التوصيف الفسيولوجي للهولوبيونت المرجاني باستخدام أداة جديدة لقياس التنفس الدقيق

Summary

يصف هذا البروتوكول إعداد وتشغيل نظام قياس التنفس الدقيق الذي يمكن استخدامه للتحقيق في السمات الفسيولوجية ل holobiont المرجان.

Abstract

النشاط الأيضي ، الذي يعرف بأنه مجموع العمليات العضوية التي تنطوي على الطاقة ، له أهمية حاسمة في فهم وظيفة وتطور الحياة على الأرض. وبالتالي ، فإن قياس معدلات التمثيل الغذائي للكائنات الحية هو في صميم شرح الحالات الفسيولوجية للكائنات الحية ، وأدوارها البيئية ، وتأثير التغير البيئي على الأنواع داخل النظم الإيكولوجية الأرضية والمائية. فيما يتعلق بالشعاب المرجانية ، تم استخدام مقاييس التمثيل الغذائي لتحديد أداء التكافل بين الشعاب المرجانية والطحالب المتعايشة الملزمة (Symbiodiniaceae) ، وكذلك تقييم كيفية تأثير الضغوطات البيئية ، بما في ذلك تغير المناخ ، على صحة المرجان. على الرغم من هذه الأهمية ، هناك نقص في الأساليب ، وبالتالي البيانات ، المتعلقة بقياسات معدل الأيض في نسل المرجان ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى صغر حجمها. لمعالجة هذه الفجوة ، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير إعداد مخصص لقياس تنفس بيئات البحرية الصغيرة (نطاق حجم المليمتر). يجب أن يسمح هذا الإعداد المنخفض التكلفة والسهل بتحسين قياس معدل الأيض. سيكون هذا ضروريا للبحوث البيئية التطبيقية التي تستخدم الإنتاج الجنسي للشعاب المرجانية لاستعادة الشعاب المرجانية.

Introduction

التنفس هو قياس بيولوجي مهم يشير إلى النشاط الأيضي الكلي للكائن الحي ، ولكن مثل السمات الحرجة الأخرى (النمو) ، يصعب قياسه في الكائنات الحية^{الصغيرة 1}. يمكن تعريف التنفس بأنه أكسدة الجزيئات العضوية من خلال استخدام الأكسجين. تولد هذه العملية الطاقة الكيميائية اللازمة للوظيفة الخلوية (أي التمثيل الغذائي) ، وهو أمر ضروري لبقاء الكائنات الحية. بدلا من ذلك ، يؤدي التمثيل الغذائي اللاهوائي إلى دين الأكسجين². يمكن تحديد معدلات التنفس باستخدام البصريات التي تقيس استخدام (وبالتالي انخفاض) تركيز الأكسجين بمرور الوقت في غرفة مغلقة ، وهي ممارسة تعرف عموما باسم قياس التنفس³. وبالنظر إلى أن غالبية الكائنات الحية لا تخزن الأكسجين، يمكن استنتاج معدل الأيض من خلال العلاقة المباشرة بين التنفس واستخدام الكربون. لهذا السبب ، يمكن تحويل معدلات التنفس إلى الاستخدام اليومي للكربون ، والذي يعلم وظائف التمثيل الغذائي الحرجة مثل النمو والتكاثر والقدرة على الحفاظ على التوازن الأيضي خلال أوقات الإجهاد البيئي ^4,5 ، بما في ذلك ظروف موجة الحر التي تؤدي عموما إلى الإجهاد أو التبييض في الشعاب المرجانية.

تتناقص الشعاب المرجانية على مستوى العالم بمعدل متسارع. يضم المرجاني مجموعة من الشركاء (بما في ذلك dinoflagellate Symbiodiniaceae والفطريات والبكتيريا والفيروسات) ، يشار إليها مجتمعة باسم "holobiont"⁶. مع ارتفاع درجات حرارة المحيطات ، تتعرض الشعاب المرجانية ، وبالتالي الشعاب المرجانية ، لضغوط متزايدة للبقاء على قيد الحياة ، حيث تؤدي درجات الحرارة المرتفعة إلى فقدان Symbiodiniaceae (المشار إليها فيما يلي بالمتعايشات) ، وهي ظاهرة تعرف باسم التبييض⁷. العديد من العناصر الغذائية غير متوفرة للشعاب المرجانية في المياه الاستوائية قليلة التغذية ، بما في ذلك النيتروجين غير العضوي والفوسفور⁸. للتعامل ، تشكل الشعاب المرجانية تكافلا غذائيا ملزما مع تكافلاتها ثنائية السوط (Symbiodiniaceae) ، والتي توفر غالبية العناصر الغذائية التي يحتاجها مضيف المرجان للبقاء على قيد الحياة وإيداع الهياكل العظمية لكربونات الكالسيوم⁹. قد يتميز التكافل الوظيفي بمستويات عالية من مشاركة الكربون بين الشركاء^10,11 ، وينطوي تنظيم التكافل على توازن ديناميكي¹².

أثناء الإجهاد الحراري ، يتم تعطيل هذا التنظيم الديناميكي والتواصل ، مما يؤدي إلى dysbiosis والتبييض (تمت مراجعته في المرجع¹³). وبالتالي ، فإن القياسات الأيضية ، مثل التمثيل الضوئي والتنفس ، لديها القدرة على توضيح كل من الحالات الصحية وغير المنظمة ، وعسر التحلل الحيوي للشعاب المرجانية ، وقياس هذه العمليات بدقة عبر تطور الجنين أمر بالغ الأهمية لفهم أداء الكائن الحي. هذا مهم بشكل خاص مع زيادة تواتر وحجم أحداث التبييض الجماعي ، مع إمكانية التأثير على التغيرات في مشاركة المغذيات من المتعايشات ، حيث وجد أن انتقال الكربون ينخفض مع زيادة درجات الحرارة¹⁴. قد يكون هذا بسبب الآليات الموجهة بواسطة العناصر الغذائية المتكافلة أو من المقايضات الفسيولوجية الصلبة (زيادة التسامح الحراري ولكن انخفاض في بقاء المضيف^15،16،17). قد تنبع الاضطرابات في التكافل من كل من المتعايش والمضيف ، على الرغم من أن العامل الرئيسي هو على الأرجح الخلل الخلوي في المتعايش¹⁸. ومع ذلك ، فإن الإجهاد الناجم عن الزيادات في درجات حرارة مياه البحر يزعزع استقرار هذا التكافل. يتضاءل تقاسم الكربون من المتعايش إلى المضيف^19,20 ، وقد يترتب على ذلك تجويع المرجان. قد ينعكس هذا في تناقص مخازن الدهون والكربوهيدرات في الشعاب المرجانية بسبب زيادة استخدام المضيف ("زيادة هدم الكربون الثابت") ، على الأرجح بسبب تناقص المشاركة من قبل المتعايشين¹¹. إلى جانب مساهمة التمثيل الضوئي والتنفس لمتعايشات الشعاب المرجانية ، يعد تنفس المرجان مقياسا مهما لفهم صحة المرجان ، وتأثيرات التبييض وتبادل المغذيات بين هؤلاء الشركاء ، ونمو holobiont ، وهو نمط ظاهري ذي صلة بالبقاء على قيد الحياة التغير البيئي^8،21،22. أخيرا ، نظرا لأن العديد من الشعاب المرجانية تكافلية ، فإن استخدام قياس التنفس لتوصيف التمثيل الضوئي بالإضافة إلى التنفس مفيد بشكل خاص لوضع نسب P: R في سياقها وفهم ما إذا كان التكافل مستقرا أم لا (على سبيل المثال ، المرجع²³).

وبالتالي ، فإن التغيرات البيئية تسبب تحولات في ميزانيات الطاقة للشعاب المرجانية والكائنات المتعايشة معها ، مما يؤدي إلى اختلافات في النمو¹⁴. للتعامل ، قد يزيد مضيف المرجان من التنفس واستخدام الدهون لتلبية متطلباته الأيضية. يمكن أن يقلل الإجهاد الحراري من الإنتاجية الصافية بنسبة 60٪ بسبب زيادة التنفس¹⁴ ، كما يقاس بالتغير في الأكسجين المذاب. قد تزيد Symbiodiniaceae أيضا من استيعاب النيتروجين واحتباس الكربون^14,24 ، ثم تستخدم هذه الاحتياطيات لتحويل الطاقة نحو آليات الإصلاح والحماية الخاصة بها^25,26. توازن N و C مهم لتنظيم النمو ، و P على وجه الخصوص²⁷ ، والذي قد يظهر كتنظيم ديناميكي للوفرة التكافلية. في الواقع ، تشير الأدلة التي تم جمعها من الشعاب المرجانية عبر مساحات كبيرة من الشعاب المرجانية (>1000 كم) إلى أن المضيفين لديهم القدرة على الحد من النمو التكافلي من خلال تنظيم P ، على الرغم من أن هذا يختلف حسب الأنواع المرجانية²⁷.

مجتمعة ، تشير هذه الدراسات إلى زيادة تحمل الحرارة مع انخفاض مصاحب في إنتاج أو نقل العناصر الغذائية (أي الميل إلى التكافل) بسبب التغيرات البيئية. لذلك يجب استخدام طرق قوية أحادية الحدث ، مثل القياس الكمي لاستخدام الأكسجين عن طريق قياس التنفس الدقيق ، لفهم الآليات الأساسية المتعلقة بالتمثيل الغذائي ثم تطبيقها على أسئلة الحفظ مثل فهم اكتساب تحمل الحرارة. يتم تقديم هذا هنا كأداة لقياس التنفس الدقيق للمقاييس الفسيولوجية ، والتي تهدف إلى الاستفسار عن العلاقة التغذوية بين صغار المرجان والطحالب المتعايشة معها ، ولكنها مناسبة للكائنات البحرية الصغيرة الأخرى.

يمكن قياس استخدام أو إنتاج الأكسجين من قبل الكائنات الحية عن طريق وضعها في غرف قياس التنفس الفردية المغلقة بإحكام أو "مقاييس التنفس" (الغرف المشار إليها فيما بعد) ، حيث يتم قياس تغير الأكسجين باستخدام البصريات³. البصريات هي مجسات تقيس تركيز الأكسجين باستخدام نبضات الضوء ، وتسمح قياسات التسجيل بمرور الوقت بحساب معدلات التنفس و / أو التمثيل الضوئي. في الممارسة العملية ، يشبه قياس التنفس قياس التمثيل الضوئي في الشعاب المرجانية ، باستثناء أن الشعاب المرجانية يتم تحضينها في ظلام دامس. يؤدي طرح إجمالي التنفس اليومي للشعاب المرجانية والمتعايشات من إجمالي التمثيل الضوئي اليومي إلى تفاضل الأكسجين (دلتا الأكسجين)^2,3. بشكل عام ، تستخدم الكائنات الحية الأكسجين أكثر مما تنتج ، مما يؤدي إلى عجز. يمكن تحويل هذا إلى مكافئات الكربون حيث يتم استهلاك الأكسجين والكربون بنسبة^{ثابتة 2}. يمكن استخدام فائض الكربون من قبل المرجان للنمو ، وتخليق المخاط والتكاثر ، والاحتياجات الأيضية الأساسية الأخرى¹².

يصف هذا البروتوكول طريقة التنفس الدقيقة (الشكل 1) التي تم استخدامها لقياس معدلات التنفس (R) لصغار المرجان الفردية باستخدام تصميم غرفة زجاجية 1.5 مل حسب الطلب (قارورة بخيط GL25 وارتفاع 20 مم ، مع نتوء / حافة ، وحافة أرضية مسطحة ، وغطاء لولبي مع ثقب ؛ انظر جدول المواد) مملوءة بمياه البحر المفلترة 0.5 ميكرومتر. تم إدخال بصريات الألياف الضوئية (انظر جدول المواد) في كل غرفة من خلال ثقب في جانب الغطاء. تم ربط كل مرجان فردي فوق منصة صفيحة تحريك شبكية صلبة تتدفق فوق قضيب تحريك مغناطيسي لضمان الخلط الكافي للمياه داخل الغرفة. في المثال التمثيلي هنا ، تم قياس اثنين من عناصر التحكم أو "الفراغات" (الغرف التي كانت متطابقة باستثناء وجود العينة) بشكل متزامن مع غرف العينات الثلاث المكررة ، حيث كان لدينا وحدات تحكم متعددة تعمل في وقت واحد. ومع ذلك ، فإن مثال الإعداد (الشكل 2) يظهر فقط استخدام أربع قنوات ؛ يمكن زيادة ذلك باستخدام وحدات تحكم متعددة وحوامل تدفق متعددة. يمكن أيضا التحكم في درجة الحرارة في هذا النظام عن طريق غمر كل غرفة في حمام مائي مخصص مع درجات حرارة مياه محددة مسبقا (27 درجة مئوية للتحكم أو 31 درجة مئوية لإجهاد درجة الحرارة العالية في بيانات المثال هنا) باستخدام نظام التدفق المعاد تدويره (التدفق المستمر واللطيف المحدد عند 75 لترا / ساعة). يمكن أن تكون منصة لوحة النمام ولوحة النمام مع التروس بأي حجم ويمكن جعلها كبيرة أو صغيرة حسب الحاجة لاستيعاب عدد الغرف الزجاجية. في هذا المثال ، كانت المنصة واللوحة حوالي 34 سم × 26 سم × 3 سم (جدول المواد). تم إجراء معايرة البصريات قبل كل تشغيل باستخدام محلولين قياسيين يمثلان تشبع الأكسجين بنسبة 0٪ و 100٪ عند درجة حرارة الماء والملوحة المناسبة لهذا الإعداد التجريبي.

Protocol

1. إعداد المعدات والشعاب المرجانية داخل غرف التنفس

ملاحظة: تم طرد الشعاب المرجانية الجاهزة للتكاثر (أي تلك التي تحتوي على حزم بيض / منوية مصطبغة وردية اللون مرئية من الفروع المجزأة من مستعمرات Acropora tenuis ) من الشعاب المرجانية في الجزيرة المغناطيسية (19 ° 6.249'S ؛ 146 ° 51.728'E) في يوم اكتمال القمر في أكتوبر 2018 (رقم التصريح: G12 / 35236.1) ، تم جمعها وإحضارها إلى المختبر لتفريخ المرجان ، حيث تم تربية ونمو الشعاب المرجانية اليافعة.

1. في يوم القياسات ، قم بتوصيل لوحين حمام مائي باستخدام أنابيب وموصلات زرقاء (انظر جدول المواد ؛ الشكل 1 [5] ، الشكل 2 أ ، ب). ستكون هذه بمثابة حاضنات بعد الاتصال بالأنابيب الزرقاء بسخان المياه / المبرد. تأكد من إمكانية رؤية لوحة المحرك بوضوح من خلال ألواح حمام الماء الشفافة عندما لا تكون غرف قياس التنفس في مكانها.
2. قم بتوصيل الخراطيم بسخان المياه / المبرد (انظر جدول المواد). قم بتشغيل سخان المياه / المبرد ثم اضبط درجة الحرارة التجريبية المطلوبة (27 درجة مئوية أو 31 درجة مئوية).
3. قم بتوصيل قاعدة الحمام المائي (الخطوة 1.1) بلوحة المحرك الأساسية باستخدام التروس المغناطيسية (الشكل 1 [6 ، 7] والشكل 3 أ) ، ثم قم بتوصيل هذا التجميع بمصدر طاقة (الشكل 3 ب). قم بتشغيل مصدر الطاقة لتنشيط التروس ، والتي ستعمل على تنشيط قضبان النمام في الغرف.
4. قم بتعديل تدفق المياه حسب الحاجة (على سبيل المثال ، التدفق المستمر واللطيف عند 75 لترا / ساعة مع التحريك البطيء عند 30 دورة في الدقيقة) باستخدام مقابض موصل الصمام (الشكل 3C).
5. لتجميع غرفة قياس التنفس ، أضف الخرزة المغناطيسية (الشكل 1 [1.5]) إلى الغرفة الزجاجية (الشكل 1 [1.6]) ، ثم قاعدة الحامل البلاستيكية المتدفقة غير الشفافة (الشكل 1 [1.4]) في الغرفة الزجاجية (الشكل 4 أ). يعتمد حجم الغرفة والخرزة المغناطيسية على الكائن الحي ونظام الدراسة محل الاهتمام.
   ملاحظة: توجد ثقوب في القاعدة البلاستيكية للسماح بتدفق المياه ودورانها من حركة الخرزة المغناطيسية في القاع.
6. قم بلصق المرجان باستخدام غراء حوض السمك (انظر جدول المواد) على ربطة العنق السوداء الموضوعة في القاعدة البلاستيكية (الشكل 4B-D). للقيام بذلك ، أولا ، قم بلصق الأحداث المرجانية بقطعة من البلاستيك الأسود ، ثم قم بلصق هذه القطعة على القاعدة البلاستيكية. بمجرد تثبيت المرجان بإحكام (تكون معالجة الغراء فورية تقريبا) ، قم بربط الغطاء بالحلقة O (الشكل 4 أ) على الغرفة الزجاجية. قم بتنفيذ هذه الإجراءات تحت الماء في حوض منفصل للتأكد من عدم وجود هواء داخل غرفة قياس التنفس.
   ملاحظة: تم تحديد حجم الماء في مقياس التنفس (أي الحجم الفعال = 1.5 مل) من خلال الغمر الكامل للغرفة تحت الماء. الافتراض هو أنه بالنسبة لحجم الماء ، فإن الإزاحة من كتلة / كثافة المرجان الصغير جدا لا يكاد يذكر. يظهر أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل هنا للمقياس (الشكل 4 أ).
7. ضع الغرف بإحكام في الحمامات المائية (الشكل 5 أ). تأكد من أن الغرف الزجاجية على اتصال بالمياه التي يتم التحكم في درجة حرارتها للتجربة.
8. قم بتوصيل كابلات الألياف الضوئية O₂ (انظر جدول المواد) بحيث تكون على اتصال ببقع مستشعر الأكسجين (المشار إليها فيما يلي باسم البقع ؛ انظر جدول المواد) عن طريق إدخالها في الفتحة المحفورة في جانب غرف الغطاء. هذه البقع الصغيرة حساسة للأكسجين وستكتشف وتنقل الإشارة من داخل الغرفة عبر كابل الألياف البصرية.
   1. أضف شريط السباكة (شريط أبيض رفيع ذاتي الغلق) لجعل الكابل مناسبا بشكل مريح وللسماح له بالبقاء بإحكام داخل غرفة الماء. تأكد من إمكانية رؤية المرجان الفردي (كما هو موضح في الشكل 5 ب) ، مع وجود مخالب بنية متجهة لأعلى ، داخل الغرفة (الشكل 5 ب ، الفيديو 1).
      ملاحظة: ترد تقديرات تكلفة مكونات الجهاز في الجدول 1.

2. إجراءات التشغيل القياسية لقياس التنفس باستخدام نظام O₂

1. افتح برنامج قياس الأكسجين (انظر جدول المواد).
2. قم بقياس درجة حرارة الغرفة التي سيتم فيها إجراء المعايرة. ستكون هناك حاجة إلى هذا لاحقا لمرحلة المعايرة (الخطوة 2.8).
3. قم بتجميع المستشعرات البصرية والأغطية. للقيام بذلك ، قم بتوصيل جميع الألياف الضوئية بمنفذ المطابقة في الوحدة النمطية O₂ . تأكد من مطابقة الغطاء 1 مع المستشعر 1 والغطاء 2 مع المستشعر 2 وهكذا.
4. لإعداد الغرف للمعايرة ، قم أولا بترطيب قطعة من الإسفنج النظيف بقليل من ماء التناضح العكسي (RO) وأدخله في كل غرفة.
   ملاحظة: يجب ألا تقطر الإسفنجة ، بل يجب أن تكون رطبة فقط. قد يقطر على بقعة الألياف البصرية. تأكد من أن البقعة ليست مبللة قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
5. ضع الغرف رأسا على عقب باستخدام الألياف البصرية المطابقة (الشكل 6). سيسمح ذلك بفك الحجرة دون لمس الألياف البصرية وإضافة كبريتيت الصوديوم لمعايرة 0٪.
6. تحقق من إشارة كل مستشعر قبل بدء المعايرة. راجع جميع علامات التبويب في واجهة البرنامج وتحقق من قيمة الإشارة (الزاوية اليسرى العليا) (الشكل 7 أ) ، وتأكد من أنها لا تختلف اختلافا كبيرا. تحقق من دليل O₂ للحصول على القيم المقبولة للإعداد التجريبي (اعتمادا على الكائن الحي وظروف الاهتمام). بالنسبة لهذا الإعداد المحدد ، عند درجة حرارة الغرفة 25.3 درجة مئوية ، يكون FTC (تدفق بقعة مستشعر الأكسجين عبر النطاق الطبيعي للخلية) 20.59 مع الإشارة عند 179.5 مقبولا.
7. افتح البرنامج وتحقق من الإعدادات في البرنامج للتأكد من صحتها كما هو موضح أدناه. إذا لم تظهر النافذة المنبثقة فور فتح البرنامج ، فيمكن القيام بذلك عن طريق النقر فوق الزر "إعدادات " في الزاوية السفلية اليسرى من واجهة البرنامج.
8. تأكد من تنشيط مستشعر درجة الحرارة الخارجية (الشكل 7 ب). قم بتغيير الإعداد إلى درجة حرارة ثابتة (الشكل 7C). ثم أضف قيمة درجة حرارة الغرفة وانقر فوق نسخ الإعداد لجميع القنوات الأخرى.
9. قم بتغيير الإعداد لتقليل انحراف الإشارة (الشكل 7C). ثم حدد إعدادات المستشعر وحدد المستوى 2. خلاف ذلك ، في حالة استخدام كميات صغيرة ، سيكون الانجراف مرتفعا جدا بحيث يكون من الصعب معايرته.
10. تحقق من الإعدادات العامة للقنوات. اضغط على موافق إذا كان كافيا. انقر فوق نسخ الإعدادات لكافة القنوات، ثم انقر فوق موافق.
11. معايرة المستشعرات. لمعايرة القناة 1 ، انتقل إلى علامة التبويب القناة 1 واضغط على زر المعايرة . حدد 2 نقطة في الماء أو الهواء الرطب.
12. بالنسبة لمعايرة "الهواء" ، اغمس قطعة من الرغوة في الماء ، وضعها داخل الحجرة ، وانتظر حتى تستقر الإشارة (انظر صور معايرة الهواء قبل وبعد). عندما تكون مستقرة ، اضغط على "ضبط الهواء". انقر فوق الهواء > معايرة > ضبط الهواء.
13. اضبط معايرة 0٪ و 100٪ (الشكل 7D). قم بإزالة الحجرة من الغطاء وضعها في الغطاء التالي بحيث تكون إشارة معايرة الهواء جاهزة عند الانتهاء من معايرة 0٪ في المستشعر الأول. استخدم ماصة نقل واملأ الغطاء ب 2٪ كبريتيت الصوديوم. انتظر حتى تستقر الإشارة.
    ملاحظة: عادة ما تستغرق الإشارة وقتا أطول للاستقرار مقارنة بمعايرة الهواء. إذا ظهرت رسالة تحذير تفيد بأن "القيم خارج النطاق النموذجي" ، فتأكد من أن كبريتيت الصوديوم طازج. كرر نفس عملية المعايرة لجميع القنوات. تحضير كبريتيت الصوديوم بإضافة 2 غرام في 100 مل من الماء RO.
14. بمجرد اكتمال المعايرة ، اشطف غرف التنفس جيدا وجفف الغرف والأغطية. تأكد من عدم وجود ماء في فتحة الألياف البصرية.
15. ضع الكائن الحي (صغار المرجان المفردة ، في هذا المثال) داخل غرف التنفس وأغلقه بأغطية. عند وضع الأغطية ، تأكد من القيام بذلك عندما تكون الغرف مغمورة بالكامل ولا يوجد هواء بداخلها على الإطلاق.
16. ضع الغرف بإحكام في لوحة التحريك وقم بتوصيل الألياف البصرية.
17. قم بتشغيل مصدر الطاقة. تأكد من خلط الماء داخل الغرف تماما. اضبط درجة الحرارة في المبرد / السخان على درجات الحرارة التجريبية المختارة.
18. قم بتشغيل المضخة والسخان (الخطوتان 1.2 و 1.4).
19. اضغط على تسجيل الدخول على واجهة برنامج القياس O₂ لبدء التسجيل.

النتائج

معالجة البيانات وتحليلها
في حين أن هناك العديد من الطرق لمعالجة البيانات الأولية من تجارب قياس التنفس ، فمن المستحسن استخدام حزمة R respR²⁸. تمشيا مع مشاركة البروتوكولات المذكورة أعلاه ، والتي تدعو إلى العلم المفتوح والتكرار ، تسمح هذه الحزمة بمشاركة معالجة البيانات وتحليلها في شكل قابل للتكرار بسهولة وقد تم تصميمها مع وضع ذلك في الاعتبار. إنها منصة مجانية ومفتوحة المصدر ونظام مسبار محايد ، ويمكن تثبيتها بسهولة إما من CRAN أو GitHub. يتم الاحتفاظ بالتعليمات البرمجية الكاملة وأمثلة ل respR ويمكن العثور عليها في https://github.com/januarharianto/respR.

تحتوي حزمة respR على وظائف لاستيراد بيانات قياس التنفس وتصورها وتنفيذها لمراقبة الجودة ، وحساب معدلات التنفس إما تلقائيا أو من مناطق مختارة يدويا. يمكنه أيضا ضبط معدلات التنفس في الخلفية ومعدلات التحويل إلى وحدات الإخراج شائعة الاستخدام. فيما يلي تفاصيل خطوات معالجة البيانات من نظام قياس التنفس الدقيق. في هذه الدراسة ، تم استخدام البيانات من نظام قياس التنفس كمثال ، لكن الحزمة تقبل أيضا مدخلات من غالبية أنظمة مسبار الأكسجين المتاحة تجاريا بالإضافة إلى كائنات بيانات R العامة. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول الحزمة ، بما في ذلك الوثائق الكاملة والبرامج التعليمية ، على موقع الحزمة على https://januarharianto.github.io/respR/index.html.

استيراد البيانات الأولية
يتم استيراد ملف الإخراج الخام (.txt). يتعرف respR على التنسيق ويوزعه على إطار بيانات R عام يمكن استخدامه في الوظائف اللاحقة. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن هذا اختياري ؛ يمكن أيضا استيراد هذه الملفات وأي بيانات سلسلة زمنية للأكسجين تقريبا باستخدام الوظائف الأساسية (الواردة أدناه) من قبل أي شخص لديه معرفة أساسية ب R.

#load ريسبر
المكتبة (respR)

#Import ---
البيانات <- import_file("file.txt")
تم الكشف عن ملف #Firesting-Pryo

فحص وتصور البيانات
جزء حيوي من أي مهمة لتحليل البيانات هو رسم البيانات وفحصها للبحث عن الحالات الشاذة أو الأنماط الواضحة ، أو حتى للمساعدة في فهمها. يتم استخدام وظيفة الفحص هنا (الشكل 8 أ) ، والتي تتحقق من المشكلات الشائعة في بيانات قياس التنفس مثل القيم غير الرقمية أو المفقودة.

#inspect عمود أكسجين واحد
Insp <-inspect (البيانات ، الوقت = 3 ، الأكسجين = 8 ، العرض = 0.2)

ترسم هذه الوظيفة أيضا السلاسل الزمنية للأكسجين وتحسب معدل التدحرج (اللوحة السفلية) للمساعدة في توضيح كيفية تغير هذا المعدل على مدار التجربة. تساعد مخططات معدل التدحرج هذه في تحديد مناطق منحنيات الأسعار التي يجب استخراجها. في حالة معدلات الأيض القياسية أو الروتينية ، فإن المناطق المرغوبة هي تلك التي يظهر فيها المعدل الاستقرار (على سبيل المثال ، بعد حوالي النقطة الزمنية 3000 ؛ الشكل 8 ب).

هنا ، يصبح انخفاض الأكسجين قابلا للاكتشاف فقط بعد حوالي الصف 200 في لوحة السلاسل الزمنية الكاملة. أنماط مثل هذه شائعة جدا في بيانات قياس التنفس. غالبا ما تكون هناك فترة طويلة من عدم الاستقرار في بداية التجربة حيث يستقر النظام وتتأقلم العينة مع الظروف التجريبية. يوصى باستخراج المعدلات فقط من السلاسل الزمنية بعد عدم الاستقرار الأولي هذا ، مما يسلط الضوء أيضا على أهمية التصورات.

معدلات الاستخراج
ل respR وظيفتان لاستخراج معدلات التنفس. الأول هو الدالة calc_rate () ، والتي تسمح باستخراج المعدل يدويا عن طريق تحديد منطقة زمنية أو صف أو مستوى أكسجين. هذا شائع جدا في تحليلات قياس التنفس ، وطريقة مقبولة تماما لتحديد المعدل طالما يتم تحديد معايير الاختيار وتطبيقها باستمرار²⁸.

هناك طريقة أكثر قوة وموضوعية تتمثل في استخدام الدالة auto_rate () ، التي تحدد المناطق الخطية للبيانات. هذه المناطق هي تلك التي تتمتع بمعدلات تنفس مستدامة باستمرار ، ويتم تعيينها تلقائيا باستخدام التعلم الآلي. هذه الوظيفة مفيدة أيضا للكشف عن الإشارات المنخفضة (كما هو الحال في العينات المستخدمة في هذه الدراسة الحالية ، بسبب انخفاض الكتلة الحيوية في هذا العصر). تسمح هذه الوظيفة بتحديد المعدلات الأكثر خطية والحد الأدنى والحد الأقصى باستخدام طرق مستقلة وموضوعية وقوية إحصائيا²⁸. يحدد المثال هنا منطقة خطية تحدث من حوالي النقاط الزمنية 3,000 إلى 5,000. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن تحديد مناطق خطية متعددة ، ولكن هذا القسم هو المنطقة الأعلى مرتبة أو الأكثر خطية (الشكل 8C).

#Determine المعدل الأكثر خطية (أي متسقة)
معدل <-auto_rate (INSP)

تعديل الخلفية
يمكن تحديد معدلات الخلفية من تجارب التحكم بطريقة مماثلة للمثال أعلاه ، ويمكن استخدامها لضبط معدلات العينات باستخدام الدالة adjust_rate () (الشكل 9 أ ؛ لاحظ أن التحليل الكامل لا يظهر هنا ، فقط التعديل). يتم تفصيل الأمثلة الكاملة على موقع respR .

معدل #Adjust للخلفية
rate_adj <-adjust_rate (معدل ، بواسطة = bg) #saved كائن bg
طباعة(rate_adj)

تحويل الأسعار
الخطوة الأخيرة هي تحويل المعدلات إلى وحدات الإخراج المطلوبة ، باستخدام الوحدات الأصلية للبيانات الأولية ، والحجم الفعال لمقياس التنفس ، والبيانات التجريبية الأخرى ، بما في ذلك التطبيع إلى قياسات فارغة (الشكل 9 ب). يمكن أن يكون الناتج معدل تنفس مطلق ، أي للعينة بأكملها ، أو معدل خاص بالكتلة أو مساحة السطح. كان المعدل الخاص بمساحة السطح هو الناتج المستخدم هنا ، وهو على وجه التحديد المعدل المطلق مقسوما على مساحة سطح العينة (الشكل 9C).

كما نوقش أعلاه ، تم تطوير هذا النظام لقياس عينات صغيرة جدا. لذلك ، توقعنا قيما منخفضة وتداخلا محتملا مع القياسات الفارغة. من المتوقع وجود مستوى معين من الإشارة داخل الفراغات ، وعند فحصها ، تكون هذه القيم ضمن النطاق المتوقع للضوضاء التجريبية العامة ، ربما بسبب انحراف المسبار أو التغيرات الطفيفة في درجات الحرارة أو الفقاعات على المجسات. حسب التصميم وبسبب حجم العينة الصغير ، وبالتالي الحجم الفعال الصغير المستخدم ، فإن استخدام الفراغات مهم بشكل خاص هنا ، خاصة لكل تشغيل. تم تضمين القيم التمثيلية هنا كمثال (الشكل 10). نظرا لصغر حجم العينة ، نوصي باستخدام الفراغات في كل تشغيل لتوحيد القياسات لكل تشغيل.

ثم يتم استخدام هذه القيم الفارغة لتوحيد قيم قياسات العلاج. بالنظر إلى أن الشعاب المرجانية تتنفس بالإضافة إلى إنتاج الأكسجين ، يمكن أن يتراوح معدل الأيض من القيم السلبية إلى الإيجابية. فيما يلي مثال على النتائج التمثيلية لمدى قيم التنفس المكتشفة من أداة التنفس الدقيق. تم تحديد هذه النتائج من تجربة ناجحة على صغار المرجان الفردية (الشكل 10). وعموما، كان من المتوقع أن يكون من الصعب اكتشاف التنفس في مجموعة البيانات النموذجية هذه (حسب التصميم)، نظرا لصغر حجم العينات؛ هذا يؤكد قيمة هذه الطريقة في التقاط عتبة الإشارة المنخفضة هذه. تظهر هذه النتائج التمثيلية التنفس في الظلام عند أصغر أحجام العينات التي تم اختبارها ، مما يؤكد الحد الأدنى من عتبة الكشف لهذا النظام. قمنا أيضا بالقياس في ظل شرطين (التحكم والإجهاد في درجات الحرارة العالية). بعد التوحيد القياسي للفراغات المقاسة لكل تشغيل ، تراوحت القيم من قريبة من الصفر (التحكم) إلى متوسط ~ -^5e-5 لعلاج الإجهاد. كما هو متوقع، كان التنفس منخفضا. تظهر هذه النتائج بوضوح قيما تمثيلية للفراغات ، بالإضافة إلى مقارنة درجة حرارة التحكم مقابل درجات الحرارة المرتفعة لهذه العينات الصغيرة جدا.

الشكل 1: تمثيل تخطيطي لأداة قياس التنفس الدقيقة الجديدة للتوصيف الفسيولوجي للهولوبيونت المرجاني (المرجان + المتعايشات) أو أي كائن صغير (<1 مم). تم صنع غرف قياس التنفس المخصصة (رقم 1 ؛ 1.1-1.6). وتشمل هذه الأغطية (1.1) مع بقع استشعار الأكسجين (1.2) ، ويتم وضع الحدث الفردي (1.3) على حامل تدفق (1.4) مثبت فوق محرك مغناطيسي (1.5) ، وكلها تتناسب مع الغرفة الزجاجية (1.6). يتم توصيل وحدة التحكم (2) بالبقعة باستخدام كبل ألياف بصرية يتناسب مع الغطاء (1) ومتصل بالكمبيوتر (3). يتصل السخان / المبرد (4) بلوحة قياس التنفس (5) بالمياه المتدفقة (المشار إليها بأسهم شيفرون للاتجاه) ، والتي تقع أعلى لوحة النمام (6) مع التروس (7) ، مدعومة بالمحرك (8) ومصدر الطاقة (9). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: إعداد قياس التنفس الدقيق. تتوفر خيارات متعددة ، بما في ذلك (أ) لوحة واحدة لقياس التنفس ، أو (ب) متصلة بألواح متعددة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: لوحة تحريك مغناطيسية مبنية حسب الطلب أعلى لوحة قياس التنفس. تحتوي كل غرفة على (A) ترس تحريك مغناطيسي تحتها ، (B) مدعوم بمحرك ، مع (C) لوحة قياس التنفس متصلة بواسطة أنبوب بالسخان / المبرد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: إعداد غرفة قياس التنفس المخصصة. (أ) المكونات (من اليسار إلى اليمين: غطاء ، قارورة زجاجية ، حامل ، أنبوب 1.5 مل للمقياس ، وقضيب حرارة). (ب) حامل التدفق الفردي الذي توجد العينة بداخله. ( ج) منظر من أعلى إلى أسفل لحامل الانسياب. (D) مع وضع الحامل داخل القارورة الزجاجية مع تثبيت الغطاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: قوارير زجاجية موضوعة داخل لوحة النمام. (أ) لوحة تحريك مبنية حسب الطلب مع (ب) لقطة مقربة للقارورة الزجاجية الكاملة مع إعداد الغطاء. يمكن رؤية المرجان اليافع من خلال الغطاء هنا (نقطة بنية) ، أعلى ربطة العنق ، مع وضع الألياف البصرية في فتحة الغطاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: غرف موضوعة رأسا على عقب ، جاهزة للمعايرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: الخطوات الرئيسية في برنامج قياس الأكسجين. ( أ) تحقق من إشارة كل مستشعر. تظهر الإشارة المثلى لهذه الدراسة وأجهزة الاستشعار في بقعة مستشعر الأكسجين FTC (النطاق الطبيعي). (ب) تحقق من انحراف الإشارة. (ج) ضبط درجات حرارة المعالجة والتحقق منها. (د) اضبط وتحقق من معايرة 0٪ و 100٪. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: خطوات إخراج تحليل respR I. (A) افحص الأمر والمخرجات. (ب) تحقق من استقرار السعر. ج: تحديد المعدل الخطي الأكثر خطية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9: خطوات إخراج تحليل respR II. (أ) اضبط معدل الخلفية ، (ب) التحويل و (ج) تحقق من الأسعار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 10: النتائج التمثيلية الناتجة عن أداة قياس التنفس الدقيق. متوسط التنفس (O₂ ± خطأ قياسي) لتكرار الأحداث المرجانية الفردية ، بما في ذلك القيم الفارغة وكذلك تنفس الأفراد تحت السيطرة وظروف الإجهاد بدرجة حرارة عالية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: منظر من أعلى إلى أسفل لغرفة قياس التنفس مع المرجان اليافع بالداخل أثناء جلسة القياس. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الجدول 1: تقديرات تكلفة مكونات جهاز قياس التنفس. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

يحدد هذا العمل بناء إعداد قياس التنفس الدقيق المصنوع خصيصا والذي يمكن استخدامه لتحديد كمية الأكسجين التي تستهلكها وتنتجها الكائنات المائية الصغيرة اللاطئة. تشمل المكونات الحاسمة لهذا البروتوكول إعداد الغرف ، بما في ذلك البقع ، ومعايرة الإشارة المنخفضة باستخدام حزمة respR ، حيث يمكن تعريف الإشارة المنخفضة على أنها معدلات تتميز بالمنحدرات الضحلة أو الصاخبة. تسمح الغرفة المخصصة وإعدادها باكتشاف الإشارات المنخفضة ، بينما يساعد استخدام حزمة R على الحماية من المشكلات التي قد يؤدي فيها حدوث منحدرات ضحلة أو صاخبة إلى سوء تفسير النتائج (على سبيل المثال ، الإيجابيات الخاطئة).

وتشمل التعديلات المحتملة التي ستكون مطلوبة للمستخدمين الآخرين تأمين الكائن محل الاهتمام داخل الغرفة المخصصة. في هذه الحالة ، تم استخدام ربطة عنق صغيرة صلبة وغراء حوض السمك لتأمين الحدث الفردي إلى القاعدة البلاستيكية ، والتي تم لصقها بعد ذلك على ربطة العنق. وتجدر الإشارة إلى أنه في هذه التجربة ، استقرت الأحداث المرجانية على أغطية بلاستيكية سوداء. سمح هذا البلاستيك بإزالة الأحداث المرجانية بسهولة ، والتي انزلقت بشكل فعال من البلاستيك ، حتى لا تؤذيهم جسديا أثناء الإزالة. تلتصق الأحداث المرجانية بالركيزة التي تستقر عليها ، لذلك يوصى بتثبيتها على مادة بلاستيكية مماثلة ، باستخدام الببتيد الاصطناعي¹⁶ لتسهيل إزالتها لعملية اللصق. لتقليل إجهاد المناولة والتأثير على استجابة التنفس ، يوصى بالسماح للشعاب المرجانية المثبتة على الروابط المضغوطة بالتأقلم لمدة 1-2 أسابيع ، كما هو شائع في العديد من تجارب الإجهاد المرجاني للبالغين. قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات أخرى لتأمين الكائن الحي فوق البقعة في الغطاء والسماح بتدوير المياه. تتضمن خطوة استكشاف الأخطاء وإصلاحها الرئيسية الأخرى اكتشاف الإشارة ، وتحديدا على منحدر السلسلة الزمنية للأكسجين حيث يجب تحديد المعدلات. في النهاية ، يعود هذا إلى مزيج من استخدام الحكم الجيد لاستبعاد البيانات غير المستقرة بشكل واضح ، والوظائف داخل respR للسماح باستخراج المعدلات إما من المناطق المختارة باستمرار أو تلقائيا عن طريق تحديد المناطق الخطية للبيانات. تتوفر أمثلة أخرى حول كيفية القيام بذلك على موقع respR .

تم تطوير هذه الطريقة لتوسيع قياسات الحد الأدنى للتنفس لتشمل اللافقاريات البحرية الصغيرة للغاية. القيد الواضح هو أن هذا البروتوكول قد يكون أكثر عرضة للإيجابيات الكاذبة مقارنة بالبروتوكولات المصممة للكتل الحيوية الأكبر. ومع ذلك ، نظرا لأن هذا كان الهدف من التصميم - لقياس هذه الحدود الدنيا - فقد تم أخذ ذلك في الاعتبار في التصميم ، ويمكن استخدام الإجراء مع حزمة respR للحماية بشكل أفضل من الإيجابيات الخاطئة. من المهم أيضا الاعتراف بوجود أنظمة أخرى لقياس التنفس³⁰ ، وقياس الكائنات الحية الصغيرة ، بما في ذلك قياس التنفس على مجدافيات الأرجل^{الفردية 31} بأحجام أصغر من هذا (~ 0.5-1 مل) ، ولكنها إما باهظة الثمن أو تفتقر إلى مكونات محددة (القدرة على التحريك). ومع ذلك ، فإن هذا النظام مفتوح المصدر ومنخفض التكلفة نسبيا مقارنة بالأنظمة التجارية (على سبيل المثال ، نظام Core Microplate). يتضمن هذا النظام أيضا اعتبارات منهجية رئيسية مثل التحريك ، والتي قد تفتقر إليها الأنظمة الأخرى. تعد ميزة قضيب التحريك الداخلي ضرورية لتكرار خلط الماء الطبيعي للعديد من الكائنات البحرية (على سبيل المثال ، مجدافيات الأرجل عن طريق السباحة) ، وهذا غالبا ما يكون غير ممكن وقد يجعل البيانات غير صالحة للاستعمال إلى حد كبير. في المقابل ، تتضمن طرق الخلط الأخرى المتاحة وضع مقياس التنفس بالكامل على مقعد هزاز عملاق ، الأمر الذي يتطلب معدات إضافية وله نجاح محدود في الخلط ، أو الخلط عن طريق الاهتزاز ، مما قد يسبب اضطرابا للكائن الحي. لهذا السبب ، هذا هو النظام الوحيد الذي يمكنه إجراء قياس التنفس على الشعاب المرجانية اليافعة أو غيرها من الكائنات الحية الصغيرة جدا. كمرجع ، تراوح نطاق حجم العينات المدرجة هنا من 2.1 إلى 3.6 ورم حميدة (المقابلة لبضعة أشهر فقط) ، مع مساحة دنيا إلى قصوى متوسطة من 1.3 إلى 4.5 مم².

قياس التنفس هو إجراء أساسي في الدراسات البيئية ، وتوجد العديد من الطرق لهذا الغرض. ومع ذلك ، فإن معظم هذه الطرق الحالية تستهدف عينات الكتلة الحيوية العالية ، بما في ذلك الأسماك الكاملة أو شظايا المرجان أو الأعشاب البحرية^32،33،34. هذه الطريقة هي الأولى التي تستخدم الأحداث المرجانية الفردية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من التطبيقات المحتملة لهذه الطريقة ، لأنها توفر معلومات فسيولوجية أساسية حول عمل الكائن الحي. يمكن أن يكون هذا مهما للدراسات التي تتطلع إلى توصيف التقديرات الصحية الأساسية³⁵ ، وفهم دور الإجهاد الحاد أو طويل الأجل أثناء تطور الشعاب المرجانية مثل الإجهاد الحراري³⁶ ، أو لتوفير عتبات يمكن للمديرين تعيينها للمساعدة في حماية وتحسين صحة الشعاب المرجانية³⁷. بالنظر إلى أن المرجان هو holobiont والمجتمع المتكافل مرن نسبيا في هذه المرحلة وطوال السنة الأولى من الحياة³⁸ ، سيكون من المثير للاهتمام إقران بيانات قياس التنفس مع التغيرات في المجتمعات بمرور الوقت ، لوضع سياق كامل لعمل الكائن الحي ككل. الأهم من ذلك ، تساهم هذه الطريقة في تقنيات "العلوم المفتوحة" التي تساعد على توفير مخطط لإنشاء إعدادات تجريبية مخصصة يمكن مشاركتها وتحسينها وتوحيدها بشكل مفتوح.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Cost
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers	LabGlass Party Ldt.	1.5 ml	$407.26
1.1 lids	AIMS workshop	Vial GL25 thread	~$10
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes)	PyroScience	Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947	$41.25 AUD each
1.3 individual organism	NA	NA	NA
1.4 flow-through stand	AIMS workshop	Custom	included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through
1.5 magnetic stirrer	Any manufactuer is suitable	NA	~$2?
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD)	Labglass Pty Ltd, Stafford QLD	Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole	$50.9 AUD
2 FireSting controller (2)	PyroSciences	NA	4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here.
3 computer	NA	NA	NA
4 heater/chiller	VWR International	NA	Small models around $4,000 AUD
5 respirometry plate platform	AIMS workshop	34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers)	$1250 AUD
6 stirrer plate with gears (7)	AIMS workshop	34 cm x 26 cm x 3 cm	$1250 AUD
8 powered by the motor	AIMS workshop	Custom	$700 AUD
9 power supply	Non-specific	NA	~$300 AUD
Aquarium glue	Seachem reef glue	20g	$14
Oxygen Logger Software	PyroScience	NA	NA
Polypipe and connectors	John Guest	NA	$20
Sodium Sulfite	Sigma	S0505-250G (CAS number 7757-83-7)	$54