Caracterización fisiológica del holobionte de coral mediante una nueva herramienta de microrrespirometría

Resumen

Este protocolo describe la configuración y el funcionamiento de un sistema de microrrespirometría que puede emplearse para investigar las características fisiológicas del holobionte de coral.

Resumen

La actividad metabólica, definida como la suma de los procesos del organismo que involucran energía, es de importancia crítica para comprender la función y la evolución de la vida en la Tierra. La medición de las tasas metabólicas de los organismos está, por lo tanto, en el centro de la explicación de los estados fisiológicos de los organismos, sus funciones ecológicas y el impacto del cambio ambiental en las especies dentro de los ecosistemas terrestres y acuáticos. En los arrecifes de coral, se han utilizado medidas del metabolismo para cuantificar el funcionamiento de la simbiosis entre los corales y sus simbiontes de algas obligadas (Symbiodiniaceae), así como para evaluar cómo los factores de estrés ambiental, incluido el cambio climático, afectarán la salud de los corales. A pesar de esta importancia, hay una falta de métodos, y por lo tanto de datos, relacionados con las mediciones de la tasa metabólica en la descendencia de corales, probablemente debido a su pequeño tamaño. Para abordar esta brecha, este estudio tuvo como objetivo desarrollar una configuración personalizada para medir la respiración de ecologías de animales marinos pequeños (rango de tamaño milimétrico). Este bajo costo y fácil configuración debería permitir una mejor medición de la tasa metabólica. Esto será esencial para la investigación ecológica aplicada que utiliza la producción sexual de corales para la restauración de arrecifes.

Introducción

La respiración es una medida biológica crítica que señala la actividad metabólica general de un organismo, pero al igual que otros rasgos críticos (crecimiento), es^{difícil de medir} en organismos pequeños. La respiración se puede definir como la oxidación de moléculas orgánicas mediante el uso de oxígeno. Este proceso genera la energía química necesaria para la función celular (es decir, el metabolismo), que es esencial para la supervivencia de los organismos. Alternativamente, el metabolismo anaeróbico da como resultado una deuda de oxígeno². Las tasas de respiración se pueden determinar utilizando optodos que miden el uso (y, por lo tanto, la disminución) de la concentración de oxígeno a lo largo del tiempo en una cámara cerrada, una práctica generalmente conocida como respirometría^. Dado que la mayoría de los organismos no almacenan oxígeno, la tasa de metabolismo se puede inferir a través de la correlación directa entre la respiración y el uso de carbono. Debido a esto, las tasas de respiración se pueden convertir en el uso diario de carbono, que informa funciones metabólicas críticas como el crecimiento, la reproducción y la capacidad de mantener la homeostasis metabólica durante tiempos de estrés ambiental ^4,5, incluidas las condiciones de ola de calor que generalmente conducen al estrés o al blanqueamiento de los corales.

Los arrecifes de coral están disminuyendo a un ritmo acelerado en todo el mundo. El animal de coral alberga un consorcio de socios (que incluye dinoflagelados Symbiodiniaceae, hongos, bacterias y virus), conocidos colectivamente como el "holobionte"⁶. A medida que aumentan las temperaturas de los océanos, los corales y, por lo tanto, los arrecifes de coral, están bajo una presión cada vez mayor para sobrevivir, ya que las altas temperaturas conducen a la pérdida de los dinoflagelados Symbiodiniaceae (en adelante simbiontes), un fenómeno conocido como blanqueamiento⁷. Muchos nutrientes no están disponibles para los corales en aguas tropicales oligotróficas, incluido el nitrógeno inorgánico y el fósforo⁸. Para hacer frente a la situación, los corales forman una simbiosis nutricional obligada con sus simbiontes dinoflagelados (Symbiodiniaceae), que proporcionan la mayoría de los nutrientes que necesita el coral huésped para sobrevivir y depositar sus esqueletos de carbonato de calcio⁹. Una simbiosis funcional puede caracterizarse por altos niveles de intercambio de carbono entre los miembros de la pareja^10,11, y la regulación de la simbiosis implica una homeostasis dinámica¹².

Durante el estrés térmico, esta regulación dinámica y la comunicación se interrumpen, lo que resulta en disbiosis y blanqueamiento (revisado en la referencia¹³). Por lo tanto, las mediciones metabólicas, como la fotosíntesis y la respiración, tienen el potencial de dilucidar tanto los estados disbióticos sanos como los no regulados de los corales, y medir con precisión estos procesos a través de la ontogenia es fundamental para comprender el funcionamiento del organismo. Esto es particularmente importante a medida que aumenta la frecuencia y la magnitud de los eventos de blanqueamiento masivo, con el potencial de influir en los cambios en el intercambio de nutrientes de los simbiontes, donde se ha encontrado que la transferencia de carbono disminuye a medida^{que aumentan las} temperaturas. Esto podría deberse a mecanismos dirigidos por el simbionte que secuestra nutrientes o a compensaciones fisiológicas duras (aumento de la tolerancia térmica pero disminución de la supervivencia del huésped 15,16,17). Las alteraciones en la simbiosis pueden provenir tanto del simbionte como del huésped, aunque un factor principal es probablemente el mal funcionamiento celular del simbionte¹⁸. Sin embargo, el estrés causado por el aumento de la temperatura del agua de mar desestabiliza esta simbiosis; El intercambio de carbono del simbionte al huésped disminuye ^19,20 y puede sobrevenir la inanición del coral. Esto puede reflejarse en la disminución de las reservas de lípidos y carbohidratos en los corales debido al aumento del uso del huésped ("aumento del catabolismo del carbono fijo"), probablemente debido a la disminución de la participación de los simbiontes¹¹. Junto con la contribución de la fotosíntesis y la respiración de los simbiontes de los corales, la respiración del animal coralino es una medida importante para comprender la salud de los corales, los impactos del blanqueamiento y el intercambio de nutrientes entre estos socios, y el crecimiento del holobionte, un fenotipo relevante para sobrevivir al cambio ambiental ^8,21,22. Finalmente, dado que muchos corales son simbióticos, el uso de la respirometría para caracterizar la fotosíntesis además de la respiración es particularmente útil para contextualizar las relaciones P:R y comprender si la simbiosis es estable o no (por ejemplo, referencia²³).

Los cambios ambientales, por lo tanto, causan cambios en los presupuestos energéticos del coral y sus simbiontes, lo que lleva a diferencias en el crecimiento¹⁴. Para hacer frente a la situación, el coral huésped puede aumentar la respiración y el uso de lípidos para satisfacer sus demandas metabólicas; El estrés térmico puede reducir la productividad neta en un 60% debido a este aumento de la respiración¹⁴, medido por un cambio en el oxígeno disuelto. Las simbiodiáceas también pueden aumentar la asimilación de nitrógeno y la retención de carbono^14,24, y luego utilizar estas reservas para cambiar la energía hacia sus propios mecanismos de reparación y protección^25,26. El equilibrio de N y C es importante para regular el crecimiento, y P en particular²⁷, que puede manifestarse como una regulación dinámica de la abundancia de simbiontes. De hecho, la evidencia recolectada de corales a lo largo de grandes extensiones de arrecifes (>1.000 km) sugiere que los huéspedes tienen la capacidad de limitar el crecimiento de simbiontes a través de la regulación de P, aunque esto varía según la especie de coral²⁷.

En conjunto, estos estudios sugieren una ganancia de tolerancia al calor con una disminución concomitante en la producción o translocación de nutrientes (es decir, la propensión a la simbiosis) debido a los cambios ambientales. Por lo tanto, se deben utilizar métodos potentes de un solo juvenil, como la cuantificación del uso de oxígeno a través de la microrrespirometría, para comprender los mecanismos fundamentales relacionados con el metabolismo y luego aplicarlos a cuestiones de conservación, como la comprensión de la adquisición de tolerancia al calor. Se presenta aquí como una herramienta de microrrespirometría para medidas fisiológicas, destinada a indagar la relación nutricional entre los juveniles de coral y sus simbiontes algas, pero adecuada para otros pequeños organismos marinos.

El uso o la producción de oxígeno por parte de los organismos puede medirse colocándolos en cámaras de respirometría individuales herméticamente cerradas o «respirómetros» (en lo sucesivo, «cámaras»), donde el cambio de oxígeno se mide mediante optodios³. Los optódes son sondas que miden la concentración de oxígeno mediante pulsos de luz, y el registro de las mediciones a lo largo del tiempo permite calcular las tasas de respiración y/o fotosíntesis. En la práctica, la medición de la respiración es similar a la medición de la fotosíntesis en los corales, excepto que los corales se incuban en total oscuridad. Al restar la respiración diaria total del coral y los simbiontes de la fotosíntesis diaria total, se obtiene un diferencial de oxígeno (delta de oxígeno)^2,3. Generalmente, los organismos utilizan más oxígeno del que producen, lo que resulta en un déficit. Esto se puede convertir en equivalentes de carbono, ya que el oxígeno y el carbono se consumen en una proporción fija². El excedente de carbono puede ser utilizado por el coral para el crecimiento, la síntesis y reproducción de moco y otras necesidades metabólicas esenciales¹².

Este protocolo describe un método de micro-respiración (Figura 1) que se empleó para medir las tasas de respiración (R) para juveniles de coral individuales utilizando un diseño de cámara de vidrio de 1,5 mL hecho a medida (vial con rosca GL25 y 20 mm de altura, con protuberancia/cresta, borde de suelo plano y tapón de rosca con orificio; ver Tabla de Materiales) lleno de agua de mar filtrada de 0,5 μm. Se insertaron ópdos de fibra óptica (ver Tabla de Materiales) en cada cámara a través de un orificio en el costado de la tapa. Cada coral individual se fijó sobre una plataforma de placa agitadora de flujo continuo de malla dura sobre una barra de agitación magnética para garantizar una mezcla adecuada de agua dentro de la cámara. En el ejemplo representativo aquí, se midieron dos controles o "espacios en blanco" (cámaras que eran idénticas excepto por la presencia de la muestra) simultáneamente a las tres cámaras de muestras replicadas, ya que teníamos varios controladores funcionando simultáneamente. Sin embargo, el ejemplo de configuración (Figura 2) solo muestra el uso de cuatro canales; Esto se puede aumentar utilizando múltiples controladores y múltiples soportes de flujo continuo. La temperatura también se puede controlar en este sistema sumergiendo cada cámara en un baño de agua hecho a medida con temperaturas de agua preestablecidas (27 °C para el control o 31 °C para el estrés por alta temperatura en los datos de ejemplo aquí) utilizando un sistema de flujo continuo y suave establecido en 75 L/h). La plataforma de la placa agitadora y la placa agitadora con engranajes pueden ser de cualquier tamaño y pueden hacerse tan grandes o tan pequeñas como sea necesario para acomodar el número de cámaras de vidrio. En este ejemplo, la plataforma y la placa eran de unos 34 cm x 26 cm x 3 cm (Tabla de materiales). La calibración de los optódosos se realizó antes de cada corrida utilizando dos soluciones estándar que representan una saturación de oxígeno del 0% y del 100% a la temperatura y salinidad del agua apropiadas para este entorno experimental.

Protocolo

1. Instalación de equipos y corales dentro de las cámaras de respiración

NOTA: Los corales listos para la reproducción (es decir, aquellos que tenían haces de óvulos/espermatozoides pigmentados de color rosado visibles en las ramitas fragmentadas de las colonias de la especie Acropora tenuis ) fueron desalojados del arrecife en Magnetic Island (19° 6.249'S; 146° 51.728'E) el día de una luna llena en octubre de 2018 (número de permiso: G12 / 35236.1), recolectados y llevados al laboratorio para el desove de corales, donde se criaron y crecieron corales juveniles.

1. El día de las mediciones, conecte las dos placas del baño de agua con un tubo de polietileno azul y conectores (consulte la Tabla de materiales; Figura 1 [5], Figura 2A,B). Estos servirán como incubadoras después de la conexión con el tubo de polietileno azul al calentador de agua/enfriador. Asegúrese de que la placa del motor se pueda ver claramente a través de las placas transparentes del baño de agua cuando las cámaras de respirometría no estén en su lugar.
2. Conecte las dos mangueras al calentador de agua/enfriador (consulte la Tabla de materiales). Encienda el calentador de agua/enfriador y luego ajuste la temperatura experimental deseada (27 °C o 31 °C).
3. Conecte la base del baño de agua (paso 1.1) a la placa base del motor con los engranajes magnéticos (Figura 1 [6, 7] y Figura 3A) y, a continuación, conecte este conjunto a una fuente de alimentación (Figura 3B). Encienda la fuente de alimentación para activar los engranajes, que activarán las barras agitadoras en las cámaras.
4. Module el flujo de agua según sea necesario (por ejemplo, flujo continuo y suave ajustado a 75 L/h con agitación lenta a 30 rpm) utilizando las perillas de los conectores de la válvula (Figura 3C).
5. Para ensamblar la cámara de respirometría, agregue el cordón magnético (Figura 1 [1.5]) a la cámara de vidrio (Figura 1 [1.6]), y luego la base del soporte de flujo de plástico opaco (Figura 1 [1.4]) en la cámara de vidrio (Figura 4A). El tamaño de la cámara y la perla magnética dependerán del organismo y del sistema de estudio de interés.
   NOTA: Hay orificios en la base de plástico para permitir el flujo y la circulación del agua del movimiento de la cuenta magnética en la parte inferior.
6. Pegue el coral con pegamento para acuarios (ver Tabla de materiales) a la brida negra colocada en la base de plástico (Figura 4B-D). Para hacer esto, primero, pegue el coral juvenil a un trozo de plástico negro y luego pegue este trozo a la base de plástico. Una vez que el coral esté bien colocado (el curado del pegamento es casi instantáneo), atornille la tapa con la junta tórica (Figura 4A) en la cámara de vidrio. Realice estas acciones bajo el agua en un recipiente separado para asegurarse de que no haya aire dentro de la cámara de respirometría.
   NOTA: El volumen de agua en el respirómetro (es decir, volumen efectivo = 1,5 ml) se determinó mediante la inmersión completa de la cámara bajo el agua. La suposición es que, en relación con el volumen de agua, el desplazamiento de la masa/densidad del coral muy pequeño es insignificante. Aquí se muestra el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para la escala (Figura 4A).
7. Coloque firmemente las cámaras en los baños de agua (Figura 5A). Asegúrese de que las cámaras de vidrio estén en contacto con el agua a temperatura controlada para el experimento.
8. Conecte los cables de fibra óptica de O₂ (consulte la Tabla de materiales) de modo que estén en contacto con los puntos del sensor de oxígeno (en lo sucesivo, puntos; consulte la Tabla de materiales) insertándolos en el orificio perforado en el costado de las cámaras de la tapa. Estos pequeños puntos son sensibles al oxígeno y detectarán y transmitirán la señal desde el interior de la cámara a través del cable de fibra óptica.
   1. Agregue cinta de plomería (cinta blanca delgada autosellante) para que el cable encaje perfectamente y para que permanezca firmemente dentro de la cámara de agua. Asegúrese de que el coral individual se pueda ver (como se ve en la Figura 5B), con los tentáculos marrones hacia arriba, dentro de la cámara (Figura 5B, Video 1).
      NOTA: Las estimaciones de costos de los componentes del aparato se proporcionan en la Tabla 1.

2. Procedimiento normalizado de funcionamiento para medir la respiración mediante el sistema de_O2

1. Abra el software de medición de oxígeno (consulte la tabla de materiales).
2. Mida la temperatura de la habitación donde se realizará la calibración. Esto será necesario más adelante para la etapa de calibración (paso 2.8).
3. Ensamble los sensores ópticos y las tapas. Para ello, conecte toda la fibra óptica al puerto correspondiente del módulo O₂ . Asegúrese de hacer coincidir la tapa 1 con el sensor 1, la tapa 2 con el sensor 2, y así sucesivamente.
4. Para configurar las cámaras para la calibración, primero humedezca un trozo de esponja limpia con un poco de agua de ósmosis inversa (RO) e insértelo en cada cámara.
   NOTA: La esponja no debe gotear, solo estar húmeda. Puede gotear en el punto de fibra óptica. Asegúrese de que la mancha no esté mojada antes de continuar con el siguiente paso.
5. Coloque las cámaras boca abajo con la fibra óptica correspondiente (Figura 6). Esto permitirá desenroscar la cámara sin tocar la fibra óptica y añadir el sulfito de sodio para la calibración al 0%.
6. Compruebe la señal de cada sensor antes del inicio de la calibración. Revise todas las pestañas de la interfaz del software y verifique el valor de la señal (esquina superior izquierda) (Figura 7A), asegurándose de que no varíen significativamente. Consulte el manual de O₂ para conocer los valores aceptables para la configuración experimental (según el organismo y las condiciones de interés). Para esta configuración específica, a una temperatura ambiente de 25,3 °C, es aceptable un FTC (flujo puntual del sensor de oxígeno a través del rango normal de la celda) de 20,59 con la señal a 179,5.
7. Abra el programa y verifique la configuración en el software para confirmar que es correcta como se describe a continuación. Si la ventana emergente no aparece inmediatamente después de abrir el programa, esto se puede hacer haciendo clic en el botón Configuración en la esquina inferior izquierda de la interfaz del software.
8. Compruebe que el sensor de temperatura externo esté activado (Figura 7B). Cambie la configuración a Temperatura fija (Figura 7C). A continuación, agregue el valor de temperatura ambiente y haga clic en copiar configuración a todos los demás canales.
9. Cambie la configuración a Reducir la deriva de la señal (Figura 7C). A continuación, seleccione Configuración del sensor y seleccione el nivel 2. De lo contrario, si se utilizan volúmenes pequeños, la deriva será tan alta que será difícil de calibrar.
10. Compruebe la configuración general de los canales. Presione Ok si es adecuado. Haga clic en copiar la configuración en todos los canales y, a continuación, haga clic en Aceptar.
11. Calibra los sensores. Para la calibración del canal 1, vaya a la pestaña Canal 1 y presione el botón Calibrar . Seleccione 2 puntos en agua o aire húmedo.
12. Para la calibración del "aire", sumerja un trozo de espuma en agua, colóquelo dentro de la cámara y espere a que la señal se estabilice (vea las imágenes de calibración de aire antes y después). Cuando esté estable, presione "set air". Haga clic en aire > Calibrar > establecer aire.
13. Ajuste la calibración del 0 % y del 100 % (Figura 7D). Retire la cámara de la tapa y colóquela en la siguiente tapa para que la señal de calibración de aire esté lista cuando finalice la calibración al 0% en el primer sensor. Utilice una pipeta de transferencia y llene el tapón con sulfito de sodio al 2%. Espere a que la señal se estabilice.
    NOTA: La señal suele tardar más tiempo en estabilizarse en comparación con la calibración del aire. Si aparece un mensaje de advertencia que dice que los "valores están fuera del rango típico", asegúrese de que el sulfito de sodio esté fresco. Repita el mismo proceso de calibración para todos los canales. Prepare el sulfito de sodio agregando 2 g en 100 ml de agua de ósmosis inversa.
14. Una vez completada la calibración, enjuague bien las cámaras de respiración y seque las cámaras y los tapones. Asegúrese de que no haya agua en el orificio de fibra óptica.
15. Coloque el organismo (juveniles de coral individuales, en este ejemplo) dentro de las cámaras de respiración y cierre con tapas. Al colocar las tapas, asegúrese de hacerlo cuando las cámaras estén completamente sumergidas y no haya absolutamente nada de aire en el interior.
16. Coloque las cámaras firmemente en la placa de agitación y conecte la fibra óptica.
17. Encienda la fuente de alimentación. Asegúrese de que el agua dentro de las cámaras se mezcle por completo. Ajuste la temperatura en el enfriador/calentador a las temperaturas experimentales elegidas.
18. Encienda la bomba y el calentador (pasos 1.2 y 1.4).
19. Presione log en la interfaz del software de medición de O₂ para comenzar a grabar.

Resultados

Procesamiento y análisis de datos
Si bien existen numerosos métodos para procesar los datos sin procesar de los experimentos de respirometría, se recomienda utilizar el paquete R respR²⁸. De acuerdo con el intercambio de los protocolos anteriores, que abogan por la ciencia abierta y la reproducibilidad, este paquete permite que el procesamiento y el análisis de datos se compartan de una forma fácilmente reproducible y ha sido diseñado con eso en mente. Es una plataforma gratuita, de código abierto e independiente del sistema de sondas, y se puede instalar fácilmente desde CRAN o GitHub. El código completo y los ejemplos de respR se mantienen y se pueden encontrar en https://github.com/januarharianto/respR.

El paquete respR tiene funciones para importar, visualizar y realizar el control de calidad de los datos de la respirometría, y para calcular las tasas de respiración, ya sea automáticamente o a partir de regiones elegidas manualmente. También puede ajustar las tasas de respiración de fondo y las tasas de conversión a unidades de salida de uso común. A continuación se detallan los pasos para procesar los datos del sistema de microrrespirometría. En este estudio, se utilizaron como ejemplo los datos del sistema de respirometría, pero el paquete también acepta entradas de la mayoría de los sistemas de sondas de oxígeno disponibles en el mercado, así como objetos de datos R genéricos. Se pueden encontrar más detalles sobre el paquete, incluida la documentación completa y los tutoriales, en el sitio web del paquete en https://januarharianto.github.io/respR/index.html.

Importación de datos sin procesar
Se importa el archivo de salida sin procesar (.txt). respR reconoce el formato y lo analiza en una trama de datos de R genérica que se puede utilizar en funciones posteriores. Sin embargo, es importante tener en cuenta que esto es opcional; estos archivos y prácticamente cualquier dato de series temporales de oxígeno también pueden ser importados utilizando funciones base (que se dan a continuación) por cualquier persona con un conocimiento básico de R.

#load respR
Biblioteca(respR)

#Import ---
Datos <- import_file("file.txt")
Archivo #Firesting-Pryo detectado

Inspección y visualización de los datos
Una parte vital de cualquier tarea de análisis de datos es trazar e inspeccionar los datos para buscar anomalías o patrones obvios, o incluso simplemente ayudar a comprenderlos. Aquí se utiliza la función de inspección (Figura 8A), que comprueba si hay problemas comunes a los datos de la respirometría, como valores no numéricos o faltantes.

#inspect una sola columna de oxígeno
Insp <-inspect(datos, tiempo = 3, oxígeno = 8, ancho = 0,2)

Esta función también traza la serie temporal de oxígeno y calcula una velocidad de rodadura (panel inferior) para ayudar a dilucidar cómo puede cambiar esta tasa en el transcurso del experimento. Estos gráficos de velocidad móvil ayudan a informar sobre qué regiones de esas curvas de velocidad deben extraerse. En el caso de las tasas metabólicas estándar o rutinarias, las regiones deseadas son aquellas en las que la tasa muestra estabilidad (por ejemplo, después de alrededor del punto de tiempo 3.000; Figura 8B).

Aquí, la disminución del oxígeno solo se vuelve detectable después de alrededor de la fila 200 en el panel de series temporales completas. Patrones como este son muy comunes en los datos de la respirometría; A menudo hay un período prolongado de inestabilidad al comienzo de un experimento a medida que el sistema se estabiliza y el espécimen se aclimata a las condiciones experimentales. Se recomienda que las tasas solo se extraigan de las series temporales después de esta inestabilidad inicial, lo que también pone de manifiesto la importancia de las visualizaciones.

Tasas de extracción
respR tiene dos funciones para extraer la frecuencia respiratoria. La primera es la función calc_rate(), que permite extraer una tasa manualmente especificando una región de tiempo, fila o nivel de oxígeno. Esto es muy común en los análisis de respirometría, y es un método perfectamente aceptable para determinar una tasa siempre y cuando los criterios de selección se decidan y apliquen de manera consistente²⁸.

Una forma más robusta y objetiva es utilizar la función auto_rate(), que identifica regiones lineales de los datos. Estas regiones son las de tasas respiratorias sostenidas de manera constante, asignadas automáticamente mediante el aprendizaje automático. Esta función también es útil para la detección de señales bajas (como en las muestras utilizadas en este estudio, debido a la baja biomasa a esta edad). Esta función permite identificar las tasas más lineales, mínimas y máximas utilizando métodos independientes, objetivos y estadísticamente robustos²⁸. En el ejemplo se identifica una región lineal que se produce entre los puntos de tiempo 3.000 y 5.000. Cabe señalar que se pueden identificar múltiples regiones lineales, pero esta sección es la región mejor clasificada o más lineal (Figura 8C).

#Determine velocidad más lineal (es decir, consistente)
Tarifa <-auto_rate(INSP)

Ajuste de fondo
Las tasas de fondo de los experimentos de control se pueden determinar de manera similar al ejemplo anterior, y se pueden usar para ajustar las tasas de muestras usando la función adjust_rate() (Figura 9A; tenga en cuenta que el análisis completo no se muestra aquí, solo el ajuste). Los ejemplos completos se detallan en el sitio web de respR .

#Adjust tasa de fondo
rate_adj <-adjust_rate(tasa, por = bg) #saved objeto bg
imprimir(rate_adj)

Tasas de conversión
El paso final es convertir las tasas a las unidades de salida deseadas, utilizando las unidades originales de los datos sin procesar, el volumen efectivo del respirómetro y otros datos experimentales, incluida la normalización a mediciones en blanco (Figura 9B). El resultado puede ser una tasa de respiración absoluta, es decir, de toda la muestra, o una tasa específica de masa o área de superficie. La tasa específica del área de superficie fue la salida utilizada aquí, que específicamente es la tasa absoluta dividida por el área de superficie del espécimen (Figura 9C).

Como se ha comentado anteriormente, este sistema se desarrolló para medir muestras muy pequeñas. Por lo tanto, esperábamos valores bajos y una posible superposición con las mediciones en blanco. Se espera cierto nivel de señal dentro de los espacios en blanco, y cuando se examinan, estos valores están dentro del rango esperado de ruido experimental general, posiblemente debido a la deriva de la sonda, ligeros cambios de temperatura o burbujas en las sondas. Por diseño y debido al pequeño tamaño de la muestra y, por lo tanto, al pequeño volumen efectivo utilizado, el uso de piezas en bruto es particularmente importante aquí, especialmente para cada tirada. Los valores representativos se han incluido aquí como ejemplo (Figura 10). Dado el pequeño tamaño de la muestra, recomendamos el uso de los espacios en blanco en cada corrida para estandarizar las mediciones por corrida.

Estos valores en blanco se utilizan para estandarizar los valores de las mediciones de tratamiento. Dado que los corales respiran además de producir oxígeno, la tasa metabólica puede variar de valores negativos a positivos. Aquí se ofrece un ejemplo de resultados representativos del rango de valores de respiración detectados con la herramienta de microrrespiración. Estos resultados se determinaron a partir de un experimento exitoso en juveniles de coral individuales (Figura 10). En general, se esperaba que la respiración fuera difícil de detectar en este conjunto de datos de ejemplo (por diseño), dado el pequeño tamaño de las muestras; Esto subraya el valor de este método para capturar este umbral de señal bajo. Estos resultados representativos muestran la respiración en la oscuridad en los tamaños de especímenes más pequeños probados, lo que subraya el umbral mínimo de detección de este sistema. También medimos bajo dos condiciones (control y estrés a alta temperatura). Después de estandarizar los espacios en blanco medidos por corrida, los valores oscilaron entre cerca de cero (control) y una mediana de ~-^5e-5 para el tratamiento de estrés. Como era de esperar, la respiración era baja. Estos resultados muestran claramente valores representativos para los blancos, así como una comparación entre el control y la alta temperatura para estas muestras muy pequeñas.

Figura 1: Representación esquemática de la nueva herramienta de microrrespirometría para la caracterización fisiológica del holobionte de coral (animal coralino + simbiontes) o de cualquier organismo pequeño (<1 mm). Se realizaron cámaras de respirometría a medida (número 1; 1.1-1.6). Estos incluyen tapas (1.1) con puntos sensores de oxígeno (1.2), y el juvenil individual (1.3) se coloca en un soporte de flujo continuo (1.4) colocado encima de un agitador magnético (1.5), todos los cuales caben dentro de la cámara de vidrio (1.6). El controlador (2) se conecta al punto con un cable de fibra óptica que encaja en la tapa (1) y se conecta a la computadora (3). El calentador/enfriador (4) se conecta a la placa de respirometría (5) con el flujo de agua (indicado por flechas de chevron para la dirección), que se encuentra en la parte superior de la placa agitadora (6) con engranajes (7), accionados por el motor (8) y la fuente de alimentación (9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Configuración de la microrrespirometría. Hay múltiples opciones disponibles, que incluyen (A) una placa de respirometría o (B) conectada a varias placas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Placa agitadora magnética hecha a medida en la parte superior de la placa de respirometría. Cada cámara tiene (A) un engranaje agitador magnético debajo, (B) accionado por un motor, con (C) la placa de respirometría conectada por un tubo al calentador/enfriador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Configuración personalizada de la cámara de respirometría. (A) Componentes (de izquierda a derecha: tapa, vial de vidrio, soporte, tubo de 1,5 ml para báscula y barra agitadora). (B) Soporte de flujo individual en el que se encuentra el espécimen. (C) Vista de arriba hacia abajo del soporte de flujo continuo. (D) y con el soporte colocado dentro del vial de vidrio con la tapa enroscada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Viales de vidrio colocados dentro de la placa del agitador. (A) Placa del agitador hecha a medida con (B) un primer plano del vial de vidrio completo con la configuración de la tapa. El coral juvenil se puede ver a través de la tapa aquí (punto marrón), en la parte superior de la brida, con la fibra óptica colocada en la abertura de la tapa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Cámaras colocadas boca abajo, listas para la calibración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Pasos clave en el software de medición de oxígeno. (A) Compruebe la señal de cada sensor. Una señal óptima para este estudio y sensores se muestra en el punto del sensor de oxígeno FTC (rango normal). (B) Compruebe la deriva de la señal. (C) Ajuste y verifique las temperaturas de tratamiento. (D) Configure y verifique las calibraciones de 0% y 100%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Pasos de salida del análisis respR I. (A) Inspeccione el comando y la salida. (B) Verifique la estabilidad de la tarifa. (C) Determine la tasa más lineal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Pasos de salida del análisis respR II. (A) Ajustar la tasa de fondo, (B) Convertir y (C) Comprobar las tasas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Resultados representativos producidos a partir de la herramienta de microrrespirometría. Respiración media (O₂ ± error estándar) de juveniles de coral individuales replicados, incluidos los valores en blanco, así como la respiración de individuos bajo control y en condiciones de estrés a altas temperaturas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo 1: Vista cenital de la cámara de respirometría con el coral juvenil en su interior durante una sesión de medición. Haga clic aquí para descargar este video.

Tabla 1: Estimación de costes de los componentes del aparato de respirometría. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Este trabajo describe la construcción de una configuración de microrrespirometría hecha a medida que se puede utilizar para cuantificar la cantidad de oxígeno consumido y producido por pequeños organismos acuáticos sésiles. Los componentes críticos de este protocolo incluyen la configuración de las cámaras, incluidos los puntos, y la calibración de la señal baja utilizando el paquete respR , en el que una señal baja se puede definir como velocidades caracterizadas por pendientes poco profundas o ruidosas. La cámara personalizada y su configuración permiten la detección incluso de señales bajas, mientras que el uso del paquete R ayuda a proteger contra problemas en los que la aparición de pendientes poco profundas o ruidosas podría conducir a la interpretación errónea de los resultados (por ejemplo, falsos positivos).

Las posibles modificaciones que serán necesarias para otros usuarios incluyen la fijación del organismo de interés dentro de la cámara hecha a medida. En este caso, se utilizó una brida pequeña y rígida y pegamento de acuario para asegurar al juvenil a la base de plástico, que luego se pegó a la corbata. Cabe señalar que, para este experimento, los juveniles de coral se asentaron sobre láminas de plástico negro. Este plástico permitió la fácil eliminación de los juveniles de coral, que se deslizaron efectivamente fuera del plástico, para no dañarlos físicamente durante la eliminación. Los juveniles de coral se adhieren al sustrato sobre el que se asientan, por lo que se recomienda asentarlos sobre un material plástico similar, utilizando un péptido^{artificial 16} para facilitar su eliminación para el proceso de pegado. Para minimizar aún más el estrés de manipulación y el impacto en la respuesta respiratoria, se recomienda permitir que los corales montados en bridas se aclimaten durante 1-2 semanas, como es común en muchos experimentos de estrés de corales adultos. Es posible que se necesiten otras modificaciones para asegurar el organismo por encima de la mancha en el párpado y permitir la circulación del agua. Otro paso clave para la resolución de problemas es la detección de señales, específicamente en la pendiente de la serie temporal de oxígeno donde se deben determinar las velocidades. En última instancia, esto se reduce a una combinación de usar el buen juicio para excluir datos obviamente inestables y las funciones dentro de respR para permitir que las tasas se extraigan de regiones elegidas de manera consistente o automáticamente mediante la identificación de regiones lineales de los datos. Más ejemplos de cómo hacerlo están disponibles en el sitio web de respR .

Este método se desarrolló para extender las mediciones del límite inferior de la respiración a invertebrados marinos extremadamente pequeños y sésiles. La limitación obvia es que este protocolo puede ser más propenso a falsos positivos en comparación con los protocolos diseñados para biomasas más grandes. Sin embargo, dado que este era el objetivo del diseño, medir estos límites inferiores, esto se ha tenido en cuenta en el diseño, y el procedimiento se puede utilizar con el paquete respR para protegerse mejor contra los falsos positivos. También es importante reconocer que existen otros sistemas para medir la respiración³⁰ y la medición de organismos pequeños, incluida la respirometría en copépodos individuales³¹ en volúmenes más pequeños que este (~0,5-1 mL), pero son costosos o carecen de componentes específicos (capacidad de agitación). Sin embargo, este sistema es de código abierto y de costo relativamente bajo en comparación con los sistemas comerciales (por ejemplo, el sistema de microplacas centrales). Este sistema también incorpora consideraciones metodológicas clave como la agitación, de la que pueden carecer otros sistemas. La función de barra de agitación interna es esencial para replicar la mezcla natural de agua de muchos organismos marinos (por ejemplo, copépodos a través de la natación), que a menudo no es posible y puede hacer que los datos sean en gran medida inutilizables. Por el contrario, otros métodos de mezcla disponibles consisten en colocar todo el respirómetro en un banco basculante gigante, que requiere equipo adicional y tiene un éxito limitado en la mezcla, o mezclar por vibración, lo que puede causar perturbaciones en el organismo. Por esta razón, este es el único sistema que puede realizar la respirometría en corales juveniles u otros organismos sésiles muy pequeños. Como referencia, el rango de tamaño de los especímenes incluidos aquí osciló entre 2,1 y 3,6 pólipos (correspondientes a solo unos pocos meses de edad), con un área media mínima a máxima de 1,3 a 4,5 mm².

La respirometría es una medida fundamental en los estudios ecológicos, y existen muchos métodos para este fin. Sin embargo, la mayoría de estos métodos existentes se dirigen a muestras de alta biomasa, incluidos peces enteros, fragmentos de coral o pastos marinos 32,33,34. Este método es el primero en utilizar juveniles de coral individuales. Además, son muchas las aplicaciones potenciales de este método, ya que proporciona información fisiológica clave sobre el funcionamiento del organismo. Esto puede ser importante para los estudios que buscan caracterizar las estimaciones de salud de referencia³⁵, comprender el papel del estrés agudo o a largo plazo durante la ontogenia de los corales, como el estrés por calor³⁶, o proporcionar umbrales que los administradores pueden establecer para ayudar a proteger y mejorar la salud de los arrecifes de coral³⁷. Dado que el coral es un holobionte y la comunidad simbionte es relativamente flexible en esta etapa y a lo largo del primer año de vida³⁸, sería interesante emparejar los datos de la respirometría con los cambios en las comunidades a lo largo del tiempo, para contextualizar completamente el funcionamiento del organismo en su conjunto. Es importante destacar que este método contribuye a las técnicas de "ciencia abierta" que ayudan a proporcionar un esquema para crear configuraciones experimentales personalizadas que se pueden compartir, mejorar y estandarizar abiertamente.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Cost
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers	LabGlass Party Ldt.	1.5 ml	$407.26
1.1 lids	AIMS workshop	Vial GL25 thread	~$10
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes)	PyroScience	Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947	$41.25 AUD each
1.3 individual organism	NA	NA	NA
1.4 flow-through stand	AIMS workshop	Custom	included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through
1.5 magnetic stirrer	Any manufactuer is suitable	NA	~$2?
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD)	Labglass Pty Ltd, Stafford QLD	Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole	$50.9 AUD
2 FireSting controller (2)	PyroSciences	NA	4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here.
3 computer	NA	NA	NA
4 heater/chiller	VWR International	NA	Small models around $4,000 AUD
5 respirometry plate platform	AIMS workshop	34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers)	$1250 AUD
6 stirrer plate with gears (7)	AIMS workshop	34 cm x 26 cm x 3 cm	$1250 AUD
8 powered by the motor	AIMS workshop	Custom	$700 AUD
9 power supply	Non-specific	NA	~$300 AUD
Aquarium glue	Seachem reef glue	20g	$14
Oxygen Logger Software	PyroScience	NA	NA
Polypipe and connectors	John Guest	NA	$20
Sodium Sulfite	Sigma	S0505-250G (CAS number 7757-83-7)	$54