Évaluation des activités antimicrobiennes des nanoparticules et des surfaces nanostructurées in vitro

Résumé

Nous introduisons quatre méthodes pour évaluer les activités antimicrobiennes des nanoparticules et des surfaces nanostructurées à l’aide de techniques in vitro . Ces méthodes peuvent être adaptées pour étudier les interactions de différentes nanoparticules et surfaces nanostructurées avec un large éventail d’espèces microbiennes.

Résumé

Les activités antimicrobiennes des nanoparticules et des surfaces nanostructurées, telles que l’argent, l’oxyde de zinc, le dioxyde de titane et l’oxyde de magnésium, ont déjà été explorées dans des contextes cliniques et environnementaux et dans des produits alimentaires consommables. Cependant, un manque de cohérence dans les méthodes expérimentales et les matériaux utilisés a abouti à des résultats contradictoires, même entre les études des mêmes types de nanostructures et espèces bactériennes. Pour les chercheurs qui souhaitent utiliser des nanostructures comme additif ou revêtement dans la conception d’un produit, ces données contradictoires limitent leur utilisation en milieu clinique.

Pour faire face à ce dilemme, dans cet article, nous présentons quatre méthodes différentes pour déterminer les activités antimicrobiennes des nanoparticules et des surfaces nanostructurées, et discutons de leur applicabilité dans différents scénarios. L’adaptation de méthodes cohérentes devrait conduire à des données reproductibles qui peuvent être comparées entre les études et mises en œuvre pour différents types de nanostructures et espèces microbiennes. Nous introduisons deux méthodes pour déterminer les activités antimicrobiennes des nanoparticules et deux méthodes pour les activités antimicrobiennes des surfaces nanostructurées.

Pour les nanoparticules, la méthode de coculture directe peut être utilisée pour déterminer les concentrations minimales inhibitrices et bactéricides minimales des nanoparticules, et la méthode de culture en exposition directe peut être utilisée pour évaluer en temps réel l’activité bactériostatique par rapport à l’activité bactéricide résultant de l’exposition aux nanoparticules. Pour les surfaces nanostructurées, la méthode de culture directe est utilisée pour déterminer la viabilité des bactéries indirectement et directement en contact avec des surfaces nanostructurées, et la méthode d’exposition par contact focalisé est utilisée pour examiner l’activité antimicrobienne sur une zone spécifique d’une surface nanostructurée. Nous discutons des variables expérimentales clés à prendre en compte pour la conception d’études in vitro lors de la détermination des propriétés antimicrobiennes des nanoparticules et des surfaces nanostructurées. Toutes ces méthodes sont relativement peu coûteuses, utilisent des techniques relativement faciles à maîtriser et reproductibles pour plus de cohérence, et sont applicables à un large éventail de types de nanostructures et d’espèces microbiennes.

Introduction

Rien qu’aux États-Unis, 1,7 million de personnes développent une infection nosocomiale (IAS) chaque année, une infection sur 17 entraînant la mort¹. De plus, on estime que les coûts de traitement des IASS varient de 28 milliards de dollars à 45 milliards de dollars par année ^1,2. Ces IAS sont prédominées par Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM)^3,4 et Pseudomonas aeruginosa^4, qui sont généralement isolés des infections chroniques des plaies et nécessitent généralement un traitement intensif et du temps pour produire un résultat favorable pour le patient.

Au cours des dernières décennies, plusieurs classes d’antibiotiques ont été développées pour traiter les infections liées à ces bactéries et à d’autres bactéries pathogènes. Par exemple, des analogues de la rifamycine ont été utilisés pour traiter le SARM, d’autres infections à Gram positif et à Gram négatif, et les infections à Mycobacterium spp.⁵. Dans les années 1990, pour traiter efficacement un nombre croissant d’infections à M. tuberculosis, des médicaments supplémentaires ont été combinés avec des analogues de rifamycine pour augmenter leur efficacité. Cependant, environ 5 % des cas de M. tuberculosis demeurent résistants àla rifampicine^5,6, et on s’inquiète de plus en plus des bactéries multirésistantes⁷. Actuellement, l’utilisation d’antibiotiques seuls peut ne pas être suffisante dans le traitement des IASS, ce qui a provoqué une recherche continue de thérapies antimicrobiennes alternatives¹.

Les métaux lourds, tels que l’argent (Ag)^8,9,10 et l’or (Au)11, et les céramiques, telles que le dioxyde de titane (TiO 2)12 et l’oxyde de zinc (ZnO)¹³, sous forme de nanoparticules (NP) (AgNP, AuNP, TiO₂ NP et ZnONP^, respectivement) ont été examinés pour leurs activités antimicrobiennes et ont été identifiés comme des alternatives antibiotiques potentielles. En outre, les matériaux biorésorbables, tels que les alliages de magnésium (alliages Mg)14,15,16, les nanoparticules d’oxyde de magnésium 17,18,19,20,21 et les nanoparticules d’hydroxyde de magnésium [nMgO et nMg(OH)2, respectivement]^22,23,24, ont également été examinés. Cependant, les études antimicrobiennes antérieures sur les nanoparticules utilisaient des matériaux et des méthodes de recherche incohérents, ce qui a donné lieu à des données difficiles ou impossibles à comparer et parfois contradictoires^{par nature 18,19}. Par exemple, la concentration minimale inhibitrice (CMI) et la concentration bactéricide minimale (MBC) des nanoparticules d’argent variaient considérablement selon les études. Ipe et ^coll.25 ont évalué les activités antibactériennes des AgNP avec une taille moyenne de particules de ~26 nm afin de déterminer les CMI contre les bactéries à Gram positif et à Gram négatif. Les CMI identifiées pour P. aeruginosa, E. coli, S. aureus et SARM étaient de 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL et 10 μg/mL, respectivement. En revanche, Parvekar et ^coll.26 ont évalué les PN Agn avec une taille moyenne des particules de 5 nm. Dans ce cas, la CMI AgNP et une CMM de 0,625 mg/mL se sont révélées efficaces contre S. aureus. De plus, Loo et ^al.27 ont évalué les AgNP d’une taille de 4,06 nm. Lorsque E. coli a été exposé à ces nanoparticules, le CMI et le MBC ont été signalés à 7,8 μg/mL. Enfin, Ali et ^coll.28 ont étudié les propriétés antibactériennes des AgNP sphériques d’une taille moyenne de 18 nm. Lorsque P. aeruginosa, E. coli et SARM ont été exposés à ces nanoparticules, la CMI a été identifiée à 27 μg/mL, 36 μg/mL, 27 μg/mL et 36 μg/mL, respectivement, et le MBC a été identifié à 36 μg/mL, 42 μg/mL et 30 μg/mL, respectivement.

Bien que l’activité antibactérienne des nanoparticules ait été largement étudiée et rapportée au cours des dernières décennies, il n’existe pas de norme pour les matériaux et les méthodes de recherche utilisés pour permettre des comparaisons directes entre les études. Pour cette raison, nous présentons deux méthodes, la méthode de co-culture directe (méthode A) et la méthode d’exposition directe (méthode B), pour caractériser et comparer les activités antimicrobiennes des nanoparticules tout en maintenant la cohérence des matériaux et des méthodes.

En plus des nanoparticules, les surfaces nanostructurées ont également été examinées pour leurs activités antibactériennes. Il s’agit notamment de matériaux à base de carbone, tels que les nanofeuilles de graphène, les nanotubes de carbone et le graphite²⁹, ainsi que les alliages Mg et Mg purs. Chacun de ces matériaux a présenté au moins un mécanisme antibactérien, y compris des dommages physiques imposés aux membranes cellulaires par des matériaux à base de carbone et des dommages aux processus métaboliques ou à l’ADN par la libération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) lorsque le Mg se dégrade. De plus, lorsque le zinc (Zn) et le calcium (Ca) sont combinés dans la formation d’alliages Mg, le raffinement de la taille des grains de la matrice Mg est amélioré, ce qui entraîne une réduction de l’adhérence bactérienne aux surfaces du substrat par rapport aux échantillons de Mg seuls¹⁴. Pour démontrer l’activité antibactérienne, nous présentons la méthode de culture directe (méthode C), qui détermine l’adhésion bactérienne sur et autour des matériaux nanostructurés au fil du temps grâce à la quantification des unités bactériennes formant colonies (UFC) avec contact direct et indirect avec la surface.

La géométrie des nanostructures sur les surfaces, y compris la taille, la forme et l’orientation, pourrait influencer les activités bactéricides des matériaux. Par exemple, Lin et ^coll.16 ont fabriqué différentes couches nanostructurées de MgO à la surface de substrats de Mg par anodisation et dépôt électrophorétique (EPD). Après une période d’exposition à la surface nanostructurée in vitro, la croissance de S. aureus a été considérablement réduite par rapport au Mg non traité. Cela indiquait une plus grande puissance de la surface nanostructurée contre l’adhésion bactérienne par rapport à la surface métallique Mg non traitée. Pour révéler les différents mécanismes des propriétés antibactériennes de diverses surfaces nanostructurées, une méthode d’exposition par contact focalisé (méthode D) qui détermine les interactions cellule-surface dans la zone d’intérêt est discutée dans cet article.

L’objectif de cet article est de présenter quatre méthodes in vitro applicables à différentes nanoparticules, surfaces nanostructurées et espèces microbiennes. Nous discutons des considérations clés pour chaque méthode afin de produire des données cohérentes et reproductibles à des fins de comparabilité. Plus précisément, la méthode de coculture directe¹⁷ et la méthode d’exposition directe sont utilisées pour examiner les propriétés antimicrobiennes des nanoparticules. Grâce à la méthode de coculture directe, les concentrations minimales inhibitrices et bactéricides minimales (CMI et MBC_90-99,99, respectivement) peuvent être déterminées pour les espèces individuelles_, et la concentration la plus puissante (CMP) peut être déterminée pour plusieurs espèces. Grâce à la méthode d’exposition directe, les effets bactériostatiques ou bactéricides des nanoparticules à des concentrations minimales inhibitrices peuvent être caractérisés par des lectures de densité optique en temps réel au fil du temps. La méthode de culture directe¹⁴ convient à l’examen direct et indirect des bactéries en contact direct et indirect avec des surfaces nanostructurées. Enfin, la méthode d’exposition par contact focalisé¹⁶ est présentée pour examiner l’activité antibactérienne d’une zone spécifique sur une surface nanostructurée par l’application directe de bactéries et la caractérisation de la croissance bactérienne à l’interface cellule-nanostructure. Cette méthode est modifiée à partir de la norme industrielle japonaise JIS Z 2801:2000¹⁶ et vise à se concentrer sur les interactions microbes-surface et à exclure les effets de la dégradation de l’échantillon en vrac en culture microbienne sur les activités antimicrobiennes.

Protocole

Pour présenter les méthodes de co-culture directe et d’exposition directe, nous utilisons des nanoparticules d’oxyde de magnésium (nMgO) comme matériau modèle pour démontrer les interactions bactériennes. Pour présenter les méthodes de culture directe et d’exposition par contact focalisé, nous utilisons un alliage Mg avec des surfaces nanostructurées comme exemples.

1. Stérilisation des nanomatériaux

NOTE: Tous les nanomatériaux doivent être stérilisés ou désinfectés avant la culture microbienne. Les méthodes qui peuvent être utilisées comprennent la chaleur, la pression, le rayonnement et les désinfectants, mais la tolérance des matériaux pour chaque méthode doit être déterminée avant les expériences in vitro .

1. Nanoparticules
   REMARQUE : Les échantillons peuvent être entreposés dans un solvant organique tel que l’éthanol ou emballés dans un plat ou une boîte, suivis d’une stérilisation ou d’une désinfection appropriée. Les nanoparticules ont été stérilisées à l’aide de la méthode suivante pour la démonstration de la méthode de coculture directe¹⁷ et de la méthode d’exposition directe.
   1. Stériliser les nanoparticules de MgO dans un four à convection à 200 °C^{30 pendant 60} minutes avant chaque expérience in vitro .
      NOTE: Cette méthode a été choisie parce que la vapeur d’eau et la lumière UV peuvent affecter les structures des nanoparticules de MgO (nMgO)¹⁷.
2. Matériaux en vrac
   NOTE: Les matériaux nanostructurés ont été stérilisés par la méthode suivante pour la démonstration de la méthode de culture directe.
   1. Pour la méthode de culture directe¹⁴, désinfecter les échantillons de ZC21, Mg et T64 préparés en utilisant un rayonnement ultraviolet (UV) pendant 4 heures avant d’entreprendre les études in vitro .
   2. Pour la méthode d’exposition par contact focalisé¹⁶, désinfecter tous les échantillons par rayonnement UV pendant 2 heures avant le début des études in vitro .
3. Vous pouvez également utiliser de l’oxyde d’éthylène (EtO) pour la stérilisation des matériaux thermosensibles.

2. Méthode de co-culture directe (méthode A)

NOTE: Dans la méthode A, les bactéries dans une culture d’ensemencement en phase de décalage sont directement mélangées avec des nanoparticules de certaines concentrations. Pour l’examen des activités antimicrobiennes des nanoparticules, nous suivons un protocole décrit par Nguyen et ^al.17.

1. Caractérisation des nanoparticules et des nanostructures
   REMARQUE: La composition et la forme de la nanostructure sont confirmées par diffraction de poudre aux rayons X.
   1. Mesure des nanoparticules
      1. Peser les nanoparticules à 9x la masse désirée par mL pour accueillir 3 mL d’échantillons en trois exemplaires. Par exemple, peser 0,2 mg/mL nMgO à 1,8 mg/mL.
         REMARQUE: Cela garantit la distribution cohérente des nanoparticules dans les cultures bactériennes et les bouillons.
      2. Mesurer toutes les nanoparticules dans un tube microcentrifuge de 5,0 mL qui a été prépesé et taré à l’aide d’une balance analytique.
2. Préparation et culture de cultures bactériennes
   1. Pour chaque expérience in vitro , prélever des stocks de cellules bactériennes du stockage à -80 °C. Ajouter 10 μL de chaque stock de cellules bactériennes dans 5 mL d’un milieu de croissance approprié.
   2. Placer le milieu inoculé dans un incubateur-agitateur à 37 °C et 250 tr/min pendant environ 16 h pendant une nuit.
      1. Si des espèces de Staphylococcus sont cultivées, sous-cultiver en plaçant 400 μL de chaque culture de nuit dans 20 mL de milieu de croissance frais (100 μL/5 mL de milieu) et incuber en agitant à 37 °C et 250 rpm pendant 4 à 6 h supplémentaires.
3. Lavage et comptage des cellules bactériennes pour déterminer la densité d’ensemencement
   REMARQUE : La densité de semis souhaitée de 7,8 × 10⁶ UFC/ml a été identifiée comme le nombre de cellules supérieur à ce qui est nécessaire pour confirmer une infection des voies urinaires.
   1. Recueillir les bactéries cultivées en aliquote 1 mL de la culture bactérienne de nuit dans des tubes microcentrifugés de 1,5 mL. Créer un nombre suffisant d’aliquotes à partir de cultures bactériennes de nuit et les centrifuger pendant 10 minutes à 1 956 × g pour atteindre les densités de semis souhaitées.
   2. Après centrifugation, pipeter pour retirer le surnageant des cellules granulées et placer le surnageant dans un récipient de collecte. Remettez en suspension les granulés cellulaires dans 0,5 mL de milieu de croissance frais. Combinez deux suspensions de 0,5 mL pour créer 1 mL de suspension afin de réduire à six le nombre d’aliquotes de 1 mL de cellules en remise en suspension. Répéter la centrifugation pendant 10 min à 1 956 × g.
   3. Effectuer un deuxième cycle de lavage en utilisant un milieu de croissance frais, comme à l’étape 2.3.2, afin de réduire à trois le nombre d’aliquotes de 1 mL de cellules lavées en resuspension.
   4. Terminer le troisième cycle, comme à l’étape 2.3.2, sauf remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 0,33 mL de tampon Tris (hydroxyméthyl)aminométhane tampon (tampon Tris, pH 8,5). Combinez les trois suspensions, chacune d’un volume de 0,33 mL, en une microcentrifugeuse de 1,5 mL. Répéter la centrifugation pendant 10 min à 1 956 × g.
      REMARQUE: Le tampon Tris ne contient pas d’ions Mg 2+ ou Ca^{2+ 31}. Ceci est important pour l’utilisation de la spectrométrie d’émission optique à plasma à couplage inductif (ICP-OES) pour mesurer les ions Mg 2+ et Ca²⁺ dans les bouillons post-culture. En revanche, les phosphates présents dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS)³², par exemple, séquestrent les ions Mg 2+ ou Ca^{2+ 33,34,35} et créent une confusion dans l’interprétation des données ICP-OES.
   5. Retirez le surnageant des cellules granulées. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon Tris frais, connu sous le nom de suspension cellulaire - une culture d’ensemencement bactérien en phase de retard.
   6. Déterminer la concentration de suspension cellulaire (cellules/mL) à l’aide d’un hémocytomètre.
4. Création de la culture de bactéries d’ensemencement
   REMARQUE : L’échantillon a un volume total de 3 mL et est complété en triple exemplaire (9 mL au total).
   1. Déterminer le volume total de culture d’ensemencement de bactéries nécessaire. Pour créer la culture d’ensemencement, utilisez C 1 V₁= C 2 V₂ pour calculer le volume de la suspension cellulaire nécessaire pour créer une culture d’ensemencement de 7,8 × 10⁶ cellules/mL. Ajouter le volume calculé de la suspension cellulaire (V₁) au volume requis de milieu de culture (V₂).
   2. Déterminer la densité réelle d’ensemencement des bactéries en UFC/mL. Créer une dilution en série décuplée à ^10-4. Étaler la dilution ^10-4 sur la gélose de croissance appropriée et incuber pendant la nuit. Après l’incubation, compter le nombre de colonies et calculer l’UFC/mL.
5. Formation de cultures de bactéries et de nanoparticules
   1. Dans les plaques de polystyrène non tissulaires à 12 puits, aliquote 2 mL de la culture d’ensemencement bactérien dans chaque puits pour le nombre de puits nécessaires.
   2. Pour chaque tube microcentrifuge de 5 mL contenant du nMgO prépesé, ajouter 3 mL de la culture d’ensemencement bactérienne. Vortex brièvement pour mélanger le nMgO avec la bactérie. Aliquote 1 mL du mélange dans trois puits distincts pour créer les échantillons triplicés de chaque poids pré-mesuré de nMgO. Pipeter le mélange bactéries/nMgO 2-3x avant chaque aliquote de 1 mL est faite pour maintenir le nMgO en suspension.
      REMARQUE : Les échantillons témoins seront constitués de 3 mL de cellules seulement, de 3 mL de milieux seulement et de 3 mL contenant les concentrations les plus faibles et les plus élevées de nanoparticules utilisées. Ceux-ci sont préparés comme à l’étape 2.5.2. Tous les échantillons de contrôle sont remplis en trois exemplaires.
   3. Incuber toutes les plaques de 12 puits à 37 °C et 120 tr/min pendant 24 h.
6. Détermination de la croissance cellulaire bactérienne après exposition au nMgO
   1. Après une nuit d’incubation des cultures bactériennes, prélever tous les 3 mL d’échantillon en pipetant dans un tube conique individuel de 15 mL.
   2. Utilisez une plaque de 96 puits pour créer des dilutions en série 1:10. Déterminer le nombre de colonnes nécessaires pour diluer en série tous les échantillons contenant des bactéries. Ajouter 180 μL de tampon Tris à chaque puits de la rangée B à la rangée G pour le nombre approprié de colonnes.
   3. Vortex brièvement chaque tube conique de 15 mL contenant des échantillons bactériens et ajouter 50 μL à un puits individuel dans la rangée A.
   4. Pour chaque puits de la rangée A, transférer 20 μL dans la rangée B (p. ex. A1 à B1) et mélanger brièvement par pipetage pour obtenir un volume de 200 μL. À l’aide d’une pointe de pipette stérile, transférer 20 μL du puits de la rangée B au puits de la rangée C. Poursuivre ce schéma jusqu’à ce que le puits de la rangée G contienne 200 μL, complétant une dilution en série de 10−¹ dans la ligne B à 10⁻⁶ dans la ligne G.
   5. Pipeter 100 μL de chaque puits sur une plaque de gélose de croissance appropriée et étaler sur la plaque pour disperser la culture cellulaire. Placer les plaques dans un incubateur-agitateur pendant une nuit à 37 °C. Incuber les plaques à 37 °C pendant 24 h.
   6. Examinez les plaques et comptez celles qui ont environ 25 à 300 colonies. Si possible, choisir des plaques ayant la même valeur de dilution. Utilisez le nombre de colonies par plaque pour calculer l’UFC/mL.
7. Évaluation du pH post-incubation
   REMARQUE : Suivez les instructions du fabricant pour chaque modèle de pH-mètre.
   1. Préétalonner un pH-mètre à l’aide de solutions normalisées de pH 4, pH 7 et pH 10. Lisez chaque échantillon bactérien en plaçant la sonde de pH dans le tube conique de 15 mL.
8. Préparation des échantillons pour le PC-OES
   NOTE: ICP-OES est utilisé pour déterminer la concentration d’ions Mg 2+ et Ca²⁺. Ces cations sont considérés comme importants, car chacun participe au métabolisme cellulaire.
   1. Centrifuger chaque tube conique de 15 mL préparé à l’étape 2.6.1 pendant 5 min à 5 724 × g pour enrober les débris cellulaires et nanoparticulaires.
   2. À l’aide d’un tube conique de 15 mL, diluer 30 μL du surnageant dans 2,97 mL d’eau filtrée de 18,2 Ω pour obtenir une dilution de 1:100.
      NOTE: Le facteur de dilution peut être ajusté en fonction des concentrations d’ions projetées et de la limite de détection de l’instrument du spectromètre.
   3. Lisez les exemples à l’aide d’ICP-OES.

3. Méthode d’exposition directe (méthode B)

NOTE: Si le taux de croissance de la bactérie choisie est inconnu, une normalisation de la courbe de croissance doit être effectuée avant de mettre en œuvre cette méthode.

1. Déterminer les activités bactériostatiques et bactéricides en temps réel lors de l’exposition aux nanoparticules d’intérêt.
   1. Préparer les concentrations souhaitées de nanoparticules en utilisant les méthodes décrites aux étapes 2.1-2.1.2.2. Préparer deux séries de chaque poids de nanoparticules à utiliser : l’une à ajouter à 3 mL d’aliquotes de culture bactérienne dans la phase de croissance logarithmique, et l’autre à ajouter à 3 mL d’aliquotes de milieu de croissance sans bactéries comme groupes témoins.
   2. Déterminer les antibiotiques bactériostatiques et bactéricides appropriés pour les espèces bactériennes à tester.
      REMARQUE : La connaissance de la concentration minimale inhibitrice de chaque antibiotique est requise.
2. Calculer le volume total de culture bactérienne nécessaire pour trois échantillons de 3 mL pour tous les échantillons de nanoparticules, d’antibiotiques et de contrôle.
   NOTE: Un volume égal de milieu de croissance stérile est requis. Si l’utilisation de la spectrophotométrie est prévue, il faut pour cela ajuster le volume total nécessaire pour accommoder le volume de 0,5 mL à 1,0 mL nécessaire pour les cuvettes.
3. Jour 1 : Pour chaque expérience in vitro, constituer des stocks de nuit en suivant les étapes 2.2.1-2.2.2.
4. Jour 2: Confirmez que les paramètres du lecteur de plaques peuvent accueillir une plaque de 96 puits avec une densité optique de 600 nm. Mesurer les échantillons dans des aliquotes de 200 μL à l’aide d’une plaque de 96 puits.
   1. Déterminer une culture bactérienne initiale OD₆₀₀ à 0,01 - la densité utilisée pour commencer la période d’incubation initiale avant l’ajout de nanoparticules et d’antibiotiques.
   2. Recueillir la culture bactérienne pendant la nuit de l’incubateur-agitateur.
      1. Pour chaque matériau (p. ex. nanoparticules ou antibiotiques prémesurés) à tester, créer une culture bactérienne distincte à une DO₆₀₀ de 0,01. Utiliser un contenant suffisamment grand pour contenir le volume de culture cellulaire nécessaire (p. ex., un erlenmeyer stérilisé ou des tubes coniques de 50 mL).
      2. Diluer les échantillons bactériens de nuit avec le milieu de croissance en plaçant trois aliquotes de 200 μL du milieu de croissance dans trois puits et trois aliquotes de 200 μL de la culture bactérienne dans des puits supplémentaires (p. ex. A1 à A6).
      3. Placez la plaque de 96 puits dans le lecteur de plaques et scannez-la.
         REMARQUE : La moyenne des lectures est calculée pour chaque puits numérisé afin de produire une valeur moyenne.
      4. Pour calculer la densité des bactéries en suspension, faire la moyenne de la valeur moyenne pour chaque puits contenant un échantillon triple.
      5. Pour déterminer la densité optique de la bactérie, soustrayez la moyenne de l’échantillon de bouillon de la moyenne bactérienne.
      6. S’il est nécessaire de continuer à ajuster la suspension bactérienne, continuer à ajouter du bouillon ou une culture bactérienne pendant la nuit au besoin, et répéter le balayage dans le lecteur de plaques au besoin jusqu’à ce qu’une DO₆₀₀ d’environ 0,01 soit atteinte.
      7. Incuber à 37 °C en agitant à 150 rpm jusqu’à ce que la croissance logarithmique soit atteinte.
5. Retirez les cultures bactériennes de l’agitateur de l’incubateur.
   1. Aliquote 3 mL de la culture bactérienne OD₆₀₀ 0,01 dans des tubes coniques marqués de 15 mL pour les échantillons d’essai et de contrôle en triplicate.
   2. Aliquote 200 μL de la culture bactérienne dans trois puits d’une plaque de 96 puits et mesurer les échantillons à l’aide du lecteur de plaques.
   3. Calculer les lectures comme décrit précédemment aux étapes 3.4.2.2 et 3.4.2.6 - la « lecture -0,5 h ».
6. Création et mesure de mélanges bactéries/nanoparticules
   1. Aliquote 3 mL de milieu de croissance stérile en nombre égal aux cultures bactériennes dans des tubes coniques marqués de 15 mL pour les échantillons témoins (en trois exemplaires).
   2. Pour préparer des suspensions de bactéries/nanoparticules et des milieux stériles/suspensions de nanoparticules, prélever 1 mL de culture bactérienne ou de milieu de chaque triple jeu de tubes coniques de 15 mL.
      1. Placer les aliquotes de 1 mL dans un tube centrifuge de 5 mL contenant des nanoparticules pré-mesurées, et vortex brièvement mélanger.
      2. À partir du tube à centrifuger de 5 mL, retourner 1 mL d’aliquotes des suspensions bactéries/nanoparticules ou moyennes/nanoparticules dans le tube conique de 15 mL pour répartir les nanoparticules de manière homogène.
         REMARQUE: Pipeter le mélange bactéries/nanoparticules 2x-3x avant chaque aliquote de 1 mL est pipeté pour maintenir les nanoparticules en suspension.
7. Création et mesure de mélanges bactéries/antibiotiques
   1. Pour créer les cultures bactériennes/antibiotiques, aliquote 3 mL de la culture bactérienne incubée dans les tubes coniques de 15 mL étiquetés en conséquence.
   2. Une fois que tous les échantillons ont été préparés, aliquote 200 μL de chaque échantillon dans les puits individuels d’une plaque de 96 puits.
   3. Placez la ou les plaques dans le lecteur de plaques et lancez la numérisation - la lecture « 0 h ».
   4. Placer les tubes coniques de 15 mL contenant les échantillons dans un incubateur-agitateur à 37 °C et 150 tr/min. Enregistrez toutes les données décrites précédemment aux étapes 3.4.2.2 et 3.4.2.6.
8. Environ 15 minutes après avoir terminé la lecture de 0 h, répétez les étapes décrites aux étapes 3.7.2-3.7.3 - la lecture de « 0,5 h ».
   1. Après 0 h établie, répéter les étapes décrites à l’étape 3.7.2-étape 3.7.3 toutes les 90 minutes pendant six cycles; Complet en 9 h.
   2. Une fois le sixième cycle terminé, placer les échantillons dans l’incubateur-agitateur pendant 15 heures supplémentaires à 37 °C et 150 tr/min. Répétez les étapes décrites aux étapes 3.7.2-3.7.3 pour obtenir la lecture de 24 heures. Enregistrez toutes les données décrites précédemment aux étapes 3.4.2.2 et 3.4.2.6.

4. Méthode de culture directe (méthode C)

NOTE: Dans la méthode C, les bactéries dans une culture d’ensemencement en phase de décalage sont placées directement sur les surfaces nanostructurées d’intérêt. Pour l’examen des activités antimicrobiennes de la nanostructure, nous suivons un protocole décrit par Zhang et ^al.14. Pour démontrer cette méthode de culture directe, des broches ZC21 (alliage Mg-Zn-Ca) et Mg ont été utilisées comme échantillons.

1. Préparation et culture des cultures bactériennes
   1. Pour chaque expérience in vitro, créer des stocks de nuit en suivant les étapes 2.2.1-2.2.2.
2. Lavage et comptage des bactéries pour déterminer la densité d’ensemencement
   REMARQUE : La densité de semis souhaitée de 7,5 × 10⁵ UFC/mL a été identifiée comme étant la concentration cellulaire signalée qui cause des infections orthopédiques¹⁴.
   1. Récupérez la culture bactérienne de nuit de l’incubateur-agitateur.
   2. Laver et recueillir les bactéries en suivant les étapes 2.3.2 à 2.3.2.3, mais remplacer le milieu frais par un liquide corporel simulé révisé (FSPr) pour chaque étape de lavage.
      REMARQUE: Le SBFr est une solution tampon qui imite la concentration ionique du plasma sanguin humain. Cependant, le SBFr ne contient que des composés inorganiques et est dépourvu de composés bioorganiques tels que les protéines. Afin de résoudre ce problème, le sérum bovin fœtal (FBS) est combiné avec le SBFr pour simuler la composition du sang humain afin de mieux imiter la formation naturelle d’apatite dans les tissus calcifiés dans des conditions expérimentales³⁶.
   3. Retirez le surnageant des cellules granulées. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de SBFr complété par 10% FBS-la suspension cellulaire.
   4. Déterminer la concentration de suspension cellulaire (cellules/mL) à l’aide d’un hémocytomètre. Diluer la suspension cellulaire à une concentration de 7,5 × 10⁵ cellules/mL dans du FBPr complété par 10 % de FBS. Créer une culture d’ensemencement à l’étape 2.4.1.
   5. Déterminer la densité de semis réelle après l’étape 2.4.2.
3. Répartir la suspension cellulaire bactérienne sur les échantillons dans les puits de culture.
   1. Placez les échantillons et les échantillons témoins dans les puits individuels d’une plaque de polystyrène non traitée aux tissus de 48 puits.
   2. Aliquote 0,75 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits contenant les échantillons et les témoins. Placer la ou les plaques à 48 puits dans un incubateur-agitateur pendant 24 h à 37 °C avec agitation à 120 tr/min.
4. Caractérisation de la concentration bactérienne
   1. Après 24 h d’incubation, prélever les échantillons et les placer dans des tubes de prélèvement distincts et étiquetés.
   2. Prélever deux échantillons de chaque groupe et les placer individuellement dans des tubes à microcentrifugeuses de 5,0 ml étiquetés. Ajouter 2 mL de SBFr dans chaque tube.
   3. Placer les échantillons prélevés à l’étape 4.4.2 dans un bain de sonication et soniquer pendant 10 min. Après chaque période de 5 minutes, vortex chaque échantillon pendant 5 s.
   4. Recueillir le SBFr contenant les cellules bactériennes nouvellement détachées et placer la suspension dans un tube microcentrifuge frais et étiqueté.
5. Dilutions en série et placage des bactéries
   1. Diluer en série et plaquer la suspension bactérienne en suivant les étapes 2.6.2-2.6.6.
6. Évaluer le pH post-incubation des milieux de culture en suivant l’étape 2.7.
7. Préparer le milieu de post-culture pour ICP-OES en suivant les méthodes décrites à l’étape 2.8.

5. Méthode d’exposition par contact focalisé (méthode D)

NOTE: Dans la méthode D, les bactéries sur un papier filtre de nitrocellulose sont mises en contact direct avec une zone d’intérêt sur les surfaces nanostructurées. Cette méthode minimise l’interférence de la dégradation de l’échantillon en vrac dans les cultures bactériennes avec les activités bactériennes. Pour examiner les activités antimicrobiennes des nanosurfaces, nous suivons un protocole décrit par Lin et ^al.16.

1. Suivez les procédures des étapes 2.2.1-2.2.2.1 pour créer une culture d’ensemencement bactérienne. Confirmer la densité de semis réelle après l’étape 2.4.2.
2. Préparer les échantillons à une taille de 1 × 1 cm² dans une forme carrée. Préparez tous les types d’échantillons en trois exemplaires. Si nécessaire, placez les échantillons sur un support tridimensionnel (3D) de 15 mm de diamètre sur 10 mm de hauteur. Placer l’échantillon et le support dans un puits d’une plaque de puits de polystyrène non traitée par culture tissulaire.
3. Préparer des papiers de nitrocellulose stérilisés en les coupant chacun à un diamètre de 1 cm. Placer les papiers de nitrocellulose préparés sur une plaque de gélose contenant le milieu approprié.
4. Pipet 50 μL de la culture bactérienne diluée sur le papier filtre.
5. Pipet 50 μL d’un milieu approprié sur le centre de chaque surface d’échantillon.
6. À l’aide d’une pince à épiler stérilisée, ramassez le papier de nitrocellulose à la surface de l’agar-agar. Retournez délicatement le papier de nitrocellulose et placez-le sur la surface de l’échantillon afin que les bactéries soient en contact avec les 50 μL de milieu et la surface nanostructurée d’intérêt.
7. Ajouter 1 mL de tampon Tris à chaque puits contenant un échantillon pour maintenir l’humidité. Incuber la plaque de puits en polystyrène contenant tous les échantillons à 37 °C pendant 24 h.
8. Prélever le papier de nitrocellulose sur chaque surface d’échantillon. Placer chacun dans 5 ml de tampon Tris. Vortex les papiers filtres collectés et les échantillons de matériaux nanosurfacés pendant 5 s.
9. Soniquer chaque échantillon pendant 10 min. Vortex pendant 5 s après 5 min et de nouveau après 10 min.
10. Recueillir les suspensions tampons Tris de tous les échantillons et placer chaque volume dans des tubes de collecte frais individuels.
11. Diluer les échantillons en série et les plaquer en suivant les étapes 2.6.2 à 2.6.6.

6. Caractérisation post-culture des bactéries et des nanomatériaux

1. Examen de l’adhérence bactérienne et de la morphologie par microscopie électronique à balayage (MEB)
   1. Après une nuit d’incubation, ajouter 10 % de glutaraldéhyde dans chaque puits de la plaque de polystyrène non tissulaire de 48 puits traités jusqu’à ce que les échantillons soient entièrement recouverts. Incuber les échantillons pendant 1 h pour fixer les cellules bactériennes.
   2. Aspirer le glutaraldéhyde dans un flacon de déchets et rincer tous les échantillons 3x avec la solution tampon Tris pour éliminer les bactéries non adhérentes.
   3. Déshydrater les échantillons en utilisant de l’éthanol à 30 %, 75 % et 100 % pendant 30 minutes tous les¹⁶ ans.
      REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser un sécheur à point critique pour sécher les échantillons. Il n’est pas idéal de sécher les échantillons à température ambiante pendant 24 h.
   4. Utilisez des rubans adhésifs conducteurs, tels que des rubans de cuivre ou de carbone, pour fixer les échantillons sur un talon SEM. Enduire les surfaces de l’échantillon au moyen d’un revêtement par pulvérisation pour fournir une conductivité avant l’imagerie (p. ex., enduire les plaques de Mg de bactéries adhérentes sous platine/palladium (Pt/) pendant 45 s à 20 mA¹⁶).
      REMARQUE: Les matériaux de revêtement, le temps de traitement et le courant de fonctionnement peuvent varier en fonction des types d’échantillons.
   5. Prenez des images des bactéries sur les échantillons en utilisant SEM avec une distance de travail appropriée et une tension d’accélération et aux grossissements souhaités. Par exemple, utilisez un MEB avec un détecteur d’électrons secondaire pour prendre des images à une distance de travail de 5 mm et une tension d’accélération de 10 kV¹⁶.
2. Examiner la morphologie de surface d’échantillons de nanomatériaux post-culture à l’aide de MEB.
   1. Pour les nanomatériaux, laver les échantillons à l’aide du tampon Tris 3x pour éliminer les bactéries libres qui ne sont pas attachées à l’échantillon. Pour les nanoparticules, disperser les particules dans un solvant qui n’affecte pas les propriétés de l’échantillon par ultrasons pour obtenir une meilleure dispersion en cas de besoin.
   2. Sécher les échantillons après la procédure de lavage.
   3. Utilisez des rubans adhésifs double face en carbone ou en cuivre pour coller les échantillons sur la souche SEM.
   4. Créer une couche superficielle conductrice de Pt/à l’aide d’un enrobage de pulvérisation, comme décrit à l’étape 6.1.4, avant l’imagerie. Prenez les exemples d’images comme décrit à l’étape 6.1.5.
   5. Analyser la composition élémentaire de surface à l’aide de l’EDS avec une tension d’accélération appropriée et aux grossissements souhaités (par exemple, à 10 kV après avoir effectué l’analyse MEB¹⁶).
3. Imagerie par fluorescence de l’adhésion bactérienne
   1. Préparer les échantillons à visualiser par microscopie à fluorescence en les lavant d’abord avec le tampon Tris 3x. Sécher les échantillons à l’air libre à température ambiante.
   2. Colorer chaque échantillon avec un colorant de fluorescence T thioflavine 10 μM selon le protocole^{établi 37}.
   3. Effectuer une imagerie par fluorescence de l’adhésion bactérienne à l’aide d’un microscope inversé couplé à un appareil photo numérique à couplage de charge multipliant les électrons.

Résultats

L’identification de l’activité antibactérienne des nanoparticules d’oxyde de magnésium et des surfaces nanostructurées a été présentée à l’aide de quatre méthodes in vitro applicables à différents types de matériaux et espèces microbiennes.

Les méthodes A et B examinent les activités bactériennes lorsqu’elles sont exposées à des nanoparticules en phase de décalage (méthode A) et en phase logarithmique (méthode B) pendant une durée de 24 heures ou plus....

Discussion

Nous avons présenté quatre méthodes in vitro (A-D) pour caractériser les activités antibactériennes des nanoparticules et des surfaces nanostructurées. Bien que chacune de ces méthodes quantifie la croissance et la viabilité bactériennes au fil du temps en réponse aux nanomatériaux, il existe une certaine variation dans les méthodes utilisées pour mesurer la densité, la croissance et la viabilité initiales de l’ensemencement bactérien au fil du temps. Trois de ces méthodes, la méthode de coc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Milipore Sigma	Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven	MTI Corporation	BPG-7082	https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer	Sigma-Aldrich	42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE	Fisher Scientific	50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera	Hamamatsu	C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Hemocytometer	Brightline, Hausser Scientific	1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES)	PerkinElmer	8000
Inverse microscope	Nikon	Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth	Sigma Life Science	L3022
Luria Bertani Broth + agar	Sigma Life Science	L2897
MacroTube 5.0	Benchmark Scientific	C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles	US Research Nanomaterials, Inc	Stock #: US3310   M	MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance	Mettler Toledo	MS105D
Nitrocellulose paper	Fisherbrand	09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351172
Petri dish 100 mm	VWR	470210-568
Petri dish, 15 mm	Fisherbrand	FB0875713A
pH meter	VWR	SP70P
Scanning electron microscopy (SEM)	TESCAN	Vega3 SBH
Sonicator	VWR	97043-936
Table top centrifuge	Fisher Scientific	accuSpin Micro 17
Table top centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar	MP	1010617
Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
UV-Vis spectrophotometer	Tecan	Infinite 200 PRO	https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L	VWR	N/A
X-ray power defraction	Panalytical	N/A	PANalytical Empyrean Series 2