Valutazione delle attività antimicrobiche di nanoparticelle e superfici nanostrutturate in vitro

Riepilogo

Introduciamo quattro metodi per valutare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate utilizzando tecniche in vitro . Questi metodi possono essere adattati per studiare le interazioni di diverse nanoparticelle e superfici nanostrutturate con una vasta gamma di specie microbiche.

Abstract

Le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate, come argento, ossido di zinco, biossido di titanio e ossido di magnesio, sono state esplorate in precedenza in contesti clinici e ambientali e in prodotti alimentari di consumo. Tuttavia, la mancanza di coerenza nei metodi sperimentali e nei materiali utilizzati è culminata in risultati contrastanti, anche tra studi sugli stessi tipi di nanostrutture e specie batteriche. Per i ricercatori che desiderano impiegare nanostrutture come additivo o rivestimento nella progettazione di un prodotto, questi dati contrastanti limitano il loro utilizzo in contesti clinici.

Per affrontare questo dilemma, in questo articolo, presentiamo quattro diversi metodi per determinare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate e discutiamo la loro applicabilità in diversi scenari. L'adattamento di metodi coerenti dovrebbe portare a dati riproducibili che possono essere confrontati tra gli studi e implementati per diversi tipi di nanostrutture e specie microbiche. Introduciamo due metodi per determinare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e due metodi per le attività antimicrobiche delle superfici nanostrutturate.

Per le nanoparticelle, il metodo della cocoltura diretta può essere utilizzato per determinare le concentrazioni minime inibitorie e battericide minime di nanoparticelle e il metodo di coltura a esposizione diretta può essere utilizzato per valutare in tempo reale l'attività batteriostatica rispetto all'attività battericida derivante dall'esposizione alle nanoparticelle. Per le superfici nanostrutturate, il metodo della coltura diretta viene utilizzato per determinare la vitalità dei batteri indirettamente e direttamente a contatto con superfici nanostrutturate e il metodo di esposizione a contatto focalizzato viene utilizzato per esaminare l'attività antimicrobica su un'area specifica di una superficie nanostrutturata. Discutiamo le principali variabili sperimentali da considerare per la progettazione di studi in vitro quando si determinano le proprietà antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate. Tutti questi metodi sono relativamente a basso costo, impiegano tecniche relativamente facili da padroneggiare e ripetibili per coerenza e sono applicabili a una vasta gamma di tipi di nanostrutture e specie microbiche.

Introduzione

Solo negli Stati Uniti, 1,7 milioni di individui sviluppano un'infezione acquisita in ospedale (HAI) ogni anno, con una su 17 di queste infezioni con conseguente morte¹. Inoltre, si stima che i costi di trattamento per le IAA vadano da $ 28 miliardi a $ 45 miliardi all'anno ^1,2. Queste ICA sono predominate da Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA)^3,4 e Pseudomonas aeruginosa^4, che sono comunemente isolati dalle infezioni croniche della ferita e di solito richiedono un trattamento esteso e tempo per produrre un esito favorevole al paziente.

Negli ultimi decenni, sono state sviluppate più classi di antibiotici per trattare le infezioni legate a questi e ad altri batteri patogeni. Ad esempio, analoghi della rifamicina sono stati usati per trattare MRSA, altre infezioni gram-positive e gram-negative e infezioni da Mycobacterium spp.⁵. Nel 1990, per trattare efficacemente un numero crescente di infezioni da M. tuberculosis, ulteriori farmaci sono stati combinati con analoghi della rifamicina per aumentare la loro efficacia. Tuttavia, circa il 5% dei casi di M. tuberculosis rimane resistente allarifampicina ^5,6 e vi è una crescente preoccupazione per quanto riguarda i batteri multi-farmaco resistenti⁷. Attualmente, l'uso di antibiotici da solo potrebbe non essere sufficiente nel trattamento delle IAA e ciò ha provocato una continua ricerca di terapie antimicrobiche alternative¹.

I metalli pesanti, come l'argento (Ag)8,9,10 e l'oro (Au)11, e la ceramica, come il biossido di titanio (TiO 2)12 e l'ossido di zinco (ZnO)¹³, in forma di nanoparticelle (NP) (AgNP, AuNP, TiO ₂ NPe ZnONP, rispettivamente) sono stati esaminati per le loro attività antimicrobiche e sono stati identificati come potenziali alternative antibiotiche. Inoltre, materiali bioriassorbibili, come leghe di magnesio (leghe di Mg)14,15,16, nanoparticelle di ossido di magnesio 17,18,19,20,21 e nanoparticelle di idrossido di magnesio [nMgO e nMg(OH)₂, rispettivamente]^22,23,24, sono stati esaminati anche. Tuttavia, i precedenti studi antimicrobici sulle nanoparticelle hanno utilizzato materiali e metodi di ricerca incoerenti, ottenendo dati difficili o impossibili da confrontare e talvolta contraddittori in natura^18,19. Ad esempio, la concentrazione minima inibitoria (MIC) e la concentrazione battericida minima (MBC) di nanoparticelle d'argento variavano significativamente in diversi studi. Ipe et al.25 hanno valutato le attività antibatteriche degli AgNP con una dimensione media delle particelle di ~ ²⁶ nm per determinare le MIC contro batteri gram-positivi e gram-negativi. Le MIC identificate per P. aeruginosa, E. coli, S. aureus e MRSA erano rispettivamente 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL e 10 μg/mL. Al contrario, Parvekar et ^al.26 hanno valutato AgNP con una dimensione media delle particelle di 5 nm. In questo caso, l'AgNP MIC e un MBC di 0,625 mg/ml sono risultati efficaci contro S. aureus. Inoltre, Loo et ^al.27 hanno valutato AgNP con una dimensione di 4,06 nm. Quando E. coli è stato esposto a queste nanoparticelle, il MIC e l'MBC sono stati riportati a 7,8 μg / ml. Infine, Ali et ^al.28 hanno studiato le proprietà antibatteriche degli AgNP sferici con una dimensione media di 18 nm. Quando P. aeruginosa, E. coli e MRSA sono stati esposti a queste nanoparticelle, il MIC è stato identificato a 27 μg / mL, 36 μg / mL, 27 μg / mL e 36 μg / mL, rispettivamente, e l'MBC è stato identificato a 36 μg / mL, 42 μg / mL e 30 μg / mL, rispettivamente.

Sebbene l'attività antibatterica delle nanoparticelle sia stata ampiamente studiata e riportata negli ultimi decenni, non esiste uno standard per i materiali e i metodi di ricerca utilizzati per consentire confronti diretti tra gli studi. Per questo motivo, presentiamo due metodi, il metodo di co-coltura diretta (metodo A) e il metodo di esposizione diretta (metodo B), per caratterizzare e confrontare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle mantenendo i materiali e i metodi coerenti.

Oltre alle nanoparticelle, sono state esaminate anche superfici nanostrutturate per attività antibatteriche. Questi includono materiali a base di carbonio, come nanofogli di grafene, nanotubi di carbonio e grafite²⁹, nonché leghe pure di Mg e Mg. Ognuno di questi materiali ha mostrato almeno un meccanismo antibatterico, tra cui danni fisici imposti alle membrane cellulari da materiali a base di carbonio e danni ai processi metabolici o al DNA attraverso il rilascio di specie reattive dell'ossigeno (ROS) quando il Mg si degrada. Inoltre, quando lo zinco (Zn) e il calcio (Ca) sono combinati nella formazione di leghe di Mg, viene migliorata la raffinatezza della granulometria della matrice di Mg, il che porta ad una riduzione dell'adesione batterica alle superfici del substrato rispetto ai campioni di solo Mg¹⁴. Per dimostrare l'attività antibatterica, presentiamo il metodo della coltura diretta (metodo C), che determina l'adesione batterica su e intorno a materiali nanostrutturati nel tempo attraverso la quantificazione di unità formanti colonie batteriche (CFU) con contatto superficiale diretto e indiretto.

La geometria delle nanostrutture sulle superfici, comprese le dimensioni, la forma e l'orientamento, potrebbe influenzare le attività battericide dei materiali. Ad esempio, Lin et ^al.16 hanno fabbricato diversi strati nanostrutturati di MgO sulle superfici dei substrati di Mg attraverso l'anodizzazione e la deposizione elettroforetica (EPD). Dopo un periodo di esposizione alla superficie nanostrutturata in vitro, la crescita di S. aureus è risultata sostanzialmente ridotta rispetto al Mg non trattato. Ciò ha indicato una maggiore potenza della superficie nanostrutturata contro l'adesione batterica rispetto alla superficie metallica Mg non trattata. Per rivelare i diversi meccanismi delle proprietà antibatteriche di varie superfici nanostrutturate, in questo articolo viene discusso un metodo di esposizione a contatto focalizzato (metodo D) che determina le interazioni cellula-superficie all'interno dell'area di interesse.

L'obiettivo di questo articolo è presentare quattro metodi in vitro applicabili a diverse nanoparticelle, superfici nanostrutturate e specie microbiche. Discutiamo le considerazioni chiave per ciascun metodo per produrre dati coerenti e riproducibili per la comparabilità. In particolare, il metodo di cocoltura diretta¹⁷ e il metodo dell'esposizione diretta sono utilizzati per esaminare le proprietà antimicrobiche delle nanoparticelle. Attraverso il metodo della co-coltura diretta, le concentrazioni minime inibitorie e battericide minime (MIC e MBC_90-99,99, rispettivamente) possono essere determinate per le singole specie e la concentrazione più potente (MPC) può essere determinata per più specie. Attraverso il metodo dell'esposizione diretta, gli effetti batteriostatici o battericidi delle nanoparticelle a concentrazioni minime inibitorie possono essere caratterizzati da letture della densità ottica in tempo reale nel tempo. Il metodo della coltura diretta¹⁴ è adatto per esaminare i batteri direttamente e indirettamente a contatto con superfici nanostrutturate. Infine, viene presentato il metodo dell'esposizione a contatto focalizzato¹⁶ per esaminare l'attività antibatterica di un'area specifica su una superficie nanostrutturata attraverso l'applicazione diretta di batteri e la caratterizzazione della crescita batterica all'interfaccia cellula-nanostruttura. Questo metodo è modificato dallo standard industriale giapponese JIS Z 2801:2000¹⁶ e ha lo scopo di concentrarsi sulle interazioni microbo-superficie ed escludere gli effetti della degradazione del campione di massa in coltura microbica sulle attività antimicrobiche.

Protocollo

Per presentare i metodi di co-coltura diretta e di esposizione diretta, utilizziamo nanoparticelle di ossido di magnesio (nMgO) come materiale modello per dimostrare le interazioni batteriche. Per presentare la coltura diretta e i metodi di esposizione a contatto focalizzato, utilizziamo una lega Mg con superfici nanostrutturate come esempi.

1. Sterilizzazione dei nanomateriali

NOTA: Tutti i nanomateriali devono essere sterilizzati o disinfettati prima della coltura microbica. I metodi che possono essere utilizzati includono calore, pressione, radiazioni e disinfettanti, ma la tolleranza dei materiali per ciascun metodo deve essere identificata prima degli esperimenti in vitro .

1. Nanoparticelle
   NOTA: I campioni possono essere conservati in un solvente organico come l'etanolo o confezionati in un piatto o in una scatola seguita da sterilizzazione o disinfezione in modo appropriato. Le nanoparticelle sono state sterilizzate utilizzando il seguente metodo per la dimostrazione del metodo di co-coltura diretta¹⁷ e del metodo di esposizione diretta.
   1. Sterilizzare le nanoparticelle di MgO in un forno a convezione a 200 °C^{30 per 60} minuti prima di ogni esperimento in vitro .
      NOTA: Questo metodo è stato scelto perché il vapore acqueo e la luce UV possono influenzare le strutture delle nanoparticelle di MgO (nMgO)¹⁷.
2. Materiali sfusi
   NOTA: I materiali nanostrutturati sono stati sterilizzati con il seguente metodo per la dimostrazione del metodo di coltura diretta.
   1. Per il metodo di coltura diretta¹⁴, disinfettare i campioni ZC21, Mg e T64 preparati utilizzando radiazioni ultraviolette (UV) per 4 ore prima di iniziare gli studi in vitro .
   2. Per il metodo di esposizione a contatto focalizzato¹⁶, disinfettare tutti i campioni utilizzando radiazioni UV per 2 ore prima di iniziare gli studi in vitro .
3. In alternativa, utilizzare l'ossido di etilene (EtO) per la sterilizzazione di materiali sensibili al calore.

2. Metodo della cocoltura diretta (metodo A)

NOTA: Nel metodo A, i batteri in una coltura di semina in fase lag vengono miscelati direttamente con nanoparticelle di determinate concentrazioni. Per l'esame delle attività antimicrobiche delle nanoparticelle, seguiamo un protocollo descritto da Nguyen et ^al.17.

1. Caratterizzazione di nanoparticelle e nanostrutture
   NOTA: La composizione e la forma della nanostruttura sono confermate utilizzando la diffrazione della polvere a raggi X.
   1. Misurazione delle nanoparticelle
      1. Pesare le nanoparticelle a 9 volte la massa desiderata per mL per contenere 3 mL di campioni in triplice copia. Ad esempio, pesare 0,2 mg/mL nMgO a 1,8 mg/ml.
         NOTA: Ciò garantisce la distribuzione coerente delle nanoparticelle nelle colture batteriche e nei brodi.
      2. Misurare tutte le nanoparticelle in una provetta da microcentrifuga da 5,0 mL che è stata pre-pesata e tarata utilizzando una bilancia analitica.
2. Preparazione e crescita di colture batteriche
   1. Per ogni esperimento in vitro , recuperare le scorte di cellule batteriche dallo stoccaggio a -80 °C. Aggiungere 10 μL di ogni stock di cellule batteriche in 5 ml di un terreno di crescita appropriato.
   2. Introdurre il mezzo inoculato in un incubatore-agitatore a 37 °C e 250 giri/min per circa 16 ore durante la notte.
      1. Se vengono coltivate specie di Staphylococcus , sottocoltura ponendo 400 μL di ogni coltura notturna in 20 ml di terreno di crescita fresco (100 μL/5 mL di terreno) e incubare agitando a 37 °C e 250 giri/min per ulteriori 4-6 ore.
3. Lavaggio e conteggio delle cellule batteriche per determinare la densità di semina
   NOTA: La densità di semina desiderata di 7,8 × 10⁶ CFU/mL è stata identificata come il numero di cellule superiore a quello necessario per confermare un'infezione del tratto urinario.
   1. Raccogliere i batteri coltivati aliquotando 1 mL della coltura batterica durante la notte in provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Creare un numero sufficiente di aliquote da colture batteriche notturne e centrifugarle per 10 minuti a 1.956 × g per raggiungere le densità di semina desiderate.
   2. Dopo la centrifugazione, pipettare per rimuovere il surnatante dalle cellule pellettate e posizionare il surnatante in un recipiente di raccolta. Risospendere i pellet cellulari in 0,5 ml di terreno di coltura fresco. Combinare due sospensioni da 0,5 mL per creare 1 mL di sospensione per ridurre a sei il numero di aliquote da 1 mL di cellule risospese. Ripetere la centrifugazione per 10 minuti a 1.956 × g.
   3. Completare un secondo ciclo di lavaggio utilizzando terreno di coltura fresco, come nella fase 2.3.2, per ridurre a tre il numero di 1 mL di aliquote di cellule lavate risospese.
   4. Completare il terzo ciclo, come al punto 2.3.2, tranne risospendere i pellet cellulari in 0,33 mL di tampone Tris (idrossimetil) tampone amminometano (tampone Tris, pH 8,5). Combinare le tre sospensioni, ciascuna di 0,33 mL di volume, in una microcentrifuga da 1,5 ml. Ripetere la centrifugazione per 10 minuti a 1.956 × g.
      NOTA: Tris buffer non contiene ioni Mg 2+ o Ca^{2+ 31}. Questo è importante per l'uso della spettrometria di emissione plasma-ottica accoppiata induttivamente (ICP-OES) per misurare gli ioni Mg 2+ e Ca²⁺ nei brodi post-coltura. Al contrario, i fosfati presenti nella soluzione salina tamponata fosfato (PBS)32, ad esempio, sequestrano entrambi gli ioni Mg 2+ o Ca^{2+ 33,34,35} e causano confusione nell'interpretazione dei dati ICP-OES.
   5. Rimuovere il surnatante dalle celle pellettate. Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di tampone Tris fresco, noto come sospensione cellulare, una coltura di semina batterica in fase lag.
   6. Determinare la concentrazione della sospensione cellulare (cellule/ml) utilizzando un emocitometro.
4. Creazione della coltura batterica di semina
   NOTA: Il campione ha un volume totale di 3 mL ed è completato in triplice copia (9 mL totali).
   1. Determinare il volume totale di coltura di semina dei batteri necessaria. Per creare la coltura di semina, utilizzare C 1V₁ = C 2 V₂per calcolare il volume della sospensione cellulare necessaria per creare una coltura di semina di 7,8 × 10⁶ cellule / ml. Aggiungere il volume calcolato della sospensione cellulare (V₁) al volume richiesto di terreno di coltura (V₂).
   2. Determinare l'effettiva densità di semina dei batteri in CFU / ml. Creare una diluizione seriale di dieci volte a ^10-4. Stendere la diluizione ^10-4 sull'agar di crescita appropriato e incubare per una notte. Dopo l'incubazione, contare il numero di colonie e calcolare il CFU/ml.
5. Formazione di batteri e colture di nanoparticelle
   1. In lastre di polistirene trattate con 12 pozzetti, non trattate con tessuto, aliquote 2 ml della coltura di semina batterica in ciascun pozzetto per il numero di pozzetti necessari.
   2. Per ogni provetta da microcentrifuga da 5 mL contenente nMgO prepesato, aggiungere 3 mL di coltura di semina batterica. Vortice brevemente per mescolare l'nMgO con i batteri. Aliquot 1 mL della miscela in tre pozzetti separati per creare i campioni triplicati di ciascun peso premisurato di nMgO. Pipet la miscela batteri/nMgO 2-3 volte prima di ogni aliquota da 1 mL per mantenere nMgO in sospensione.
      NOTA: I campioni di controllo saranno costituiti da 3 ml di sole cellule, 3 ml di soli terreni e 3 ml contenenti le concentrazioni più basse e più alte di nanoparticelle utilizzate. Questi sono preparati come al punto 2.5.2. Tutti i campioni di controllo sono completati in triplice copia.
   3. Incubare tutte le piastre a 12 pozzetti a 37 °C e 120 giri/min per 24 ore.
6. Determinazione della crescita delle cellule batteriche dopo esposizione a nMgO
   1. Dopo l'incubazione notturna delle colture batteriche, raccogliere ogni campione di 3 ml mediante pipettaggio in un singolo tubo conico da 15 ml.
   2. Utilizzare una piastra a 96 pozzetti per creare diluizioni seriali 1:10. Determinare il numero di colonne necessarie per diluire in serie tutti i campioni contenenti batteri. Aggiungere 180 μL di buffer Tris a ciascun pozzetto nella riga B alla riga G per il numero appropriato di colonne.
   3. Vortice brevemente ogni tubo conico da 15 mL contenente campioni batterici e aggiungere 50 μL a un singolo pozzetto nella fila A.
   4. Per ogni pozzetto nella riga A, trasferire 20 μL nella riga B (ad esempio, da A1 a B1) e mescolare brevemente mediante pipettaggio per ottenere un volume di 200 μL. Utilizzando una punta di pipetta sterile, trasferire 20 μL dal pozzetto nella fila B al pozzetto nella fila C. Continuare questo schema fino a quando il pozzetto nella fila G contiene 200 μL, completando una diluizione seriale da 10−¹ nella riga B a 10⁻⁶ nella riga G.
   5. Pipet 100 μL di ciascun pozzetto su una piastra di agar di crescita appropriata e distribuito attraverso la piastra per disperdere la coltura cellulare. Posizionare le piastre in un incubatore-agitatore per una notte a 37 °C. Incubare le piastre a 37 °C per 24 h.
   6. Esamina le piastre e conta quelle che hanno circa 25-300 colonie. Se possibile, scegliere piastre con lo stesso valore di diluizione. Utilizzare il numero di colonie per piastra per calcolare la CFU/mL.
7. Valutazione del pH post-incubazione
   NOTA: seguire le istruzioni del produttore per ciascun modello di pHmetro.
   1. Pre-calibrare un pHmetro utilizzando soluzioni standardizzanti di pH 4, pH 7 e pH 10. Leggere ogni campione batterico posizionando la sonda di pH nel tubo conico da 15 ml.
8. Preparazione dei campioni per ICP-OES
   NOTA: ICP-OES viene utilizzato per determinare la concentrazione di ioni Mg 2+ e Ca²⁺. Questi cationi sono considerati importanti, poiché ciascuno partecipa al metabolismo cellulare.
   1. Centrifugare ogni tubo conico da 15 mL preparato al punto 2.6.1 per 5 minuti a 5.724 × g per pellettare i detriti cellulari e le nanoparticelle.
   2. Utilizzando un tubo conico da 15 ml, diluire 30 μL del surnatante in 2,97 mL di acqua filtrata da 18,2 Ω per creare una diluizione 1:100.
      NOTA: Il fattore di diluizione può essere regolato in base alle concentrazioni ioniche previste e al limite di rivelazione dello spettrometro.
   3. Leggere gli esempi utilizzando ICP-OES.

3. Metodo dell'esposizione diretta (metodo B)

NOTA: Se il tasso di crescita dei batteri scelti è sconosciuto, è necessario completare una standardizzazione della curva di crescita prima di implementare questo metodo.

1. Determinare le attività batteriostatiche e battericide in tempo reale dopo l'esposizione alle nanoparticelle di interesse.
   1. Preparare le concentrazioni desiderate di nanoparticelle utilizzando i metodi descritti nei punti 2.1-2.1.2.2. Preparare due serie di ogni peso di nanoparticelle da utilizzare: una da aggiungere a 3 ml di aliquote di coltura batterica nella fase di crescita logaritmica e l'altra da aggiungere a 3 ml di aliquote di terreno di crescita senza batteri come gruppi di controllo.
   2. Determinare gli antibiotici batteriostatici e battericidi appropriati per le specie batteriche da testare.
      NOTA: È richiesta la conoscenza della concentrazione minima inibitoria per ciascun antibiotico.
2. Calcolare il volume totale di coltura batterica necessaria per triplicare i campioni da 3 ml per tutti i campioni di nanoparticelle, antibiotici e di controllo.
   NOTA: è richiesto un volume uguale di terreno di crescita sterile. Se è previsto l'uso della spettrofotometria, ciò richiede adeguamenti al volume totale necessario per la sistemazione del volume da 0,5 mL a 1,0 mL necessario per le cuvette.
3. Giorno 1: Per ogni esperimento in vitro, creare scorte overnight seguendo i passaggi 2.2.1-2.2.2.
4. Giorno 2: Verificare che le impostazioni del lettore di piastre possano ospitare una piastra a 96 pozzetti con una densità ottica di 600 nm. Misurare i campioni in aliquote da 200 μL utilizzando una piastra a 96 pozzetti.
   1. Determinare una coltura batterica iniziale OD₆₀₀ a 0,01, la densità utilizzata per iniziare il periodo di incubazione iniziale prima dell'aggiunta di nanoparticelle e antibiotici.
   2. Raccogliere la coltura batterica durante la notte dall'incubatore-shaker.
      1. Per ogni materiale (ad esempio, nanoparticelle pre-misurate o antibiotici) da testare, creare una coltura batterica separata a un OD₆₀₀ di 0,01. Utilizzare un contenitore abbastanza grande da contenere il volume di coltura cellulare necessario (ad esempio, un pallone Erlenmeyer sterilizzato o tubi conici da 50 ml).
      2. Diluire i campioni batterici durante la notte con terreno di coltura posizionando tre aliquote da 200 μL del terreno di crescita in tre pozzetti e tre aliquote da 200 μL della coltura batterica in ulteriori pozzetti (ad esempio, da A1 a A6).
      3. Posizionare la piastra a 96 pozzetti nel lettore di piastre e scansionarla.
         NOTA: le letture vengono mediate per ogni pozzetto scansionato per produrre un valore medio.
      4. Per calcolare la densità dei batteri in sospensione, calcolare la media del valore medio per ciascun pozzetto contenente un campione triplicato.
      5. Per determinare la densità ottica dei batteri, sottrarre la media del campione di brodo dalla media batterica.
      6. Se è necessario continuare a regolare la sospensione batterica, continuare ad aggiungere brodo o coltura batterica durante la notte, se necessario, e ripetere la scansione nel lettore di piastre se necessario fino a raggiungere un OD₆₀₀ di circa 0,01.
      7. Incubare a 37 °C agitando a 150 giri/min fino a raggiungere la crescita logaritmica.
5. Rimuovere le colture batteriche dallo shaker dell'incubatore.
   1. Aliquote 3 mL della coltura batterica OD₆₀₀ 0,01 in provette coniche marcate da 15 mL per campioni di prova e di controllo in triplice copia.
   2. Aliquot 200 μL della coltura batterica in tre pozzetti di una piastra da 96 pozzetti e misurare i campioni utilizzando il lettore di piastre.
   3. Calcolare le letture come descritto in precedenza al punto 3.4.2.2 e al punto 3.4.2.6 - la "lettura -0,5 h".
6. Creazione e misurazione di miscele batteriche/nanoparticelle
   1. Aliquot 3 mL di terreno di crescita sterile in numero uguale alle colture batteriche in provette coniche marcate da 15 mL per campioni di controllo (in triplice copia).
   2. Per preparare sospensioni di batteri/nanoparticelle e sospensioni di mezzi sterili/nanoparticelle, rimuovere 1 mL di coltura batterica o terreno da ogni triplice set di tubi conici da 15 ml.
      1. Introdurre le aliquote da 1 mL in una provetta da centrifuga da 5 mL contenente nanoparticelle pre-misurate e mescolare brevemente il vortice.
      2. Dalla provetta da centrifuga da 5 mL, restituire 1 mL di aliquote delle sospensioni batteriche/nanoparticelle o medie/nanoparticelle al tubo conico da 15 mL per distribuire le nanoparticelle in modo omogeneo.
         NOTA: Pipet la miscela batteri/nanoparticelle 2x-3x prima che ogni aliquota da 1 mL venga pipettata per mantenere le nanoparticelle in sospensione.
7. Creazione e misurazione di miscele batteriche/antibiotiche
   1. Per creare le colture batteriche/antibiotiche, aliquote 3 mL della coltura batterica incubata nei tubi conici da 15 mL marcati corrispondentemente.
   2. Dopo aver preparato tutti i campioni, versare 200 μL di ciascun campione nei singoli pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.
   3. Inserire le piastre nel lettore di piastre e avviare la scansione della lettura "0 h".
   4. Introdurre i tubi conici da 15 mL contenenti i campioni in un incubatore-agitatore a 37 °C e 150 giri/min. Registrare tutti i dati come descritto in precedenza nei punti 3.4.2.2 e 3.4.2.6.
8. Circa 15 minuti dopo aver completato la lettura di 0 ore, ripetere i passaggi descritti nei passaggi 3.7.2-3.7.3-la lettura "0,5 h".
   1. Dopo le 0 ore stabilite, ripetere i passaggi descritti al punto 3.7.2-passo 3.7.3 ogni 90 minuti per sei cicli; completo in 9 h.
   2. Al termine del sesto ciclo, porre i campioni nell'incubatore-agitatore per ulteriori 15 ore a 37 °C e 150 giri/min. Ripetere i passaggi descritti nei passaggi 3.7.2-3.7.3 per ottenere la lettura delle 24 ore. Registrare tutti i dati come descritto in precedenza nei punti 3.4.2.2 e 3.4.2.6.

4. Metodo della coltura diretta (metodo C)

NOTA: Nel metodo C, i batteri in una coltura di semina in fase di ritardo sono posizionati direttamente sulle superfici nanostrutturate di interesse. Per l'esame delle attività antimicrobiche della nanostruttura, seguiamo un protocollo descritto da Zhang et ^al.14. Per dimostrare questo metodo di coltura diretta, sono stati utilizzati come campioni ZC21 (lega Mg-Zn-Ca) e perni Mg.

1. Preparazione e crescita delle colture batteriche
   1. Per ogni esperimento in vitro, creare scorte overnight seguendo le fasi da 2.2.1 a 2.2.2.
2. Lavaggio e conteggio dei batteri per determinare la densità di semina
   NOTA: La densità di semina desiderata di 7,5 × 10⁵ CFU/mL è stata identificata come la concentrazione cellulare riportata che causa infezioni ortopediche¹⁴.
   1. Recuperare la coltura batterica durante la notte dall'incubatore-shaker.
   2. Lavare e raccogliere i batteri, seguendo i passaggi 2.3.2-2.3.2.3, ma sostituire il mezzo fresco con un fluido corporeo simulato rivisto (rSBF) per ogni fase di lavaggio.
      NOTA: rSBF è una soluzione tampone che imita la concentrazione ionica del plasma sanguigno umano. Tuttavia, rSBF contiene solo composti inorganici ed è privo di composti bioorganici come le proteine. Per risolvere questo problema, il siero bovino fetale (FBS) viene combinato con rSBF per simulare la composizione del sangue umano per imitare meglio la formazione naturale di apatite nei tessuti calcificati in condizioni sperimentali³⁶.
   3. Rimuovere il surnatante dalle celle pellettate. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di rSBF integrato con il 10% di FBS, la sospensione cellulare.
   4. Determinare la concentrazione della sospensione cellulare (cellule/ml) utilizzando un emocitometro. Diluire la sospensione cellulare ad una concentrazione di 7,5 × 10⁵ cellule/ml in rSBF integrato con FBS al 10%. Creare una cultura di semina seguendo il passaggio 2.4.1.
   5. Determinare la densità effettiva di semina seguendo il punto 2.4.2.
3. Distribuire la sospensione cellulare batterica sui campioni nei pozzetti di coltura.
   1. Posizionare sia i campioni che i campioni di controllo nei singoli pozzetti di una lastra di polistirene trattata con 48 pozzetti non tessuto.
   2. Aliquot 0,75 mL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto contenente i campioni e i controlli. Collocare la/e piastre-piastre-pozzetto in un incubatore-agitatore per 24 ore a 37 °C agitando a 120 giri/min.
4. Caratterizzazione della concentrazione batterica
   1. Dopo 24 ore di incubazione, raccogliere i campioni e metterli in provette di raccolta separate ed etichettate.
   2. Raccogliere due campioni da ciascun gruppo e metterli singolarmente in provette da microcentrifuga da 5,0 ml etichettate. Aggiungere 2 mL di rSBF a ciascun tubo.
   3. Posizionare i campioni raccolti al punto 4.4.2 in un bagno di sonicazione e sonicare per 10 minuti. Dopo ogni periodo di 5 minuti, vortice ogni campione per 5 s.
   4. Raccogliere l'rSBF contenente le cellule batteriche appena staccate e posizionare la sospensione in una provetta di microcentrifuga fresca etichettata.
5. Diluizioni seriali e placcatura dei batteri
   1. Diluire e placcare in serie la sospensione batterica seguendo i punti 2.6.2-2.6.6.
6. Valutare il pH post-incubazione dei terreni di coltura seguendo il passaggio 2.7.
7. Preparare il terreno di coltura per ICP-OES seguendo i metodi descritti al punto 2.8.

5. Metodo di esposizione a contatto focalizzato (metodo D)

NOTA: Nel metodo D, i batteri su una carta da filtro nitrocellulosa vengono messi a diretto contatto con un'area di interesse sulle superfici nanostrutturate. Questo metodo riduce al minimo l'interferenza della degradazione del campione di massa nelle colture batteriche con le attività batteriche. Per esaminare le attività antimicrobiche delle nanosuperfici, seguiamo un protocollo descritto da Lin et ^al.16.

1. Seguire le procedure descritte nei passaggi 2.2.1-2.2.2.1 per creare una coltura di semina batterica. Confermare l'effettiva densità di semina dopo il punto 2.4.2.
2. Preparare i campioni in una dimensione di 1 × 1 cm² in una forma quadrata. Preparare tutti i tipi di campione in triplice copia. Se necessario, posizionare i campioni su un supporto tridimensionale (3D) di 15 mm di diametro per 10 mm di altezza. Collocare il campione e il supporto in un pozzetto di una piastra di polistirene trattata con colture non tissutali.
3. Preparare carte nitrocellulosiche sterilizzate tagliando ciascuna ad un diametro di 1 cm. Porre le carte nitrocellulosiche preparate su una piastra di agar contenente il mezzo appropriato.
4. Pipet 50 μL della coltura batterica diluita sulla carta da filtro.
5. Pipet 50 μL di un mezzo appropriato al centro di ciascuna superficie del campione.
6. Usando una pinzetta sterilizzata, raccogliere la carta nitrocellulosa dalla superficie dell'agar. Capovolgere con cautela la carta nitrocellulosa e posizionarla sulla superficie del campione in modo che i batteri siano in contatto con i 50 μL di terreno e la superficie nanostrutturata di interesse.
7. Aggiungere 1 mL di tampone Tris a ciascun pozzetto contenente un campione per mantenere l'umidità. Incubare la piastra del pozzetto di polistirolo contenente tutti i campioni a 37 °C per 24 h.
8. Raccogliere la carta nitrocellulosa da ciascuna superficie del campione. Introdurre ciascuno in 5 ml di tampone Tris. Vortice le carte da filtro raccolte e campioni di materiale nanosuperficiale per 5 s.
9. Sonicare ogni campione per 10 minuti. Vortice per 5 s dopo 5 minuti e di nuovo dopo 10 minuti.
10. Raccogliere le sospensioni tampone Tris da tutti i campioni e posizionare ogni volume in singole provette di raccolta fresca.
11. Diluire e placcare in serie i campioni seguendo i punti 2.6.2-2.6.6.

6. Caratterizzazione post-coltura di batteri e nanomateriali

1. Esame dell'adesione e morfologia batterica mediante microscopia elettronica a scansione (SEM)
   1. Dopo l'incubazione durante la notte, aggiungere il 10% di glutaraldeide in ciascun pozzetto della piastra di polistirene trattata con 48 pozzetti non trattati con tessuto fino a quando i campioni non sono completamente coperti. Incubare i campioni per 1 ora per fissare le cellule batteriche.
   2. Aspirare la glutaraldeide in una bottiglia di scarto e sciacquare tutti i campioni 3 volte con la soluzione tampone Tris per rimuovere i batteri non aderenti.
   3. Disidratare i campioni utilizzando etanolo al 30%, 75% e 100% per 30 minuti ogni¹⁶.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare un essiccatore a punti critici per asciugare i campioni. Non è ideale asciugare all'aria i campioni a temperatura ambiente per 24 ore.
   4. Utilizzare nastri adesivi conduttivi, come nastri di rame o carbonio, per fissare i campioni su un tronco SEM. Rivestire le superfici del campione tramite rivestimento sputter per fornire conduttività prima dell'imaging (ad esempio, rivestire piastre Mg con batteri aderenti sotto platino/palladio (Pt/Pd) per 45 s a 20 mA¹⁶).
      NOTA: i materiali di rivestimento, il tempo di lavorazione e la corrente operativa possono variare a seconda del tipo di campione.
   5. Scattare immagini dei batteri sui campioni utilizzando SEM con una distanza di lavoro appropriata e una tensione di accelerazione e agli ingrandimenti desiderati. Ad esempio, utilizzare un SEM con un rilevatore di elettroni secondario per acquisire immagini a una distanza di lavoro di 5 mm e una tensione di accelerazione di 10 kV¹⁶.
2. Esaminare la morfologia superficiale di campioni di nanomateriali post-coltura utilizzando SEM.
   1. Per i nanomateriali, lavare i campioni utilizzando il tampone Tris 3x per rimuovere i batteri liberi che non sono attaccati al campione. Per le nanoparticelle, disperdere le particelle in un solvente che non influisce sulle proprietà del campione attraverso l'ultrasonicazione per ottenere una migliore dispersione quando necessario.
   2. Asciugare i campioni dopo la procedura di lavaggio.
   3. Utilizzare nastri biadesivi in carbonio o rame per far aderire i campioni sul tronco SEM.
   4. Creare uno strato superficiale conduttivo di Pt/Pd utilizzando un rivestimento sputter, come descritto al punto 6.1.4, prima dell'imaging. Prendere le immagini di esempio come descritto al punto 6.1.5.
   5. Analizzare la composizione elementare superficiale utilizzando EDS con una tensione di accelerazione appropriata e agli ingrandimenti desiderati (ad esempio, a 10 kV dopo aver eseguito l'analisi SEM¹⁶).
3. Imaging a fluorescenza dell'adesione batterica
   1. Preparare i campioni da visualizzare utilizzando la microscopia a fluorescenza lavandoli prima con tampone Tris 3x. Asciugare all'aria i campioni a temperatura ambiente.
   2. Colorare ogni campione con colorante di fluorescenza tioflavina T da 10 μM seguendo il protocollo stabilito³⁷.
   3. Eseguire l'imaging a fluorescenza dell'adesione batterica utilizzando un microscopio invertito accoppiato con una fotocamera digitale del dispositivo ad accoppiamento di carica che moltiplica gli elettroni.

Risultati

L'identificazione dell'attività antibatterica delle nanoparticelle di ossido di magnesio e delle superfici nanostrutturate è stata presentata utilizzando quattro metodi in vitro applicabili a diversi tipi di materiali e specie microbiche.

Il metodo A e il metodo B esaminano le attività batteriche quando esposte a nanoparticelle in una fase di ritardo (metodo A) e in una fase logaritmica (metodo B) per una durata pari o superiore a 24 ore. Il metodo A fornisce risultati per quanto r...

Discussione

Abbiamo presentato quattro metodi in vitro (A-D) per caratterizzare le attività antibatteriche di nanoparticelle e superfici nanostrutturate. Mentre ciascuno di questi metodi quantifica la crescita batterica e la vitalità nel tempo in risposta ai nanomateriali, esistono alcune variazioni nei metodi utilizzati per misurare la densità iniziale di semina batterica, la crescita e la vitalità nel tempo. Tre di questi metodi, il metodo della cocoltura diretta (A)¹⁷, il metodo della coltura ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Milipore Sigma	Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven	MTI Corporation	BPG-7082	https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer	Sigma-Aldrich	42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE	Fisher Scientific	50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera	Hamamatsu	C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Hemocytometer	Brightline, Hausser Scientific	1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES)	PerkinElmer	8000
Inverse microscope	Nikon	Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth	Sigma Life Science	L3022
Luria Bertani Broth + agar	Sigma Life Science	L2897
MacroTube 5.0	Benchmark Scientific	C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles	US Research Nanomaterials, Inc	Stock #: US3310   M	MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance	Mettler Toledo	MS105D
Nitrocellulose paper	Fisherbrand	09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351172
Petri dish 100 mm	VWR	470210-568
Petri dish, 15 mm	Fisherbrand	FB0875713A
pH meter	VWR	SP70P
Scanning electron microscopy (SEM)	TESCAN	Vega3 SBH
Sonicator	VWR	97043-936
Table top centrifuge	Fisher Scientific	accuSpin Micro 17
Table top centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar	MP	1010617
Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
UV-Vis spectrophotometer	Tecan	Infinite 200 PRO	https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L	VWR	N/A
X-ray power defraction	Panalytical	N/A	PANalytical Empyrean Series 2