한계에 따라 조정할 수 있습니다.
   3. ICP-OES를 사용하여 샘플을 읽어 보십시오.

3. 직접 노출 방법(방법 B)

참고: 선택한 박테리아의 성장률을 알 수 없는 경우 이 방법을 구현하기 전에 성장 곡선의 표준화를 완료해야 합니다.

1. 관심 나노입자에 노출될 때 실시간 정균 및 살균 활성을 결정합니다.
   1. 단계 2.1-2.1.2.2에 기술된 방법을 사용하여 원하는 농도의 나노입자를 제조한다. 사용할 나노 입자의 각 중량 2 세트를 준비하십시오 : 하나는 대수 성장 단계에서 박테리아 배양 균 분취량 3 mL에 첨가하고, 다른 하나는 대조군으로 박테리아가없는 성장 배지 분취량 3 mL에 첨가합니다.
   2. 테스트할 박테리아 종에 대한 적절한 정균 및 살균 항생제를 결정합니다.
      참고: 각 항생제의 최소 억제 농도에 대한 지식이 필요합니다.
2. 모든 나노입자, 항생제 및 대조군 시료에 대해 3mL 시료를 세 번 복제하는 데 필요한 박테리아 배양의 총 부피를 계산합니다.
   참고: 동일한 부피의 멸균 성장 배지가 필요합니다. 분광광도계의 사용을 계획하는 경우, 큐벳에 필요한 0.5mL에서 1.0mL 부피를 수용하는 데 필요한 총 부피를 조정해야 합니다.
3. 1일차: 각 시험 관 내 실험에 대해 2.2.1-2.2.2 단계에 따라 야간 재고를 생성합니다.
4. 2일차: 플레이트 리더 설정이 광학 밀도가 600nm인 96웰 플레이트를 수용할 수 있는지 확인합니다. 96웰 플레이트를 사용하여 200μL 분취량의 샘플을 측정합니다.
   1. 나노입자 및 항생제를 첨가하기 전에 초기 배양 기간을 시작하는데 사용된 밀도 - 0.01에서 초기 세균 배양_OD600 을 결정한다.
   2. 인큐베이터 셰이커에서 하룻밤 동안 박테리아 배양을 수집합니다.
      1. 테스트할 각 물질(예: 사전 측정된 나노입자 또는 항생제)에 대해 0.01의_OD600 에서 별도의 박테리아 배양을 만듭니다. 필요한 세포 배양 부피를 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰 용기(예: 멸균된 삼각 플라스크 또는 50mL 원뿔형 튜브)를 사용합니다.
      2. 성장 배지의 200μL 분취액 3개를 3개의 웰에 넣고 박테리아 배양액의 200μL 분취액 3개를 추가 웰(예: A1 - A6)에 배치하여 하룻밤 동안 박테리아 샘플을 성장 배지로 희석합니다.
      3. 96웰 플레이트를 플레이트 리더에 넣고 스캔합니다.
         알림: 판독값은 평균값을 생성하기 위해 스캔된 각 웰에 대해 평균화됩니다.
      4. 현탁액의 박테리아 밀도를 계산하려면 삼중 샘플이 포함된 각 웰의 평균값을 평균하십시오.
      5. 박테리아의 광학 밀도를 결정하려면 박테리아 평균에서 배양액 샘플 평균을 뺍니다.
      6. 박테리아 현탁액을 계속 조정해야 하는 경우 필요에 따라 브로스 또는 하룻밤 박테리아 배양을 계속 추가하고 약_{0.01의 OD 600} 에 도달할 때까지 필요에 따라 플레이트 리더에서 스캔을 반복합니다.
      7. 대수 성장에 도달할 때까지 150rpm으로 진탕하면서 37°C에서 배양합니다.
5. 인큐베이터 셰이커에서 박테리아 배양액을 제거합니다.
   1. OD₆₀₀ 0.01 박테리아 배양액 3mL를 테스트 및 대조군 샘플을 위해 표지된 15mL 원뿔형 튜브에 세 번 분취합니다.
   2. 박테리아 배양액을 200 μL의 분취하여 96-웰 플레이트의 3개의 웰에 넣고, 플레이트 리더를 이용하여 샘플을 측정하였다.
   3. 이전에 3.4.2.2 단계 및 3.4.2.6 단계에서 설명한 대로 "-0.5 h 판독값"을 계산합니다.
6. 박테리아/나노입자 혼합물의 생성 및 측정
   1. 박테리아 배양과 동일한 수의 멸균 성장 배지 3mL를 대조군 샘플(3회)을 위해 표지된 15mL 원뿔형 튜브에 분취합니다.
   2. 박테리아/나노입자 현탁액 및 멸균 배지/나노입자 현탁액을 준비하려면 15mL 원뿔형 튜브의 각 삼중 세트에서 박테리아 배양 또는 배지 1mL를 제거합니다.
      1. 미리 측정된 나노입자가 들어 있는 5 mL 원심분리 튜브에 1 mL 분취량을 넣고, 간단히 와동하여 혼합한다.
      2. 5mL 원심분리기 튜브에서 박테리아/나노입자 또는 배지/나노입자 현탁액의 1mL 분취량을 15mL 원뿔형 튜브로 되돌려 나노입자를 균질하게 분배합니다.
         참고: 각 1mL 분취액을 피펫팅하기 전에 박테리아/나노입자 혼합물을 2x-3x 피펫팅하여 나노입자를 현탁액으로 유지합니다.
7. 박테리아/항생제 혼합물의 생성 및 측정
   1. 박테리아/항생제 배양을 만들기 위해 배양된 박테리아 배양액 3mL를 해당 라벨이 붙은 15mL 원뿔형 튜브에 분취합니다.
   2. 모든 샘플이 준비된 후, 각 샘플의 200 μL를 96-웰 플레이트의 개별 웰에 분취한다.
   3. 플레이트를 플레이트 리더에 넣고 스캔을 시작합니다("0시간" 판독).
   4. 샘플이 들어 있는 15 mL 원뿔형 튜브를 37°C 및 150rpm에서 인큐베이터-쉐이커에 넣습니다. 3.4.2.2 단계 및 3.4.2.6 단계에서 설명한 대로 모든 데이터를 기록합니다.
8. 15시간 판독을 완료한 후 약 0분 후에 3.7.2-3.7.3단계-"0.5시간" 판독에 설명된 단계를 반복합니다.
   1. 설정된 0 h 후, 단계 3.7.2-단계 3.7.3에 설명된 단계를 6 사이클 동안 90분마다 반복하고; 9 시간 내에 완료하십시오.
   2. 여섯 번째 사이클이 완료된 후, 샘플을 37°C 및 150rpm에서 추가로 15시간 동안 인큐베이터-쉐이커에 넣습니다. 3.7.2-3.7.3 단계에서 설명한 단계를 반복하여 24시간 판독값을 얻습니다. 3.4.2.2 단계 및 3.4.2.6 단계에서 설명한 대로 모든 데이터를 기록합니다.

4. 직접 배양 방법(방법 C)

참고: 방법 C에서는 지연 단계 파종 배양의 박테리아를 관심 있는 나노 구조 표면에 직접 배치합니다. 나노구조 항균 활성을 검사하기 위해, 본 발명자들은 Zhang et ^al.14에 의해 기술된 프로토콜을 따른다. 이 직접 배양 방법을 입증하기 위해 ZC21(Mg-Zn-Ca 합금) 및 Mg 핀을 샘플로 사용했습니다.

1. 박테리아 배양 준비 및 성장
   1. 각 시험관 내 실험에 대해 2.2.1-2.2.2 단계에 따라 야간 재고를 생성합니다.
2. 파종 밀도를 결정하기 위해 박테리아를 세척하고 계수합니다
   참고: 7.5 ×^{10 5} CFU/mL의 원하는 파종 밀도는 정형외과 감염을 유발하는 보고된 세포 농도로 확인되었다¹⁴.
   1. 인큐베이터 셰이커에서 하룻밤 동안 박테리아 배양을 회수합니다.
   2. 2.3.2-2.3.2.3 단계에 따라 박테리아를 세척하고 수집하되 각 세척 단계에 대해 새로운 배지를 수정된 모의 체액(rSBF)으로 교체합니다.
      참고: rSBF는 인간 혈장의 이온 농도를 모방한 완충 용액입니다. 그러나 rSBF는 무기 화합물만을 포함하고 단백질과 같은 생체 유기 화합물은 없습니다. 이를 해결하기 위해, 소 태아 혈청(FBS)을 rSBF와 결합하여 인간 혈액의 조성을 시뮬레이션하여 실험 조건 하에서 석회화된 조직에서 인회석의 자연적 형성을 더 잘 모방한다³⁶.
   3. 펠렛화된 세포에서 상청액을 제거합니다. 10% FBS가 보충된 rSBF 1mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
   4. 혈구계를 사용하여 세포 현탁액 농도(cells/mL)를 측정합니다. 세포 현탁액을 7.5% FBS가 보충된 rSBF에서 10^{× 5} cells/mL의 농도로 희석합니다. 2.4.1단계에 따라 시드 문화권을 만듭니다.
   5. 2.4.2 단계에 따라 실제 파종 밀도를 결정하십시오.
3. 박테리아 세포 현탁액을 배양 웰의 샘플에 분배합니다.
   1. 샘플과 대조군 샘플을 모두 48웰, 비조직 처리된 폴리스티렌 플레이트의 개별 웰에 넣습니다.
   2. 0.75 mL의 세포 현탁액을 샘플 및 대조군이 들어있는 각 웰에 분취하였다. 48웰 플레이트를 120rpm으로 진탕하면서 37°C에서 24시간 동안 인큐베이터-셰이커에 넣습니다.
4. 박테리아 농도의 특성 분석
   1. 24시간 배양 후 샘플을 수집하여 별도의 라벨이 붙은 수집 튜브에 넣습니다.
   2. 각 그룹에서 두 개의 샘플을 수집하고 라벨이 붙은 5.0mL 미세 원심분리기 튜브에 개별적으로 넣습니다. 각 튜브에 2mL의 rSBF를 추가합니다.
   3. 4.4.2 단계에서 수집 한 샘플을 초음파 처리 욕조에 넣고 10 분 동안 초음파 처리합니다. 각 5분 간격 후, 각 샘플을 5초 동안 소용돌이칩니다.
   4. 새로 분리된 박테리아 세포가 포함된 rSBF를 수집하고 현탁액을 라벨이 붙은 신선한 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다.
5. 박테리아를 연속 희석 및 도금
   1. 2.6.2-2.6.6 단계에 따라 박테리아 현탁액을 연속적으로 희석하고 플레이트에 넣습니다.
6. 단계 2.7에 따라 배양 배지의 배양 후 pH를 평가합니다.
7. 단계 2.8에 설명된 방법에 따라 ICP-OES에 대한 배양 후 배지를 준비합니다.

5. 초점 접촉 노광법(방법 D)

참고: 방법 D에서 니트로셀룰로오스 여과지의 박테리아는 나노 구조 표면의 관심 영역과 직접 접촉합니다. 이 방법은 박테리아 활성과 박테리아 배양에서 벌크 샘플 분해의 간섭을 최소화합니다. 나노표면 항균 활성을 조사하기 위해 Lin et ^al.16에 의해 기술된 프로토콜을 따른다.

1. 2.2.1-2.2.2.1 단계의 절차에 따라 박테리아 파종 배양을 만듭니다. 2.4.2 단계에 따라 실제 시드 밀도를 확인하십시오.
2. 샘플을 정사각형 모양으로 1 × 1 cm² 크기로 준비합니다. 모든 샘플 유형을 세 번 준비합니다. 필요한 경우 직경 15mm, 높이 10mm의 3차원(3D) 홀더에 샘플을 놓습니다. 샘플과 홀더를 조직 배양되지 않은 폴리스티렌 웰 플레이트의 웰에 넣습니다.
3. 멸균 된 니트로 셀룰로오스 종이를 직경 1cm로 트리밍하여 준비하십시오. 준비된 니트로셀룰로오스 종이를 적절한 배지가 들어 있는 한천 플레이트에 놓습니다.
4. 희석된 세균 배양액 50 μL를 여과지 상에 피펫한다.
5. 적절한 배지 50μL를 각 샘플 표면의 중앙에 피펫합니다.
6. 멸균 된 핀셋을 사용하여 한천 표면에서 니트로 셀룰로오스 종이를 집어 올리십시오. 니트로셀룰로오스 종이를 조심스럽게 뒤집어 샘플 표면에 놓아 박테리아가 50μL의 배지 및 관심 있는 나노 구조 표면과 접촉하도록 합니다.
7. 습도를 유지하기 위해 샘플이 들어 있는 각 웰에 1mL의 Tris 완충액을 추가합니다. 모든 샘플을 함유하는 폴리스티렌 웰 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
8. 각 샘플 표면에서 니트로셀룰로오스 종이를 수집합니다. 각각 5mL의 트리스 완충액에 넣습니다. 수집된 여과지와 나노표면 재료 샘플을 5초 동안 소용돌이칩니다.
9. 각 샘플을 10 분 동안 초음파 처리합니다. 5분 후 5초 동안 소용돌이치고 10분 후에 다시 소용돌이칩니다.
10. 모든 샘플에서 트리스 버퍼 현탁액을 수집하고 각 부피를 개별 신선한 수집 튜브에 넣습니다.
11. 2.6.2-2.6.6 단계에 따라 샘플을 연속적으로 희석하고 플레이트합니다.

6. 박테리아 및 나노 물질의 배양 후 특성 분석

1. 주사전자현미경(SEM)을 이용한 박테리아 접착 및 형태 검사
   1. 하룻밤 배양 후, 샘플이 완전히 덮일 때까지 48 웰, 비 조직 처리 폴리스티렌 플레이트의 각 웰에 10 % 글루 타르 알데히드를 첨가합니다. 박테리아 세포를 고정하기 위해 샘플을 1시간 동안 배양합니다.
   2. 글루타르알데히드를 폐기물 병에 흡인하고 모든 샘플을 트리스 완충액으로 3배 헹구어 비부착성 박테리아를 제거합니다.
   3. 30%, 75% 및 100% 에탄올을 사용하여 각각 30분 동안 샘플을 탈수합니다¹⁶.
      알림: 임계점 건조기를 사용하여 s를 건조하는 것이 좋습니다.amp르. 샘플을 실온에서 24시간 동안 자연 건조하는 것은 이상적이지 않습니다.
   4. 구리 또는 탄소 테이프와 같은 전도성 접착 테이프를 사용하여 샘플을 SEM 스텁에 고정합니다. 이미징 전에 전도성을 제공하기 위해 스퍼터 코팅을 통해 샘플 표면을 코팅합니다(예: 20mA에서 45초 동안 백금/팔라듐(Pt/Pd) 아래에 부착된 박테리아가 있는 Mg 플레이트^코팅16).
      참고: 코팅 재료, 처리 시간 및 작동 전류는 샘플 유형에 따라 다를 수 있습니다.
   5. SEM을 사용하여 적절한 작동 거리와 가속 전압과 원하는 배율로 샘플의 박테리아 이미지를 촬영합니다. 예를 들어, 2차 전자 검출기가 있는 SEM을 사용하여 5mm의 작동 거리와 10kV의 가속 전압에서 이미지를 촬영합니다⁽¹⁶).
2. SEM을 사용하여 배양 후 나노물질 샘플의 표면 형태를 검사합니다.
   1. 나노 물질의 경우 Tris 버퍼 3x를 사용하여 샘플을 세척하여 샘플에 부착되지 않은 유리 박테리아를 제거합니다. 나노 입자의 경우, 필요할 때 더 나은 분산을 달성하기 위해 초음파를 통해 샘플 특성에 영향을 미치지 않는 용매에 입자를 분산시킵니다.
   2. 세척 절차 후 샘플을 건조시킵니다.
   3. 탄소 또는 구리 양면 접착 테이프를 사용하여 샘플을 SEM 스브에 부착합니다.
   4. 이미징 전에 6.1.4단계에서 설명한 대로 스퍼터 코터를 사용하여 Pt/Pd의 전도성 표면층을 만듭니다. 6.1.5단계에 설명된 대로 샘플 이미지를 가져옵니다.
   5. 적절한 가속 전압과 원하는 배율로(예를 들어, SEM 분석을 수행한 후 10kV에서) EDS를 사용하여 표면 원소 조성을 분석합니다(예: SEM 분석 16을 수행한 후^10kV에서).
3. 박테리아 부착의 형광 이미징
   1. 형광 현미경을 사용하여 시각화할 샘플을 먼저 Tris 버퍼 3x로 세척하여 준비합니다. 샘플을 실온에서 자연 건조합니다.
   2. 확립된 프로토콜³⁷에 따라 10μM 티오플라빈 T 형광 염료로 각 샘플을 염색합니다.
   3. 전자 증식 전하 결합 장치 디지털 카메라와 결합된 도립 현미경을 사용하여 박테리아 접착의 형광 이미징을 수행합니다.

결과

산화 마그네슘 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성 식별은 다양한 재료 유형 및 미생물 종에 적용 할 수있는 4 가지 시험관 내 방법을 사용하여 제시되었습니다.

방법 A와 방법 B는 지연 단계 (방법 A) 및 로그 단계 (방법 B)에서 24 시간 이상 나노 입자에 노출되었을 때 박테리아 활동을 검사합니다. 방법 A는 MIC 및 MBC에 관한 결과를 제공하는 반면, 방법 B는 나노 입자...

토론

우리는 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성을 특성화하기 위해 4 가지 시험관 내 방법 (AD)을 제시했습니다. 이러한 각 방법은 나노 물질에 대한 반응으로 시간 경과에 따른 박테리아 성장 및 생존력을 정량화하지만 시간 경과에 따른 초기 박테리아 파종 밀도, 성장 및 생존력을 측정하는 데 사용되는 방법에는 약간의 차이가 있습니다. 이 방법 중 세 가지, 직접 공동 배양 방법 (A)

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Milipore Sigma	Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven	MTI Corporation	BPG-7082	https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer	Sigma-Aldrich	42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE	Fisher Scientific	50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera	Hamamatsu	C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Hemocytometer	Brightline, Hausser Scientific	1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES)	PerkinElmer	8000
Inverse microscope	Nikon	Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth	Sigma Life Science	L3022
Luria Bertani Broth + agar	Sigma Life Science	L2897
MacroTube 5.0	Benchmark Scientific	C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles	US Research Nanomaterials, Inc	Stock #: US3310   M	MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance	Mettler Toledo	MS105D
Nitrocellulose paper	Fisherbrand	09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351172
Petri dish 100 mm	VWR	470210-568
Petri dish, 15 mm	Fisherbrand	FB0875713A
pH meter	VWR	SP70P
Scanning electron microscopy (SEM)	TESCAN	Vega3 SBH
Sonicator	VWR	97043-936
Table top centrifuge	Fisher Scientific	accuSpin Micro 17
Table top centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar	MP	1010617
Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
UV-Vis spectrophotometer	Tecan	Infinite 200 PRO	https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L	VWR	N/A
X-ray power defraction	Panalytical	N/A	PANalytical Empyrean Series 2