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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir stellen vier Methoden vor, um die antimikrobielle Aktivität von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen mit Hilfe von in vitro Techniken zu bewerten. Diese Methoden können angepasst werden, um die Wechselwirkungen verschiedener Nanopartikel und nanostrukturierter Oberflächen mit einem breiten Spektrum mikrobieller Spezies zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen wie Silber, Zinkoxid, Titandioxid und Magnesiumoxid wurden bereits in klinischen und umweltbedingten Umgebungen sowie in konsumierbaren Lebensmitteln untersucht. Mangelnde Konsistenz in den verwendeten experimentellen Methoden und Materialien hat jedoch zu widersprüchlichen Ergebnissen geführt, selbst bei Studien mit denselben Nanostrukturtypen und Bakterienarten. Für Forscher, die Nanostrukturen als Additiv oder Beschichtung in einem Produktdesign einsetzen möchten, schränken diese widersprüchlichen Daten ihre Verwendung im klinischen Umfeld ein.

Um diesem Dilemma zu begegnen, stellen wir in diesem Artikel vier verschiedene Methoden vor, um die antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen zu bestimmen, und diskutieren ihre Anwendbarkeit in verschiedenen Szenarien. Es wird erwartet, dass die Anpassung konsistenter Methoden zu reproduzierbaren Daten führt, die studienübergreifend verglichen und für verschiedene Nanostrukturtypen und mikrobielle Spezies implementiert werden können. Wir stellen zwei Methoden zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität von Nanopartikeln und zwei Methoden zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität von nanostrukturierten Oberflächen vor.

Für Nanopartikel kann die direkte Co-Kultur-Methode verwendet werden, um die minimalen inhibitorischen und minimalen bakteriziden Konzentrationen von Nanopartikeln zu bestimmen, und die direkte Expositionskulturmethode kann verwendet werden, um die bakteriostatische und bakterizide Aktivität in Echtzeit zu bewerten, die sich aus der Exposition gegenüber Nanopartikeln ergibt. Bei nanostrukturierten Oberflächen wird die Direktkulturmethode verwendet, um die Lebensfähigkeit von Bakterien indirekt und direkt in Kontakt mit nanostrukturierten Oberflächen zu bestimmen, und die Methode der fokussierten Kontaktexposition wird verwendet, um die antimikrobielle Aktivität auf einem bestimmten Bereich einer nanostrukturierten Oberfläche zu untersuchen. Wir diskutieren die wichtigsten experimentellen Variablen, die für das in vitro Studiendesign bei der Bestimmung der antimikrobiellen Eigenschaften von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen zu berücksichtigen sind. Alle diese Methoden sind relativ kostengünstig, verwenden Techniken, die relativ einfach zu beherrschen und aus Gründen der Konsistenz wiederholbar sind, und sind auf ein breites Spektrum von Nanostrukturtypen und mikrobiellen Spezies anwendbar.

Einleitung

Allein in den USA entwickeln jährlich 1,7 Millionen Menschen eine im Krankenhaus erworbene Infektion (HAI), wobei eine von 17 dieser Infektionen zum Tod führt1. Darüber hinaus werden die Behandlungskosten für therapieassoziierte Infektionen auf 28 bis 45 Milliarden US-Dollar pro Jahr geschätzt 1,2. Bei diesen therapieassoziierten Infektionen dominieren Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)3,4 und Pseudomonas aeruginosa4, die häufig aus chronischen Wundinfektionen isoliert werden und in der Regel eine umfangreiche Behandlung und Zeit erfordern, um ein günstiges Patientenergebnis zu erzielen.

In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Antibiotikaklassen entwickelt, um Infektionen im Zusammenhang mit diesen und anderen pathogenen Bakterien zu behandeln. Zum Beispiel wurden Rifamycin-Analoga zur Behandlung von MRSA, anderen grampositiven und gramnegativen Infektionen und Mycobacterium spp.-Infektionen eingesetzt5. In den 1990er Jahren wurden zusätzliche Medikamente mit Rifamycin-Analoga kombiniert, um eine zunehmende Zahl von M. tuberculosis-Infektionen wirksam zu behandeln, um deren Wirksamkeit zu erhöhen. Etwa 5 % der Fälle von M. tuberculosis sind jedoch nach wie vor resistent gegenRifampicin5,6, und es gibt zunehmende Besorgnis über multiresistente Bakterien7. Derzeit ist der Einsatz von Antibiotika allein bei der Behandlung von therapieassoziierten Infektionen möglicherweise nicht ausreichend, was zu einer anhaltenden Suche nach alternativen antimikrobiellen Therapien geführt hat1.

Schwermetalle wie Silber (Ag)8,9,10 und Gold (Au)11 sowie Keramiken wie Titandioxid (TiO 2)12 und Zinkoxid (ZnO)13 in Form von Nanopartikeln (NP) (AgNP, AuNP, TiO2 NP bzw. ZnONP) wurden aufihre antimikrobielle Aktivität untersucht und als potenzielle antibiotische Alternativen identifiziert. Darüber hinaus sind bioresorbierbare Materialien wie Magnesiumlegierungen (Mg-Legierungen)14,15,16, Magnesiumoxid-Nanopartikel 17,18,19,20,21 und Magnesiumhydroxid-Nanopartikel [nMgO bzw. nMg(OH)2]22,23,24, wurden ebenfalls untersucht. In den bisherigen antimikrobiellen Studien zu Nanopartikeln wurden jedoch uneinheitliche Materialien und Forschungsmethoden verwendet, was zu Daten führte, die schwer oder gar nicht vergleichbar sind und manchmal widersprüchlicher Natur sind18,19. So variierten beispielsweise die minimale Hemmkonzentration (MHK) und die minimale bakterizide Konzentration (MBC) von Silbernanopartikeln in verschiedenen Studien signifikant. Ipe et al.25 untersuchten die antibakterielle Aktivität von AgNPs mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von ~26 nm, um die MICs gegen grampositive und gramnegative Bakterien zu bestimmen. Die identifizierten MICs für P. aeruginosa, E. coli, S. aureus und MRSA betrugen 2 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml bzw. 10 μg/ml. Im Gegensatz dazu untersuchten Parvekar et al.26 AgNPs mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 5 nm. In diesem Fall erwiesen sich die AgNP MHK und ein MBC von 0,625 mg/ml als wirksam gegen S. aureus. Darüber hinaus untersuchten Loo et al.27 AgNPs mit einer Größe von 4,06 nm. Wenn E. coli diesen Nanopartikeln ausgesetzt wurde, wurden MHK und MBC mit 7,8 μg/ml angegeben. Schließlich untersuchten Ali et al.28 die antibakteriellen Eigenschaften von sphärischen AgNPs mit einer durchschnittlichen Größe von 18 nm. Wenn P. aeruginosa, E. coli und MRSA diesen Nanopartikeln ausgesetzt wurden, wurde die MHK bei 27 μg/ml, 36 μg/ml, 27 μg/ml bzw. 36 μg/ml und die MBC bei 36 μg/ml, 42 μg/ml bzw. 30 μg/ml identifiziert.

Obwohl die antibakterielle Aktivität von Nanopartikeln in den letzten Jahrzehnten ausgiebig untersucht und berichtet wurde, gibt es keinen Standard für die verwendeten Materialien und Forschungsmethoden, um direkte Vergleiche zwischen Studien zu ermöglichen. Aus diesem Grund stellen wir zwei Methoden vor, die direkte Co-Kultur-Methode (Methode A) und die direkte Expositionsmethode (Methode B), um die antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln zu charakterisieren und zu vergleichen und gleichzeitig die Materialien und Methoden konsistent zu halten.

Neben Nanopartikeln wurden auch nanostrukturierte Oberflächen auf antibakterielle Aktivitäten untersucht. Dazu gehören kohlenstoffbasierte Materialien wie Graphen-Nanoblätter, Kohlenstoff-Nanoröhren und Graphit29 sowie reines Mg und Mg-Legierungen. Jedes dieser Materialien hat mindestens einen antibakteriellen Mechanismus gezeigt, einschließlich physikalischer Schäden, die Zellmembranen durch kohlenstoffbasierte Materialien auferlegt werden, und Schäden an Stoffwechselprozessen oder DNA durch die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) beim Abbau von Mg. Wenn Zink (Zn) und Calcium (Ca) bei der Bildung von Mg-Legierungen kombiniert werden, wird außerdem die Verfeinerung der Korngröße der Mg-Matrix verbessert, was zu einer Verringerung der bakteriellen Adhäsion an Substratoberflächen im Vergleich zu reinen Mg-Proben führt14. Um die antibakterielle Aktivität zu demonstrieren, stellen wir die Direktkulturmethode (Methode C) vor, die die bakterielle Adhäsion auf und um nanostrukturierte Materialien über die Zeit durch die Quantifizierung von bakteriellen koloniebildenden Einheiten (KBE) mit direktem und indirektem Oberflächenkontakt bestimmt.

Die Geometrie von Nanostrukturen auf Oberflächen, einschließlich der Größe, Form und Ausrichtung, könnte die bakterizide Aktivität von Materialien beeinflussen. Zum Beispiel stellten Lin et al.16 verschiedene nanostrukturierte MgO-Schichten auf den Oberflächen von Mg-Substraten durch Anodisierung und elektrophoretische Abscheidung (EPD) her. Nach einer gewissen Exposition gegenüber der nanostrukturierten Oberfläche in vitro war das Wachstum von S. aureus im Vergleich zu unbehandeltem Mg deutlich reduziert. Dies deutete auf eine größere Wirksamkeit der nanostrukturierten Oberfläche gegen bakterielle Adhäsion gegenüber der unbehandelten metallischen Mg-Oberfläche hin. Um die unterschiedlichen Mechanismen der antibakteriellen Eigenschaften verschiedener nanostrukturierter Oberflächen aufzudecken, wird in diesem Artikel eine fokussierte Kontakt-Expositionsmethode (Methode D) diskutiert, die die Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen innerhalb des interessierenden Bereichs bestimmt.

Das Ziel dieses Artikels ist es, vier In-vitro-Methoden vorzustellen, die auf verschiedene Nanopartikel, nanostrukturierte Oberflächen und mikrobielle Spezies anwendbar sind. Wir diskutieren die wichtigsten Überlegungen für jede Methode, um konsistente, reproduzierbare Daten für die Vergleichbarkeit zu erzeugen. Insbesondere werden die direkte Co-Kultur-Methode17 und die direkte Expositionsmethode verwendet, um die antimikrobiellen Eigenschaften von Nanopartikeln zu untersuchen. Durch die direkte Kokulturmethode können die minimalen inhibitorischen und minimalen bakteriziden Konzentrationen (MHK bzw. MBC90-99,99) für einzelne Spezies und die stärkste Konzentration (MPC) für mehrere Spezies bestimmt werden. Durch die Direktbelichtungsmethode können die bakteriostatischen oder bakteriziden Wirkungen von Nanopartikeln bei minimalen Hemmkonzentrationen durch optische Dichtemessungen in Echtzeit über die Zeit charakterisiert werden. Die Direktkulturmethode14 eignet sich zur direkten und indirekten Untersuchung von Bakterien, die mit nanostrukturierten Oberflächen in Kontakt kommen. Schließlich wird die Methode der fokussierten Kontaktexposition16 vorgestellt, um die antibakterielle Aktivität eines bestimmten Bereichs auf einer nanostrukturierten Oberfläche durch die direkte Anwendung von Bakterien und die Charakterisierung des Bakterienwachstums an der Zell-Nanostruktur-Grenzfläche zu untersuchen. Diese Methode basiert auf der japanischen Industrienorm JIS Z 2801:200016 und soll sich auf die Wechselwirkungen zwischen Mikroben und Oberfläche konzentrieren und die Auswirkungen des Abbaus von Massenproben in mikrobieller Kultur auf antimikrobielle Aktivitäten ausschließen.

Protokoll

Um die direkten Kokultur- und Direktexpositionsmethoden vorzustellen, verwenden wir Magnesiumoxid-Nanopartikel (nMgO) als Modellmaterial, um bakterielle Interaktionen zu demonstrieren. Um die Methoden der direkten Kultur und des fokussierten Kontakts zu präsentieren, verwenden wir eine Mg-Legierung mit nanostrukturierten Oberflächen als Beispiele.

1. Sterilisation von Nanomaterialien

HINWEIS: Alle Nanomaterialien müssen vor der mikrobiellen Kultur sterilisiert oder desinfiziert werden. Zu den Methoden, die verwendet werden können, gehören Hitze, Druck, Strahlung und Desinfektionsmittel, aber die Toleranz der Materialien für jede Methode muss vor den In-vitro-Experimenten ermittelt werden.

  1. Nanopartikel
    Anmerkungen: Die Proben können in einem organischen Lösungsmittel wie Ethanol gelagert oder in eine Schale oder einen Karton verpackt werden, gefolgt von einer Sterilisation oder Desinfektion in geeigneter Weise. Die Nanopartikel wurden unter Verwendung des folgenden Verfahrens sterilisiert, um die direkte Co-Kultur-Methode17 und die direkte Expositionsmethode zu demonstrieren.
    1. Sterilisieren Sie MgO-Nanopartikel in einem 200 °C Konvektionsofen30 für 60 min vor jedem In-vitro-Experiment .
      HINWEIS: Diese Methode wurde gewählt, weil Wasserdampf und UV-Licht die Strukturen der MgO-Nanopartikel (nMgO)17 beeinflussen können.
  2. Schüttgüter
    HINWEIS: Die nanostrukturierten Materialien wurden zur Demonstration der Direktkulturmethode mit der folgenden Methode sterilisiert.
    1. Desinfizieren Sie bei der Direktkulturmethode14 die vorbereiteten ZC21-, Mg- und T64-Proben 4 h lang mit ultravioletter (UV) Strahlung, bevor Sie mit den In-vitro-Studien beginnen.
    2. Bei der fokussierten Kontaktexpositionsmethode16 sind alle Proben vor Beginn der In-vitro-Studien 2 h lang mit UV-Strahlung zu desinfizieren.
  3. Alternativ können Sie Ethylenoxid (EtO) für die Sterilisation von hitzeempfindlichen Materialien verwenden.

2. Direkte Co-Kultur-Methode (Methode A)

HINWEIS: Bei Methode A werden Bakterien in einer Lag-Phase-Seeding-Kultur direkt mit Nanopartikeln bestimmter Konzentrationen gemischt. Für die Untersuchung der antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln folgen wir einem Protokoll, das von Nguyen et al.17 beschrieben wurde.

  1. Charakterisierung von Nanopartikeln und Nanostrukturen
    HINWEIS: Die Zusammensetzung und Form der Nanostruktur wird durch Röntgenpulverbeugung bestätigt.
    1. Messung von Nanopartikeln
      1. Wiegen Sie die Nanopartikel mit dem 9-fachen der gewünschten Masse pro ml, um 3 ml-Proben in dreifacher Ausführung aufzunehmen. Wiegen Sie z. B. 0,2 mg/ml nMgO bei 1,8 mg/ml.
        HINWEIS: Dies gewährleistet die gleichmäßige Verteilung der Nanopartikel in den Bakterienkulturen und Brühen.
      2. Messen Sie alle Nanopartikel in einem 5,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit einer Analysenwaage vorgewogen und tariert wurde.
  2. Aufbereitung und Züchtung von Bakterienkulturen
    1. Für jedes In-vitro-Experiment werden Bakterienzellvorräte aus dem Lager bei -80 °C entnommen. Geben Sie 10 μl jedes Bakterienzellbestandes in 5 ml eines geeigneten Nährmediums.
    2. Das beimpfte Medium wird über Nacht bei 37 °C und 250 U/min für ca. 16 h in einen Inkubator-Schüttler gegeben.
      1. Wenn Staphylokokken-Arten gezüchtet werden, subkultivieren Sie, indem Sie 400 μl jeder Übernachtkultur in 20 ml frisches Wachstumsmedium (100 μl/5 ml Medium) geben und unter Schütteln bei 37 °C und 250 U/min für weitere 4-6 Stunden inkubieren.
  3. Waschen und Zählen der Bakterienzellen zur Bestimmung der Aussaatdichte
    HINWEIS: Die gewünschte Aussaatdichte von 7,8 × 106 KBE/ml wurde als die Zellzahl identifiziert, die größer ist als die, die erforderlich ist, um eine Harnwegsinfektion zu bestätigen.
    1. Sammeln Sie kultivierte Bakterien, indem Sie 1 ml der Bakterienkultur über Nacht in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren. Erzeugen Sie eine ausreichende Anzahl von Aliquoten aus Bakterienkulturen über Nacht und zentrifugieren Sie diese 10 Minuten lang bei 1.956 × g , um die gewünschten Aussaatdichten zu erreichen.
    2. Nach dem Zentrifugieren pipetieren Sie, um den Überstand aus den pelletierten Zellen zu entfernen, und legen Sie den Überstand in ein Auffanggefäß. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 0,5 ml frischem Nährmedium. Kombinieren Sie zwei 0,5-ml-Suspensionen, um 1 ml Suspension herzustellen, um die Anzahl der 1-ml-Aliquots resuspendierter Zellen auf sechs zu reduzieren. Wiederholen Sie die Zentrifugation 10 Minuten lang bei 1.956 × g.
    3. Führen Sie einen zweiten Waschgang mit frischem Nährmedium durch, wie in Schritt 2.3.2 beschrieben, um die Anzahl der 1-ml-Aliquots resuspendierter gewaschener Zellen auf drei zu reduzieren.
    4. Schließen Sie den dritten Zyklus wie in Schritt 2.3.2 ab, mit der Ausnahme, dass die Zellpellets in 0,33 ml Tris-Puffer (Hydroxymethyl)-Aminomethanpuffer (Tris-Puffer, pH 8,5) resuspendiert werden. Kombinieren Sie die drei Suspensionen mit einem Volumen von jeweils 0,33 ml zu einer 1,5-ml-Mikrozentrifuge. Wiederholen Sie die Zentrifugation 10 Minuten lang bei 1.956 × g.
      Anmerkungen: Tris-Puffer enthält keine Mg2+- oderCa2+-Ionen31. Dies ist wichtig für den Einsatz der induktiv gekoppelten plasmaoptischen Emissionsspektrometrie (ICP-OES) zur Messung von Mg2+- undCa2+-Ionen in Postkulturbrühen. Im Gegensatz dazu sequestrieren die Phosphate, die beispielsweise in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)32 enthalten sind, sowohl Mg2+- als auchCa2+-Ionen33,34,35 und verursachen Verwirrung bei der Interpretation der ICP-OES-Daten.
    5. Entfernen Sie den Überstand aus den pelletierten Zellen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml frischem Tris-Puffer, der als Zellsuspension bekannt ist - eine bakterielle Aussaatkultur in der Verzögerungsphase.
    6. Bestimmen Sie die Konzentration der Zellsuspension (Zellen/ml) mit einem Hämozytometer.
  4. Anlegen der Saatbakterienkultur
    HINWEIS: Die Probe hat ein Gesamtvolumen von 3 ml und wird in dreifacher Ausführung (insgesamt 9 ml) vervollständigt.
    1. Bestimmen Sie das Gesamtvolumen der benötigten Bakteriensaatkultur. Um die Seeding-Kultur zu erstellen, verwenden Sie C 1 V1= C 2 V2, um das Volumen der Zellsuspension zu berechnen, das benötigt wird, um eine Seeding-Kultur von 7,8 × 106 Zellen/ml zu erzeugen. Addieren Sie das berechnete Volumen der Zellsuspension (V1) zum erforderlichen Volumen an Nährmedien (V2).
    2. Bestimmen Sie die tatsächliche Bakterienkeimdichte in KBE/ml. Erstellen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung auf 10-4. Die 10-4-Verdünnung auf den entsprechenden Wachstumsagar verteilen und über Nacht inkubieren. Zählen Sie nach der Inkubation die Anzahl der Kolonien und berechnen Sie die KBE/ml.
  5. Bildung von Bakterien- und Nanopartikelkulturen
    1. In 12-Well-Polystyrolplatten, die nicht mit Gewebe behandelt wurden, aliquotieren Sie 2 ml der bakteriellen Seeding-Kultur in jeder Well, um die Anzahl der benötigten Wells zu erhalten.
    2. Für jedes 5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das vorgewogenes nMgO enthält, werden 3 ml der bakteriellen Aussaatkultur hinzugefügt. Kurz vortexen, um das nMgO mit den Bakterien zu vermischen. Aliquotieren Sie 1 ml des Gemischs in drei separate Vertiefungen, um die dreifachen Proben jedes vorgemessenen Gewichts von nMgO zu erzeugen. Das Bakterien/nMgO-Gemisch wird 2-3x pipetiert, bevor jeweils 1 ml aliquot hergestellt wird, um nMgO in Suspension zu halten.
      Anmerkungen: Die Kontrollproben bestehen nur aus 3 ml Zellen, nur aus 3 ml Medium und 3 ml mit den niedrigsten und höchsten Konzentrationen der verwendeten Nanopartikel. Diese werden wie in Schritt 2.5.2 vorbereitet. Alle Kontrollproben werden in dreifacher Ausfertigung ausgefüllt.
    3. Alle 12-Well-Platten bei 37 °C und 120 U/min für 24 h inkubieren.
  6. Bestimmung des bakteriellen Zellwachstums nach nMgO-Exposition
    1. Nach der Inkubation der Bakterienkulturen über Nacht wird jede 3-ml-Probe durch Pipettieren in ein einzelnes konisches 15-ml-Röhrchen entnommen.
    2. Verwenden Sie eine 96-Well-Platte, um serielle Verdünnungen im Verhältnis 1:10 zu erstellen. Bestimmen Sie die Anzahl der Säulen, die erforderlich sind, um alle Proben, die Bakterien enthalten, seriell zu verdünnen. Geben Sie 180 μl Tris-Puffer in jede Vertiefung in Reihe B bis Zeile G, um die entsprechende Anzahl von Säulen zu erhalten.
    3. Jedes konische 15-ml-Röhrchen mit Bakterienproben wird kurz vortexiert und 50 μl in eine einzelne Vertiefung in Reihe A gegeben.
    4. Übertragen Sie für jede Vertiefung in Reihe A 20 μl in Reihe B (z. B. A1 bis B1) und mischen Sie kurz durch Pipettieren, um ein Volumen von 200 μl zu erhalten. Übertragen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze 20 μl aus der Vertiefung in Reihe B in die Vertiefung in Reihe C. Fahren Sie mit diesem Muster fort, bis die Vertiefung in Reihe G 200 μl enthält. Abschließen einer seriellen Verdünnung von 10−1 in Reihe B auf 10−6 in Reihe G.
    5. Pipettieren Sie 100 μl von jeder Vertiefung auf eine geeignete Wachstumsagarplatte und verteilen Sie sie auf der Platte, um die Zellkultur zu dispergieren. Legen Sie die Platten über Nacht bei 37 °C in einen Inkubator-Schüttler. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 24 h.
    6. Untersuchen Sie die Platten und zählen Sie diejenigen, die ungefähr 25-300 Kolonien haben. Wählen Sie nach Möglichkeit Platten mit dem gleichen Verdünnungswert. Verwenden Sie die Anzahl der Kolonien pro Platte, um die KBE/ml zu berechnen.
  7. Bestimmung des pH-Wertes nach der Inkubation
    Anmerkungen: Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für jedes pH-Messgerät.
    1. Kalibrieren Sie ein pH-Messgerät mit Standardisierungslösungen von pH 4, pH 7 und pH 10 vor. Lesen Sie jede Bakterienprobe ab, indem Sie die pH-Sonde in das konische 15-ml-Röhrchen stecken.
  8. Vorbereitung von Proben für ICP-OES
    HINWEIS: ICP-OES wird verwendet, um die Konzentration von Mg 2+ und Ca2+ Ionen zu bestimmen. Diese Kationen werden als wichtig erachtet, da sie jeweils am Zellstoffwechsel beteiligt sind.
    1. Jedes in Schritt 2.6.1 hergestellte konische 15-ml-Röhrchen wird 5 Minuten lang bei 5.724 × g zentrifugiert, um die Zell- und Nanopartikelreste zu pelletieren.
    2. Verdünnen Sie mit einem konischen 15-ml-Röhrchen 30 μl des Überstands in 2,97 ml 18,2 Ω gefiltertem Wasser, um eine Verdünnung von 1:100 zu erzielen.
      HINWEIS: Der Verdünnungsfaktor kann basierend auf den projizierten Ionenkonzentrationen und der Nachweisgrenze des Spektrometers eingestellt werden.
    3. Lesen Sie die Beispiele mit ICP-OES.

3. Direktbelichtungsmethode (Methode B)

HINWEIS: Wenn die Wachstumsrate der ausgewählten Bakterien unbekannt ist, muss vor der Implementierung dieser Methode eine Standardisierung der Wachstumskurve durchgeführt werden.

  1. Bestimmen Sie die bakteriostatischen und bakteriziden Aktivitäten in Echtzeit bei Exposition gegenüber den interessierenden Nanopartikeln.
    1. Bereiten Sie die gewünschten Konzentrationen von Nanopartikeln mit den in Schritt 2.1-2.1.2.2 beschriebenen Methoden vor. Bereiten Sie zwei Sätze von jedem Gewicht von Nanopartikeln vor, die verwendet werden sollen: einer, der zu 3 ml-Aliquoten der Bakterienkultur in der logarithmischen Wachstumsphase hinzugefügt wird, und der andere, der zu 3 ml-Aliquoten des Wachstumsmediums ohne Bakterien als Kontrollgruppen hinzugefügt wird.
    2. Bestimmen Sie die geeigneten bakteriostatischen und bakteriziden Antibiotika für die zu testenden Bakterienarten.
      HINWEIS: Die Kenntnis der minimalen Hemmkonzentration für jedes Antibiotikum ist erforderlich.
  2. Berechnen Sie das Gesamtvolumen der Bakterienkultur, das für dreifache 3-ml-Proben für alle Nanopartikel-, Antibiotika- und Kontrollproben benötigt wird.
    Anmerkungen: Es ist eine gleiche Menge steriles Nährmedium erforderlich. Wenn der Einsatz von Spektralphotometrie geplant ist, erfordert dies Anpassungen des Gesamtvolumens, das für die Aufnahme des für Küvetten benötigten Volumens von 0,5 mL bis 1,0 mL benötigt wird.
  3. Tag 1: Legen Sie für jedes In-vitro-Experiment gemäß den Schritten 2.2.1-2.2.2 Übernachtvorräte an.
  4. Tag 2: Vergewissern Sie sich, dass die Einstellungen des Plattenlesers eine 96-Well-Platte mit einer optischen Dichte von 600 nm aufnehmen können. Messen Sie die Proben in 200-μl-Aliquots mit einer 96-Well-Platte.
    1. Bestimmen Sie eine anfängliche Bakterienkultur OD600 bei 0,01-der Dichte, die zu Beginn der anfänglichen Inkubationszeit vor der Zugabe von Nanopartikeln und Antibiotika verwendet wird.
    2. Sammeln Sie die Bakterienkultur über Nacht aus dem Inkubatorschüttler.
      1. Für jedes zu testende Material (z. B. vorgemessene Nanopartikel oder Antibiotika) wird eine separate Bakterienkultur mit einem OD600 von 0,01 erstellt. Verwenden Sie einen Behälter, der groß genug ist, um das benötigte Zellkulturvolumen aufzunehmen (z. B. einen sterilisierten Erlenmeyerkolben oder 50-ml-Konusröhrchen).
      2. Verdünnen Sie die Bakterienproben über Nacht mit Wachstumsmedium, indem Sie drei 200-μl-Aliquots des Wachstumsmediums in drei Vertiefungen und drei 200-μl-Aliquots der Bakterienkultur in weitere Vertiefungen (z. B. A1 bis A6) geben.
      3. Legen Sie die 96-Well-Platte in den Plattenleser und scannen Sie sie.
        HINWEIS: Die Messwerte werden für jede gescannte Vertiefung gemittelt, um einen Mittelwert zu erhalten.
      4. Um die Dichte von Bakterien in Suspension zu berechnen, mitteln Sie den Mittelwert für jede Vertiefung, die eine dreifache Probe enthält.
      5. Um die optische Dichte der Bakterien zu bestimmen, subtrahieren Sie den Durchschnitt der Bouillonprobe vom Bakteriendurchschnitt.
      6. Wenn es notwendig ist, die Bakteriensuspension weiter anzupassen, fügen Sie nach Bedarf weitere Brühe oder eine Bakterienkultur über Nacht hinzu und wiederholen Sie das Scannen im Plattenlesegerät, bis ein OD600 von ca. 0,01 erreicht ist.
      7. Inkubieren bei 37 °C unter Schütteln bei 150 U/min, bis logarithmisches Wachstum erreicht ist.
  5. Nehmen Sie die Bakterienkulturen aus dem Inkubatorschüttler.
    1. Aliquotieren Sie 3 ml der Bakterienkultur OD600 0,01 in markierte konische 15-ml-Röhrchen für Test- und Kontrollproben in dreifacher Ausfertigung.
    2. Aliquotieren Sie 200 μl der Bakterienkultur in drei Vertiefungen einer 96-Well-Platte und messen Sie die Proben mit dem Plattenlesegerät.
    3. Berechnen Sie die Messwerte wie zuvor in Schritt 3.4.2.2 und Schritt 3.4.2.6 - der "-0.5 h Messwert" beschrieben.
  6. Erstellung und Messung von Bakterien-/Nanopartikel-Gemischen
    1. Aliquotieren Sie 3 ml steriles Nährmedium in gleicher Anzahl zu den Bakterienkulturen in markierte konische 15-ml-Röhrchen für Kontrollproben (in dreifacher Ausfertigung).
    2. Zur Herstellung von Bakterien-/Nanopartikelsuspensionen und sterilen Medien/Nanopartikelsuspensionen 1 ml Bakterienkultur oder -medium aus jedem dreifachen Satz von konischen 15-ml-Röhrchen entfernen.
      1. Geben Sie die 1-ml-Aliquots in ein 5-ml-Zentrifugenröhrchen mit vorgemessenen Nanopartikeln und wirbeln Sie sie kurz, um sie zu mischen.
      2. Aus dem 5-ml-Zentrifugenröhrchen werden 1 ml-Aliquots der Bakterien-/Nanopartikel- oder Medium-/Nanopartikelsuspensionen in das konische 15-ml-Röhrchen zurückgeführt, um die Nanopartikel homogen zu verteilen.
        Anmerkungen: Pipettieren Sie das Bakterien/Nanopartikel-Gemisch 2x-3x, bevor jeweils 1 ml Aliquot pipettiert wird, um die Nanopartikel in Suspension zu halten.
  7. Herstellung und Messung von Bakterien-/Antibiotika-Gemischen
    1. Um die Bakterien-/Antibiotikakulturen zu erzeugen, aliquotieren Sie 3 mL der inkubierten Bakterienkultur in die entsprechend markierten konischen 15 mL Röhrchen.
    2. Nachdem alle Proben vorbereitet wurden, aliquotieren Sie 200 μl jeder Probe in die einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
    3. Legen Sie die Platte(n) in den Plattenleser ein und starten Sie den Scanvorgang - die "0 h"-Ablesung.
    4. Die konischen 15-ml-Röhrchen mit den Proben werden bei 37 °C und 150 U/min in einen Inkubator-Schüttler gegeben. Zeichnen Sie alle Daten auf, wie zuvor in Schritt 3.4.2.2 und Schritt 3.4.2.6 beschrieben.
  8. Wiederholen Sie ca. 15 Minuten nach Abschluss der 0-Stunden-Messung die in Schritt 3.7.2-3.7.3 - Die "0,5 h"-Messung beschriebenen Schritte.
    1. Wiederholen Sie nach der festgelegten 0 h die in Schritt 3.7.2-Schritt 3.7.3 beschriebenen Schritte alle 90 Minuten für sechs Zyklen; Fertig in 9 h.
    2. Nach Abschluss des sechsten Zyklus werden die Proben für weitere 15 h bei 37 °C und 150 U/min in den Inkubator-Schüttler gegeben. Wiederholen Sie die in Schritt 3.7.2-3.7.3 beschriebenen Schritte, um den 24-Stunden-Messwert zu erhalten. Zeichnen Sie alle Daten auf, wie zuvor in Schritt 3.4.2.2 und Schritt 3.4.2.6 beschrieben.

4. Direkte Kulturmethode (Methode C)

HINWEIS: Bei Methode C werden Bakterien in einer Lag-Phase-Seeding-Kultur direkt auf die zu untersuchenden nanostrukturierten Oberflächen gesetzt. Zur Untersuchung der antimikrobiellen Aktivitäten der Nanostruktur folgen wir einem Protokoll, das von Zhang et al.14 beschrieben wurde. Um diese direkte Kulturmethode zu demonstrieren, wurden ZC21 (Mg-Zn-Ca Alloy) und Mg-Pins als Proben verwendet.

  1. Aufbereitung und Anzucht der Bakterienkulturen
    1. Legen Sie für jedes In-vitro-Experiment gemäß den Schritten 2.2.1-2.2.2 Übernachtvorräte an.
  2. Waschen und Zählen der Bakterien, um die Samendichte zu bestimmen
    HINWEIS: Die gewünschte Seeding-Dichte von 7,5 × 105 KBE/ml wurde als die berichtete Zellkonzentration identifiziert, die orthopädische Infektionen verursacht14.
    1. Entnehmen Sie die Bakterienkultur über Nacht aus dem Inkubatorschüttler.
    2. Waschen und sammeln Sie die Bakterien gemäß den Schritten 2.3.2-2.3.2.3, aber ersetzen Sie das frische Medium für jeden Waschschritt durch eine überarbeitete simulierte Körperflüssigkeit (rSBF).
      HINWEIS: rSBF ist eine Pufferlösung, die die Ionenkonzentration des menschlichen Blutplasmas nachahmt. rSBF enthält jedoch nur anorganische Verbindungen und ist ohne bioorganische Verbindungen wie Proteine. Um dieses Problem zu lösen, wird fötales Kälberserum (FBS) mit rSBF kombiniert, um die Zusammensetzung des menschlichen Blutes zu simulieren und die natürliche Bildung von Apatit in verkalktem Gewebe unter experimentellen Bedingungen besser nachzuahmen36.
    3. Entfernen Sie den Überstand aus den pelletierten Zellen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml rSBF, ergänzt mit 10% FBS-Zellsuspension.
    4. Bestimmen Sie die Konzentration der Zellsuspension (Zellen/ml) mit einem Hämozytometer. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 7,5 × 105 Zellen/ml in rSBF, ergänzt mit 10 % FBS. Erstellen Sie eine Seeding-Kultur gemäß Schritt 2.4.1.
    5. Bestimmen Sie die tatsächliche Saatdichte gemäß Schritt 2.4.2.
  3. Verteilen Sie die Bakterienzellsuspension auf die Proben in den Kulturvertiefungen.
    1. Geben Sie sowohl die Proben als auch die Kontrollproben in die einzelnen Vertiefungen einer 48-Well-Polystyrolplatte, die nicht mit Gewebe behandelt wurde.
    2. Aliquotieren Sie 0,75 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung, die die Proben und Kontrollen enthält. Legen Sie die 48-Well-Platte(n) für 24 h bei 37 °C in einen Inkubator-Schüttler und schütteln Sie sie mit 120 U/min.
  4. Charakterisierung der Bakterienkonzentration
    1. Nach 24 Stunden Inkubation sammeln Sie die Proben und geben sie in separate, beschriftete Sammelröhrchen.
    2. Sammeln Sie zwei Proben aus jeder Gruppe und geben Sie sie einzeln in beschriftete 5,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 2 ml rSBF in jedes Röhrchen.
    3. Die in Schritt 4.4.2 entnommenen Proben werden in ein Beschallungsbad gegeben und 10 Minuten lang beschimpft. Nach jeweils 5 Minuten wird jede Probe 5 s lang vortexiert.
    4. Sammeln Sie das rSBF mit den neu abgelösten Bakterienzellen und geben Sie die Suspension in ein markiertes, frisches Mikrozentrifugenröhrchen.
  5. Serielle Verdünnungen und Beschichtung der Bakterien
    1. Die bakterielle Suspension wird gemäß den Schritten 2.6.2-2.6.6 seriell verdünnt und plattiert.
  6. Bestimmen Sie den pH-Wert von Nährmedien nach der Inkubation, indem Sie Schritt 2.7 befolgen.
  7. Bereiten Sie das Postkulturmedium für ICP-OES vor, indem Sie die in Schritt 2.8 beschriebenen Methoden befolgen.

5. Expositionsmethode mit fokussiertem Kontakt (Methode D)

HINWEIS: Bei Methode D werden Bakterien auf einem Nitrozellulose-Filterpapier in direkten Kontakt mit einem interessierenden Bereich auf den nanostrukturierten Oberflächen gebracht. Diese Methode minimiert die Interferenz des Abbaus von Massenproben in Bakterienkulturen mit den bakteriellen Aktivitäten. Um antimikrobielle Aktivitäten auf Nanooberflächen zu untersuchen, folgen wir einem Protokoll, das von Lin et al.16 beschrieben wurde.

  1. Befolgen Sie die Verfahren in Schritt 2.2.1-2.2.2.1, um eine bakterielle Seeding-Kultur zu erstellen. Bestätigen Sie die tatsächliche Saatdichte gemäß Schritt 2.4.2.
  2. Bereiten Sie die Proben auf eine Größe von 1 × 1cm2 in quadratischer Form vor. Bereiten Sie alle Probentypen in dreifacher Ausfertigung vor. Legen Sie die Proben bei Bedarf auf einen dreidimensionalen (3D) Halter mit einem Durchmesser von 15 mm und einer Höhe von 10 mm. Legen Sie die Probe und den Halter in eine Vertiefung einer mit Nichtgewebekulturen behandelten Polystyrol-Well-Platte.
  3. Bereiten Sie sterilisierte Nitrozellulosepapiere vor, indem Sie sie jeweils auf einen Durchmesser von 1 cm zuschneiden. Legen Sie die vorbereiteten Nitrozellulosepapiere auf eine Agarplatte, die das entsprechende Medium enthält.
  4. Pipettieren Sie 50 μL der verdünnten Bakterienkultur auf das Filterpapier.
  5. Pipettieren Sie 50 μl eines geeigneten Mediums auf die Mitte jeder Probenoberfläche.
  6. Heben Sie das Nitrozellulosepapier mit einer sterilisierten Pinzette von der Oberfläche des Agars auf. Drehen Sie das Nitrozellulosepapier vorsichtig um und legen Sie es auf die Probenoberfläche, so dass die Bakterien mit den 50 μl Medium und der nanostrukturierten Oberfläche in Kontakt kommen.
  7. Geben Sie 1 ml Tris-Puffer in jede Vertiefung, die eine Probe enthält, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Inkubieren Sie die Polystyrol-Well-Platte mit allen Proben bei 37 °C für 24 h.
  8. Sammeln Sie das Nitrozellulosepapier von jeder Probenoberfläche. Geben Sie jeweils 5 ml Tris-Puffer hinzu. Verschieben Sie die gesammelten Filterpapiere und nanobeschichteten Materialproben für 5 s.
  9. Beschallen Sie jede Probe 10 Minuten lang. Vortex für 5 s nach 5 min und erneut nach 10 min.
  10. Sammeln Sie die Tris-Puffersuspensionen aus allen Proben und geben Sie jedes Volumen in einzelne frische Sammelröhrchen.
  11. Die Proben werden gemäß den Schritten 2.6.2-2.6.6 seriell verdünnt und beschichtet.

6. Charakterisierung von Bakterien und Nanomaterialien nach der Kultur

  1. Untersuchung der bakteriellen Adhäsion und Morphologie mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM)
    1. Geben Sie nach der Inkubation über Nacht 10 % Glutaraldehyd in jede Vertiefung der 48-Well-Polystyrolplatte, die nicht mit Gewebe behandelt wurde, bis die Proben vollständig bedeckt sind. Inkubieren Sie die Proben 1 Stunde lang, um die Bakterienzellen zu fixieren.
    2. Saugen Sie das Glutaraldehyd in eine Abfallflasche ab und spülen Sie alle Proben 3x mit Tris-Pufferlösung aus, um nicht anhaftende Bakterien zu entfernen.
    3. Dehydrieren Sie die Proben mit 30 %, 75 % und 100 % Ethanol für jeweils 30 Minuten16.
      Anmerkungen: Es wird empfohlen, zum Trocknen der Proben einen Trockner für kritische Punkte zu verwenden. Es ist nicht ideal, die Proben 24 Stunden lang bei Raumtemperatur an der Luft zu trocknen.
    4. Verwenden Sie leitfähige Klebebänder, wie Kupfer- oder Kohlebänder, um die Proben auf einem REM-Probenteller zu befestigen. Beschichten Sie die Probenoberflächen mit einer Sputterbeschichtung, um die Leitfähigkeit vor der Bildgebung zu gewährleisten (z. B. beschichten Sie Mg-Platten mit anhaftenden Bakterien unter Platin/Palladium (Pt/Pd) für 45 s bei 20 mA16).
      Anmerkungen: Die Beschichtungsmaterialien, die Verarbeitungszeit und der Betriebsstrom können je nach Probentyp variieren.
    5. Nehmen Sie Bilder der Bakterien auf den Proben mit REM mit einem geeigneten Arbeitsabstand und Beschleunigungsspannung und mit den gewünschten Vergrößerungen auf. Verwenden Sie beispielsweise ein REM mit einem Sekundärelektronendetektor, um Bilder mit einem Arbeitsabstand von 5 mm und einer Beschleunigungsspannung von 10 kV16 aufzunehmen.
  2. Untersuchen Sie die Oberflächenmorphologie von Nanomaterialproben nach der Kultur mit Hilfe von REM.
    1. Bei Nanomaterialien waschen Sie die Proben 3x mit Tris-Puffer, um die freien Bakterien zu entfernen, die nicht an die Probe gebunden sind. Dispergieren Sie die Partikel bei Nanopartikeln durch Ultraschall in einem Lösungsmittel, das die Probeneigenschaften nicht beeinträchtigt, um bei Bedarf eine bessere Dispersion zu erzielen.
    2. Trocknen Sie die Proben nach dem Waschvorgang.
    3. Verwenden Sie doppelseitige Klebebänder aus Kohle oder Kupfer, um die Proben auf den REM-Probenteller zu kleben.
    4. Vor der Bildgebung wird mit einem Sputter-Coater, wie in Schritt 6.1.4 beschrieben, eine leitfähige Oberflächenschicht aus Pt/Pd erzeugt. Nehmen Sie die Beispielbilder wie in Schritt 6.1.5 beschrieben.
    5. Analysieren Sie die Oberflächenelementzusammensetzung mittels EDS mit geeigneter Beschleunigungsspannung und bei den gewünschten Vergrößerungen (z. B. bei 10 kV nach Durchführung der REM-Analyse16).
  3. Fluoreszenzbildgebung der bakteriellen Adhäsion
    1. Bereiten Sie die Proben für die Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie vor, indem Sie sie zunächst 3x mit Tris-Puffer waschen. Trocknen Sie die Proben bei Raumtemperatur an der Luft.
    2. Färben Sie jede Probe mit 10 μM Thioflavin-T-Fluoreszenzfarbstoff nach dem etablierten Protokoll37.
    3. Führen Sie eine Fluoreszenzbildgebung der bakteriellen Adhäsion mit einem inversen Mikroskop durch, das mit einer elektronenmultiplizierenden ladungsgekoppelten Digitalkamera gekoppelt ist.

Ergebnisse

Die Identifizierung der antibakteriellen Aktivität von Magnesiumoxid-Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen wurde anhand von vier In-vitro-Methoden vorgestellt, die auf verschiedene Materialtypen und mikrobielle Spezies anwendbar sind.

Methode A und Methode B untersuchen bakterielle Aktivitäten, wenn sie Nanopartikeln in einer Verzögerungsphase (Methode A) und einer logarithmischen Phase (Methode B) für einen Zeitraum von 24 Stunden oder länger ausgesetzt werden. Metho...

Diskussion

Wir haben vier in vitro Methoden (A-D) vorgestellt, um die antibakteriellen Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen zu charakterisieren. Während jede dieser Methoden das Wachstum und die Lebensfähigkeit von Bakterien im Laufe der Zeit als Reaktion auf Nanomaterialien quantifiziert, gibt es einige Unterschiede bei den Methoden, die zur Messung der anfänglichen bakteriellen Aussaatdichte, des Wachstums und der Lebensfähigkeit im Laufe der Zeit verwendet werden. Drei dieser Methoden, ...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren bedanken sich für die finanzielle Unterstützung durch die U.S. National Science Foundation (NSF CBET Award 1512764 und NSF PIRE 1545852), die National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), das Regents Faculty Development Fellowship der University of California (UC), das Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) und das UC-Riverside Graduate Research Mentorship Program Grant, das Patricia Holt-Torres verliehen wurde. Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung durch die Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) an der UC-Riverside für den Einsatz von REM/EDS und Dr. Perry Cheung für den Einsatz von XRD. Die Autoren bedanken sich auch bei Morgan Elizabeth Nator und Samhitha Tumkur für ihre Unterstützung bei den Experimenten und Datenanalysen. Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Artikel geäußert werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation oder der National Institutes of Health wider.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeMilipore SigmaZ336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven MTI CorporationBPG-7082https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer Sigma-Aldrich 42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADEFisher Scientific50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera HamamatsuC9100-13
Falcon 15 mL conical tubesFisher Scientific14-959-49B
GluteraldehydeSigma-Aldrich G5882
HemocytometerBrightline, Hausser Scientific1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES)PerkinElmer8000
Inverse microscopeNikonEclipse Ti-S
Luria Bertani BrothSigma Life Science L3022
Luria Bertani Broth + agarSigma Life Science L2897
MacroTube 5.0  Benchmark ScientificC1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticlesUS Research Nanomaterials, IncStock #: US3310   MMgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro BalanceMettler ToledoMS105D
Nitrocellulose paperFisherbrand09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plateFalcon Corning Brand 351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plateFalcon Corning Brand 351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plateFalcon Corning Brand 351172
Petri dish 100 mmVWR470210-568
Petri dish, 15 mmFisherbrandFB0875713A
pH meterVWRSP70P
Scanning electron microscopy (SEM)TESCAN Vega3 SBH
SonicatorVWR97043-936
Table top centrifugeFisher ScientificaccuSpin Micro 17
Table top centrifuge EppendorfCentrifuge 5430
Tryptic Soy AgarMP1010617
Tryptic Soy BrothSigma-Aldrich22092-500G
UV-Vis spectrophotometer TecanInfinite 200 PROhttps://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10LVWRN/A
X-ray power defraction PanalyticalN/APANalytical Empyrean Series 2

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