in vitroでのナノ粒子およびナノ構造表面の抗菌活性の評価

要約

ナノ粒子やナノ構造表面の抗菌活性を in vitro 技術を用いて評価する4つの方法を紹介します。これらの方法は、さまざまなナノ粒子およびナノ構造表面と広範囲の微生物種との相互作用を研究するために適応させることができる。

要約

銀、酸化亜鉛、二酸化チタン、酸化マグネシウムなどのナノ粒子およびナノ構造表面の抗菌活性は、臨床および環境環境および消耗品で以前に調査されてきました。しかし、使用される実験方法と材料の一貫性の欠如は、同じナノ構造タイプと細菌種の研究の間でさえ、矛盾する結果に至りました。ナノ構造を製品設計の添加剤またはコーティングとして採用したい研究者にとって、これらの相反するデータは臨床現場での利用を制限します。

このジレンマに立ち向かうために、この記事では、ナノ粒子とナノ構造表面の抗菌活性を決定するための4つの異なる方法を提示し、さまざまなシナリオでのそれらの適用性について説明します。一貫した方法を適応させることで、研究間で比較し、さまざまなナノ構造タイプや微生物種に対して実装できる再現性のあるデータにつながることが期待されます。ナノ粒子の抗菌活性を決定する2つの方法と、ナノ構造表面の抗菌活性を決定する2つの方法を紹介します。

ナノ粒子の場合、直接共培養法を使用してナノ粒子の最小阻害濃度および最小殺菌濃度を決定し、直接暴露培養法を使用して、ナノ粒子曝露に起因するリアルタイムの静菌活性と殺菌活性を評価することができます。ナノ構造表面の場合、直接培養法を使用してナノ構造表面に間接的および直接接触する細菌の生存率を決定し、集束接触暴露法を使用してナノ構造表面の特定の領域での抗菌活性を調べます。ナノ粒子とナノ構造表面の抗菌特性を決定する際に in vitro 研究デザインのために考慮すべき重要な実験変数について説明します。これらの方法はすべて比較的低コストであり、習得が比較的簡単で一貫性のために再現可能な技術を採用しており、幅広いナノ構造タイプと微生物種に適用できます。

概要

米国だけでも、毎年170万人が院内感染(HAI)を発症し、これらの感染症の17人に1人が死亡しています¹。さらに、HAIの治療費は年間280億ドルから450億ドルの範囲であると推定されています^1,2。これらのHAIは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)^3,4および緑膿菌⁴が優勢であり、これらは一般的に慢性創傷感染症から分離され、通常、良好な患者転帰を生み出すために広範な治療と時間を必要とします。

過去数十年にわたって、これらおよび他の病原性細菌に関連する感染症を治療するために、複数の抗生物質クラスが開発されてきました。例えば、リファマイシン類似体は、MRSA、他のグラム陽性およびグラム陰性感染症、ならびにマイコバクテリウム属感染症の治療に使用されています⁵。1990年代には、増加する結核菌感染症を効果的に治療するために、追加の薬物をリファマイシン類似体と組み合わせてその有効性を高めました。しかし、結核菌症例の約5%がリファンピシン^5,6に耐性を残しており、多剤^耐性菌7に対する懸念が高まっています。 現在、抗生物質だけではHAIの治療には十分ではない可能性があり、これにより代替抗菌療法の継続的な探索が引き起こされています¹。

銀(Ag)^8,9,10および金(Au)11などの重金属、およびナノ粒子(NP)形態の二酸化チタン(TiO 2)12および酸化亜鉛(ZnO)¹³のようなセラミックス(それぞれAgNP、AuNP、TiO₂ NP、およびZnONP)は、それらの抗菌活性について調べられ、潜在的な抗生物質の代替品として同定されている。さらに、マグネシウム合金(Mg合金)14,15,16、酸化マグネシウムナノ粒子17,18,19,20,21、水酸化マグネシウムナノ粒子[それぞれnMgOおよびnMg(OH)₂]^などの生体吸収性材料^22,23,24、も検討されている。しかし、ナノ粒子の以前の抗菌研究では、一貫性のない材料と研究方法を使用していたため、比較が困難または不可能であり、本質的に矛盾するデータが得られました^18,19。例えば、銀ナノ粒子の最小発育阻止濃度(MIC)および最小殺菌濃度(MBC)は、異なる研究において有意に異なっていた。Ipeら²⁵は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に対するMICを決定するために、平均粒径~26nmのAgNPの抗菌活性を評価した。緑膿菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、MRSAの同定されたMICは、それぞれ2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、および10 μg/mLでした。対照的に、Parvekarら²⁶は、平均粒径5nmのAgNPを評価した。この場合、AgNP MICと0.625 mg / mLのMBCが黄色ブドウ球菌に対して有効であることがわかりました。さらに、Looら²⁷は、4.06nmのサイズのAgNPを評価した。大腸菌をこれらのナノ粒子に曝露すると、MICおよびMBCは7.8μg/mLと報告されました。最後に、Aliら²⁸は、平均サイズが18nmの球状AgNPの抗菌特性を調べました。緑膿菌、大腸菌、MRSAをこれらのナノ粒子に曝露すると、MICはそれぞれ27 μg/mL、36 μg/mL、27 μg/mL、36 μg/mL、MBCはそれぞれ36 μg/mL、42 μg/mL、30 μg/mLと同定されました。

ナノ粒子の抗菌活性はここ数十年で広く研究され報告されてきましたが、研究間の直接比較を可能にするために使用される材料と研究方法の基準はありません。このため、直接共培養法(A法)と直接暴露法(B法)の2つの方法を提示し、材料と方法の一貫性を保ちながらナノ粒子の抗菌活性を特徴付け、比較します。

ナノ粒子に加えて、ナノ構造表面も抗菌活性について調べられています。これらには、単層カーボンナノシート、カーボンナノチューブ、グラファイト²⁹などの炭素ベースの材料、ならびに純粋なMgおよびMg合金が含まれる。これらの各材料は、炭素系材料によって細胞膜に課せられる物理的損傷や、Mgが分解する際の活性酸素種(ROS)の放出による代謝過程またはDNAの損傷など、少なくとも1つの抗菌メカニズムを示しています。さらに、亜鉛(Zn)とカルシウム(Ca)を組み合わせてMg合金を形成すると、Mgマトリックスの粒径の微細化が促進され、Mgのみのサンプル¹⁴と比較して、基板表面への細菌接着が減少します。抗菌活性を実証するために、直接的および間接的な表面接触を伴う細菌コロニー形成単位(CFU)の定量を通じて、ナノ構造材料上およびナノ構造材料周辺の細菌接着を経時的に決定する直接培養法(方法C)を紹介します。

サイズ、形状、配向など、表面上のナノ構造の形状は、材料の殺菌活性に影響を与える可能性があります。例えば、Linら¹⁶ は、陽極酸化および電気泳動堆積(EPD)によって、Mg基板の表面に異なるナノ構造MgO層を作製した。 in vitroでナノ構造表面への一定期間の曝露後、 黄色ブドウ球菌 の成長は、未処理のMgと比較して大幅に減少した。これは、未処理の金属Mg表面に対する細菌接着に対するナノ構造表面のより大きな効力を示した。本稿では、様々なナノ構造表面の抗菌特性のさまざまなメカニズムを明らかにするために、対象領域内の細胞表面相互作用を決定する集束接触露光法(方法D)について説明します。

この記事の目的は、さまざまなナノ粒子、ナノ構造表面、および微生物種に適用できる4つのin vitroメソッドを提示することです。比較可能性のために一貫性のある再現性のあるデータを生成するための各方法の主な考慮事項について説明します。具体的には、ナノ粒子の抗菌性を調べるために、直接共培養^法17および直接露光法が用いられる。直接共培養法により、最小発育阻止濃度と最小殺菌濃度(それぞれMICとMBC_90-99.99)を個々の種について決定でき、最も強力な濃度(MPC)を複数の種について決定できます。直接暴露法により、最小阻害濃度でのナノ粒子の静菌または殺菌効果を、経時的なリアルタイムの光学濃度測定値によって特徴付けることができます。直接培養¹⁴法は、ナノ構造表面に直接的および間接的に接触している細菌を検査するのに適している。最後に、細菌の直接適用と細胞-ナノ構造界面での細菌増殖の特性評価を通じて、ナノ構造表面上の特定の領域の抗菌活性を調べるために、集束接触曝露¹⁶法を提示します。この方法は、日本工業規格JIS Z 2801:2000¹⁶から修正されたもので、微生物と表面の相互作用に着目し、微生物培養におけるバルク試料分解が抗菌活性に及ぼす影響を排除することを目的としています。

プロトコル

直接共培養法と直接暴露法を提示するために、酸化マグネシウムナノ粒子(nMgO)をモデル材料として使用し、細菌の相互作用を実証します。直接培養法と集束接触露光法を提示するために、例としてナノ構造表面を有するMg合金を使用します。

1. ナノ材料の滅菌

注:すべてのナノ材料は、微生物培養の前に滅菌または消毒する必要があります。使用できる方法には、熱、圧力、放射線、消毒剤が含まれますが、 in vitro 実験の前に、各方法の材料の耐性を特定する必要があります。

1. ナノ粒子
   注:サンプルは、エタノールなどの有機溶媒に保存するか、皿や箱に包装した後、適切な方法で滅菌または消毒することができます。ナノ粒子を、直接共培養法¹⁷ および直接暴露法のデモンストレーションのために以下の方法を用いて滅菌した。
   1. 各in vitro実験の前に、200°Cの対流式オーブン^30で60分間MgOナノ粒子を滅菌します。
      注:水蒸気と紫外線がMgOナノ粒子(nMgO)の構造に影響を与える可能性があるため、この方法が選択されました¹⁷。
2. バルク材料
   注:ナノ構造材料は、直接培養法のデモンストレーションのために以下の方法で滅菌されました。
   1. 直接培養法¹⁴の場合、調製したZC21、Mg、およびT64サンプルを紫外線(UV)放射を使用して4時間消毒してから、 in vitro 試験を開始します。
   2. 集束接触曝露法¹⁶の場合、 in vitro 研究を開始する前に、UV放射を使用してすべてのサンプルを2時間消毒します。
3. あるいは、熱に弱い材料の滅菌にエチレンオキシド(EtO)を使用してください。

2. 直接共培養法(A法)

注:方法Aでは、ラグフェーズ播種培養中の細菌を特定の濃度のナノ粒子と直接混合します。ナノ粒子の抗菌活性の検査については、Nguyenら¹⁷によって記述されたプロトコルに従います。

1. ナノ粒子およびナノ構造のキャラクタリゼーション
   注:ナノ構造の組成と形状は、粉末X線回折を用いて確認されます。
   1. ナノ粒子の測定
      1. 3 mL サンプルを 3 mL の 3 倍の質量で計量します。例えば、1.8 mg/mL で 0.2 mg/mL nMgO を計量します。
         注:これにより、細菌培養物およびブロス中のナノ粒子の一貫した分布が保証されます。
      2. 分析天びんを使用して事前に計量および風袋処理された5.0 mLマイクロ遠心チューブ内のすべてのナノ粒子を測定します。
2. 細菌培養の準備と成長
   1. 各 in vitro 実験について、-80°Cで保存した細菌細胞ストックを取り出す。 各細菌細胞ストック10 μLを5 mLの適切な増殖培地に加えます。
   2. 接種した培地をインキュベーター振とう機に入れ、37°C、250rpmで約16時間一晩過ごします。
      1. ブドウ球菌種を増殖させる場合は、各一晩培養液400 μLを20 mLの新鮮な増殖培地(100 μL/5 mL培地)に入れ、37°C、250 rpmでさらに4〜6時間振とうしながらインキュベートします。
3. 細菌細胞を洗浄してカウントし、播種密度を決定します
   注:7.8 × 10⁶ CFU / mLの望ましい播種密度は、尿路感染症を確認するために必要な細胞数よりも大きい細胞数として特定されました。
   1. 1 mLの一晩の細菌培養物を1.5 mLの微量遠心チューブに分注して、培養細菌を回収します。一晩の細菌培養から十分な数のアリコートを作成し、1,956 × g で10分間遠心分離して、目的の播種密度に到達します。
   2. 遠心分離後、ピペットでペレット化された細胞から上清を除去し、上清を回収容器に入れます。細胞ペレットを0.5 mLの新鮮な増殖培地に再懸濁します。2つの0.5 mL懸濁液を組み合わせて1 mLの懸濁液を作成し、再懸濁した細胞の1 mLアリコートの数を6つに減らします。1,956 × gで10分間遠心分離を繰り返します。
   3. ステップ2.3.2のように、新鮮な増殖培地を使用して2回目の洗浄サイクルを完了し、再懸濁洗浄された細胞の1 mLアリコートの数を3つに減らします。
   4. 細胞ペレットを0.33mLのトリス緩衝液(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液(Tris緩衝液、pH8.5)に再懸濁することを除いて、ステップ2.3.2と同様に第3サイクルを完了する。それぞれ0.33 mL容量の3つの懸濁液を1つの1.5 mLマイクロ遠心分離機に混ぜ合わせます。1,956 × gで10分間遠心分離を繰り返します。
      注:トリスバッファーには、Mg2+または^Ca2+イオン³¹は含まれていません。これは、誘導結合プラズマ発光分析(ICP-OES)を使用して、培養後培養液中のMg2+および^Ca2+イオンを測定するために重要です。対照的に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)³²中に存在するリン酸塩は、例えば、Mg2+または^Ca2+イオン^33、34、35の両方を隔離し^、ICP-OESデータの解釈に混乱を引き起こす。
   5. ペレット化した細胞から上清を除去する。細胞ペレットを、細胞懸濁液として知られる1 mLの新鮮なTrisバッファー(ラグフェーズ細菌播種培養物)に再懸濁します。
   6. 血球計算盤を使用して細胞懸濁液濃度(細胞/ mL)を決定します。
4. 播種菌培養の創出
   注:サンプルの総容量は3mLで、3回(合計9mL)で完成します。
   1. 必要な細菌播種培養物の総量を決定します。播種培養を作成するには、C 1 V₁= C 2 V ₂を使用して、7.8 × 10⁶ cells/mLの播種培養を作成するために必要な細胞懸濁液の量を計算します。計算された細胞懸濁液の量(V₁)を必要な量の増殖培地(V₂)に加える。
   2. 実際の細菌播種密度をCFU/mLで決定します。^10-4への10倍の段階希釈を作成します。^10-4 希釈液を適切な成長寒天に広げ、一晩インキュベートします。インキュベーション後、コロニー数をカウントし、CFU/mLを計算します。
5. 細菌およびナノ粒子培養の形成
   1. 12ウェルの非組織処理ポリスチレンプレートに、必要なウェル数に対して各ウェルに2mLの細菌播種培養物を分注する。
   2. 事前に秤量したnMgOを含む5 mLの微量遠心チューブごとに、3 mLの細菌播種培養物を追加します。短時間渦を流してnMgOを細菌と混合する。1 mLの混合物を3つの別々のウェルに分注し、nMgOの各重量を事前に測定した三重サンプルを作成しました。細菌/ nMgO混合物をピペットします 2〜3倍前に、各1 mLアリコートを作成して、nMgOを懸濁液に維持します。
      注:対照サンプルは、3 mLの細胞のみ、3 mLの培地のみ、および使用されるナノ粒子の最低濃度と最高濃度を含む3 mLで構成されます。これらはステップ2.5.2のように準備されます。すべての対照サンプルは三重に完成します。
   3. すべての12ウェルプレートを37°C、120 rpmで24時間インキュベートします。
6. nMgO曝露後の細菌細胞増殖の決定
   1. 細菌培養物を一晩インキュベートした後、個々の15 mLコニカルチューブにピペッティングして3 mLサンプルごとに収集します。
   2. 96ウェルプレートを使用して、1:10の連続希釈を作成します。細菌を含むすべてのサンプルを連続的に希釈するために必要なカラム数を決定します。180 μLのTrisバッファーをB行Gの各ウェルに追加し、適切なカラム数にします。
   3. 細菌サンプルを含む各15 mLコニカルチューブを短時間ボルテックスし、50 μLをA列の個々のウェルに追加します。
   4. A列の各ウェルについて、20 μLをB列(例:A1からB1)に移し、ピペッティングにより短時間混合して200 μLの容量を得る。 滅菌ピペットチップを使用して、20 μLをB行目のウェルからC列目のウェルに移します。 G行のウェルに200 μLが含まれるまでこのパターンを続けます。 行Bの10⁻¹ から行Gの10⁻⁶ への連続希釈を完了します。
   5. 各ウェルのピペット100 μLを適切な増殖寒天プレート上に、プレート全体に広げて、細胞培養物を分散させた。プレートをインキュベーターシェーカーに37°Cで一晩入れます。 プレートを37°Cで24時間インキュベートします。
   6. プレートを調べて、約25〜300個のコロニーがあるプレートを数えます。可能であれば、同じ希釈値のプレートを選択してください。プレートあたりのコロニー数を使用して、CFU/mLを計算します。
7. インキュベーション後のpHの評価
   注意: 各pHメーターモデルの製造元の指示に従ってください。
   1. pH 4、pH 7、およびpH 10の標準化溶液を使用して、pHメーターを事前に校正します。pHプローブを15 mLコニカルチューブに入れて、各細菌サンプルを読み取ります。
8. ICP-OES用サンプルの調製
   注:ICP-OESは、Mg² +および^Ca2+ イオンの濃度を決定するために使用されます。それぞれが細胞代謝に関与するので、これらの陽イオンは重要であると考えられています。
   1. ステップ2.6.1で調製した各15mLコニカルチューブを5,724× g で5分間遠心分離し、細胞およびナノ粒子の破片をペレット化した。
   2. 15 mLのコニカルチューブを使用して、30 μLの上清を2.97 mLの18.2 Ωろ過水に希釈し、1:100の希釈を作成します。
      注:希釈係数は、予測されるイオン濃度と分光器機器の検出限界に基づいて調整できます。
   3. ICP-OES を使用してサンプルを読み取ります。

3.直接露光法(B法)

注:選択した細菌の増殖速度が不明な場合は、この方法を実装する前に成長曲線の標準化を完了する必要があります。

1. 目的のナノ粒子への曝露時のリアルタイムの静菌および殺菌活性を決定します。
   1. ステップ2.1〜2.1.2.2に記載の方法を使用して、所望の濃度のナノ粒子を調製する。使用するナノ粒子の各重量の2セットを準備します:1つは対数増殖段階で細菌培養物の3 mLアリコートに添加され、もう1つは対照群として細菌を含まない3 mLアリコートの増殖培地に添加されます。
   2. 試験する細菌種に適した静菌性および殺菌性抗生物質を決定します。
      注:各抗生物質の最小阻害濃度の知識が必要です。
2. すべてのナノ粒子、抗生物質、および対照サンプルの3 mLサンプルの3 mLを3回投与するために必要な細菌培養の総量を計算します。
   注:等量の滅菌増殖培地が必要です。分光光度法の使用が計画されている場合、これには、キュベットに必要な0.5mL〜1.0mLの容量の収容に必要な総容量を調整する必要があります。
3. 1日目: in vitro実験ごとに、ステップ2.2.1〜2.2.2に従って一晩ストックを作成します。
4. 2日目:プレートリーダーの設定が、光学密度600nmの96ウェルプレートに対応できることを確認します。96ウェルプレートを使用して200 μLアリコートのサンプルを測定します。
   1. ナノ粒子と抗生物質を添加する前の初期インキュベーション期間を開始するために使用される密度である0.01で初期細菌培養OD₆₀₀ を決定します。
   2. インキュベーターシェーカーから一晩細菌培養物を収集します。
      1. 試験する材料(事前に測定されたナノ粒子や抗生物質など)ごとに、OD₆₀₀ が0.01の個別の細菌培養を作成します。必要な細胞培養量を収容するのに十分な大きさの容器(滅菌済み三角フラスコや50 mLコニカルチューブなど)を使用してください。
      2. 増殖培地の200 μLアリコート3個を3つのウェルに、細菌培養液の200 μLアリコート3個を追加ウェル(A1からA6など)に入れて、一晩細菌サンプルを増殖培地で希釈します。
      3. 96ウェルプレートをプレートリーダーに入れてスキャンします。
         注:測定値は、スキャンされたウェルごとに平均化され、平均値が生成されます。
      4. 懸濁液中の細菌の密度を計算するには、三重サンプルを含む各ウェルの平均値を平均します。
      5. 細菌の光学密度を決定するには、細菌平均からブロスサンプル平均を差し引きます。
      6. 細菌懸濁液を調整し続ける必要がある場合は、必要に応じてブロスまたは一晩の細菌培養液を追加し続け、約0.01のOD₆₀₀ に達するまで必要に応じてプレートリーダーでスキャンを繰り返します。
      7. 対数成長に達するまで150rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートします。
5. インキュベーターシェーカーから細菌培養物を取り除きます。
   1. OD₆₀₀ 0.01細菌培養物3 mLを標識された15 mLコニカルチューブに分注し、テストサンプルとコントロールサンプルを3回に分けて使用します。
   2. 細菌培養液200 μLを96ウェルプレートの3ウェルに分注し、プレートリーダーを使用してサンプルを測定します。
   3. ステップ3.4.2.2およびステップ3.4.2.6で説明したように読み取り値を計算します-「-0.5時間の読み取り値」。
6. 細菌/ナノ粒子混合物の創製と測定
   1. 細菌培養物と同数の3 mLの滅菌増殖培地を、対照サンプル用の標識された15 mLコニカルチューブに分注します(3回)。
   2. 細菌/ナノ粒子懸濁液および滅菌培地/ナノ粒子懸濁液を調製するには、15 mLコニカルチューブの各トリプリケートセットから1 mLの細菌培養物または培地を除去します。
      1. 1 mLアリコートを、事前に測定されたナノ粒子を含む5 mL遠沈管に入れ、短時間ボルテックスして混合します。
      2. 5 mLの遠沈管から、1 mLの細菌/ナノ粒子または培地/ナノ粒子懸濁液を15 mLのコニカルチューブに戻し、ナノ粒子を均一に分配します。
         注:細菌/ナノ粒子混合物をピペットで処理し、各1 mLアリコートをピペットで固定して、ナノ粒子を懸濁液に維持します。
7. 細菌/抗生物質混合物の作成と測定
   1. 細菌/抗生物質培養物を作成するには、インキュベートした細菌培養物3 mLを、対応する標識の15 mLコニカルチューブに分注します。
   2. すべてのサンプルを調製したら、各サンプル200 μLを96ウェルプレートの個々のウェルに分注します。
   3. プレートをプレートリーダーに入れ、スキャンを開始します-「0時間」の読み取り。
   4. サンプルを入れた15 mLのコニカルチューブを、37°C、150 rpmのインキュベーターシェーカーに入れます。ステップ 3.4.2.2 およびステップ 3.4.2.6 で前述したように、すべてのデータを記録します。
8. 0時間の読み取りが完了してから約15分後に、ステップ3.7.2-3.7.3-「0.5時間」の読み取りで説明されている手順を繰り返します。
   1. 確立された0時間後、ステップ3.7.2-ステップ3.7.3で説明されている手順を90分ごとに6サイクル繰り返します。9時間で完了します。
   2. 6回目のサイクルが完了したら、サンプルをインキュベーターシェーカーに入れて、37°C、150rpmでさらに15時間待ちます。手順3.7.2〜3.7.3で説明されている手順を繰り返して、24時間の読み取り値を取得します。ステップ 3.4.2.2 およびステップ 3.4.2.6 で前述したように、すべてのデータを記録します。

4. 直接培養法(C法)

注:方法Cでは、ラグフェーズ播種培養中の細菌を目的のナノ構造表面に直接配置します。ナノ構造の抗菌活性の検討については、Zhangら¹⁴によって記述されたプロトコルに従います。この直接培養法を実証するために、ZC21(Mg-Zn-Ca合金)とMgピンをサンプルとして使用しました。

1. 細菌培養の準備と成長
   1. in vitro実験ごとに、ステップ2.2.1〜2.2.2に従って一晩ストックを作成します。
2. 播種密度を決定するための細菌の洗浄とカウント
   注:7.5 × 10⁵ CFU / mLの望ましい播種密度は、整形外科感染症を引き起こす報告された細胞濃度として特定されました¹⁴。
   1. インキュベーターシェーカーから一晩細菌培養物を取り出します。
   2. ステップ2.3.2〜2.3.2.3に従って細菌を洗浄して収集しますが、洗浄ステップごとに新しい培地を改訂されたシミュレートされた体液(rSBF)と交換します。
      注:rSBFは、ヒト血漿のイオン濃度を模倣する緩衝液です。しかし、rSBFは無機化合物のみを含み、タンパク質などの生物有機化合物は一切含まれていません。これを解決するために、ウシ胎児血清(FBS)をrSBFと組み合わせてヒト血液の組成をシミュレートし、実験条件下で石灰化組織におけるアパタイトの自然な形成をよりよく模倣します³⁶。
   3. ペレット化した細胞から上清を除去する。細胞ペレットを10%FBS-細胞懸濁液を添加した1mLのrSBFに再懸濁します。
   4. 血球計算盤を使用して細胞懸濁液濃度(細胞/ mL)を決定します。細胞懸濁液を10%FBSを添加したrSBFで7.5×10⁵ 細胞/ mLの濃度に希釈します。手順 2.4.1 に従ってシード カルチャを作成します。
   5. 手順 2.4.2 に従って実際のシード密度を決定します。
3. 細菌細胞懸濁液を培養ウェル内のサンプルに分配します。
   1. サンプルとコントロールサンプルの両方を、48ウェルの非組織処理ポリスチレンプレートの個々のウェルに入れます。
   2. 0.75 mLの細胞懸濁液を、サンプルおよびコントロールを含む各ウェルに分注します。48ウェルプレートをインキュベーターシェーカーに入れ、37°Cで24時間、120rpmで振とうします。
4. 細菌濃度の特性評価
   1. 24時間のインキュベーション後、サンプルを収集し、ラベルの付いた個別の収集チューブに入れます。
   2. 各グループから2つのサンプルを収集し、標識された5.0 mLマイクロ遠心チューブに個別に配置します。各チューブに2 mLのrSBFを追加します。
   3. ステップ4.4.2で収集したサンプルを超音波処理浴に入れ、10分間超音波処理します。各5分の期間の後、各サンプルを5秒間ボルテックスします。
   4. 新たに剥離した細菌細胞を含むrSBFを収集し、懸濁液を標識された新鮮な微量遠心チューブに入れます。
5. 細菌の連続希釈とメッキ
   1. ステップ2.6.2〜2.6.6に従って細菌懸濁液を連続的に希釈してプレートします。
6. 培養液のインキュベーション後のpHを評価するには、ステップ2.7に従います。
7. ステップ2.8に記載の方法に従って、ICP-OES用の後培養培地を調製します。

5. 集束接触露光法(D法)

注:方法Dでは、ニトロセルロース濾紙上の細菌をナノ構造表面の関心のある領域に直接接触させます。この方法は、細菌培養におけるバルクサンプル分解と細菌活性の干渉を最小限に抑えます。ナノ表面の抗菌活性を調べるために、Linら¹⁶によって記述されたプロトコルに従います。

1. ステップ 2.2.1-2.2.2.1 の手順に従って、細菌播種培養を作成します。手順2.4.2に従って実際の播種密度を確認します。
2. サンプルを正方形×1 cm² のサイズに調製します。すべてのサンプルタイプを3連で準備します。必要に応じて、直径15 mm、高さ10 mmの3次元(3D)ホルダーにサンプルを置きます。サンプルとホルダーを非組織培養処理ポリスチレンウェルプレートのウェルに入れます。
3. 滅菌ニトロセルロース紙をそれぞれ直径1 cmにトリミングして準備します。準備したニトロセルロース紙を、適切な培地を入れた寒天プレートに置きます。
4. 希釈した細菌培養物50μLをろ紙にピペットします。
5. 各試料表面の中心に適当な培地50μLをピペットする。
6. 滅菌ピンセットを使用して、寒天の表面からニトロセルロース紙を拾います。ニトロセルロース紙を慎重に裏返し、細菌が50 μLの培地および目的のナノ構造表面に接触するようにサンプル表面に置きます。
7. 湿度を維持するために、サンプルを含む各ウェルに1 mLのTrisバッファーを追加します。すべてのサンプルを含むポリスチレンウェルプレートを37°Cで24時間インキュベートします。
8. 各サンプル表面からニトロセルロース紙を収集します。それぞれを5 mLのトリスバッファーに入れます。収集したろ紙とナノ表面材料サンプルを5秒間ボルテックスします。
9. 各サンプルを10分間超音波処理します。5分後と10分後に5秒間渦巻きます。
10. すべてのサンプルからTrisバッファー懸濁液を採取し、各ボリュームを個々の新鮮な収集チューブに入れます。
11. ステップ2.6.2-2.6.6に従ってサンプルを連続的に希釈してプレートします。

6. 細菌およびナノ材料の培養後特性評価

1. 走査型電子顕微鏡(SEM)を用いた細菌の付着・形態の検討
   1. 一晩インキュベートした後、サンプルが完全に覆われるまで、48ウェルの非組織処理ポリスチレンプレートの各ウェルに10%グルタルアルデヒドを加えます。サンプルを1時間インキュベートして、細菌細胞を固定します。
   2. グルタルアルデヒドを廃棄物ボトルに吸引し、すべてのサンプルをトリス緩衝液で3回すすぎ、非付着細菌を除去します。
   3. 30%、75%、および100%エタノールを使用してサンプルをそれぞれ30分間脱水^します16。
      注意: サンプルを乾燥させるには、臨界点乾燥機を使用することをお勧めします。サンプルを室温で24時間風乾することは理想的ではありません。
   4. 銅テープやカーボンテープなどの導電性粘着テープを使用して、サンプルをSEMスタブに固定します。イメージング前に導電性を確保するために、スパッタコーティング を介して サンプル表面をコーティングします(たとえば、Mgプレートを付着した細菌で白金/パラジウム(Pt/Pd)下で20 mA¹⁶で45秒間コーティングします)。
      注意: コーティング材料、処理時間、および動作電流は、サンプルの種類によって異なる場合があります。
   5. SEMを使用して、適切な作動距離と加速電圧、および目的の倍率でサンプル上の細菌の画像を撮影します。たとえば、二次電子検出器を備えたSEMを使用して、作動距離5 mm、加速電圧^{10 kV 16}で画像を撮影します。
2. 培養後のナノ材料サンプルの表面形態をSEMで調べます。
   1. ナノ材料の場合は、トリスバッファー3xを使用してサンプルを洗浄し、サンプルに付着していない遊離細菌を除去します。ナノ粒子の場合、必要に応じてより良い分散を達成するために、超音波処理によってサンプル特性に影響を与えない溶媒に粒子を分散させる。
   2. 洗浄手順の後にサンプルを乾燥させます。
   3. カーボンまたは銅の両面粘着テープを使用して、サンプルをSEMスタブに接着します。
   4. イメージングの前に、ステップ6.1.4で説明されているように、スパッタコーターを使用してPt / Pdの導電性表面層を作成します。ステップ 6.1.5 の説明に従ってサンプル画像を取得します。
   5. EDSを用いて、適切な加速電圧で、所望の倍率で(例えば、SEM分析¹⁶を実行した後、10kVで)表面元素組成を分析する。
3. 細菌付着の蛍光イメージング
   1. 蛍光顕微鏡を使用して可視化するサンプルを、まずトリスバッファー3xで洗浄して調製します。サンプルを室温で風乾します。
   2. 確立されたプロトコル³⁷に従って、各サンプルを10 μMチオフラビンT蛍光色素で染色します。
   3. 電子増倍電荷結合素子デジタルカメラと結合した倒立顕微鏡を用いて細菌接着の蛍光イメージングを行う。

結果

酸化マグネシウムナノ粒子およびナノ構造表面の抗菌活性の同定は、異なる材料タイプおよび微生物種に適用可能な4つの in vitro 方法を使用して提示されている。

方法Aおよび方法Bは、ラグフェーズ(メソッドA)およびログフェーズ(メソッドB)でナノ粒子に24時間以上曝露された場合の細菌活性を調べます。方法AはMICおよびMBCに関する結果を提供し、方法Bはナノ粒子...

ディスカッション

ナノ粒子およびナノ構造表面の抗菌活性を特徴付けるための4つのin vitro法(A-D)を提示しました。これらの方法のそれぞれは、ナノ材料に応答して経時的な細菌の増殖および生存率を定量化するが、初期の細菌播種密度、増殖、および経時的な生存率を測定するために使用される方法にはいくつかのばらつきが存在する。これらの方法のうちの3つ、直接共培養法(A)¹⁷、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Milipore Sigma	Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven	MTI Corporation	BPG-7082	https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer	Sigma-Aldrich	42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE	Fisher Scientific	50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera	Hamamatsu	C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Hemocytometer	Brightline, Hausser Scientific	1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES)	PerkinElmer	8000
Inverse microscope	Nikon	Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth	Sigma Life Science	L3022
Luria Bertani Broth + agar	Sigma Life Science	L2897
MacroTube 5.0	Benchmark Scientific	C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles	US Research Nanomaterials, Inc	Stock #: US3310   M	MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance	Mettler Toledo	MS105D
Nitrocellulose paper	Fisherbrand	09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351172
Petri dish 100 mm	VWR	470210-568
Petri dish, 15 mm	Fisherbrand	FB0875713A
pH meter	VWR	SP70P
Scanning electron microscopy (SEM)	TESCAN	Vega3 SBH
Sonicator	VWR	97043-936
Table top centrifuge	Fisher Scientific	accuSpin Micro 17
Table top centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar	MP	1010617
Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
UV-Vis spectrophotometer	Tecan	Infinite 200 PRO	https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L	VWR	N/A
X-ray power defraction	Panalytical	N/A	PANalytical Empyrean Series 2