Caracterização fisiológica do holobionte de coral utilizando uma nova ferramenta de microrrespirometria

Resumo

Este protocolo descreve a configuração e funcionamento de um sistema de micro-respirometria que pode ser empregado para investigar as características fisiológicas do holobionte coral.

Resumo

A atividade metabólica, definida como a soma dos processos do organismo que envolvem energia, é de fundamental importância para a compreensão da função e evolução da vida na Terra. A medição das taxas metabólicas dos organismos está, portanto, no centro da explicação dos estados fisiológicos dos organismos, seus papéis ecológicos e o impacto das mudanças ambientais nas espécies dentro dos ecossistemas terrestres e aquáticos. Nos recifes de coral, medidas do metabolismo têm sido usadas para quantificar o funcionamento da simbiose entre corais e seus simbiontes algais obrigatórios (Symbiodiniaceae), bem como avaliar como os estressores ambientais, incluindo as mudanças climáticas, afetarão a saúde dos corais. Apesar dessa significância, há uma carência de métodos e, portanto, de dados relacionados às medidas da taxa metabólica em filhotes de coral, provavelmente devido ao seu pequeno tamanho. Para suprir essa lacuna, este estudo teve como objetivo desenvolver uma configuração personalizada para medir a respiração de pequenas ecologias de animais marinhos (faixa de tamanho milimétrico). Esse baixo custo e fácil configuração deve permitir uma melhor mensuração da taxa metabólica. Isso será essencial para pesquisas ecológicas aplicadas utilizando a produção sexuada de corais para restauração recifal.

Introdução

A respiração é uma medida biológica crítica que sinaliza a atividade metabólica global de um organismo, mas, como outras características críticas (crescimento), é difícil de medir em organismos pequenos¹. A respiração pode ser definida como a oxidação de moléculas orgânicas através do uso de oxigênio. Esse processo gera a energia química necessária para a função celular (ou seja, o metabolismo), que é essencial para a sobrevivência dos organismos. Alternativamente, o metabolismo anaeróbio resulta em débito de oxigênio². As taxas respiratórias podem ser determinadas usando optodes que medem o uso (e, portanto, a diminuição) da concentração de oxigênio ao longo do tempo em uma câmara fechada, uma prática geralmente conhecida como respirometria³. Dado que a maioria dos organismos não armazena oxigênio, a taxa de metabolismo pode ser inferida através da correlação direta entre respiração e uso de carbono. Devido a isso, as taxas respiratórias podem ser convertidas para o uso diário de carbono, que informa funções metabólicas críticas, como crescimento, reprodução e a capacidade de manter a homeostase metabólica durante períodos de estresse ambiental ^4,5, incluindo condições de ondas de calor que geralmente levam ao estresse ou branqueamento nos corais.

Os recifes de coral estão diminuindo globalmente em um ritmo acelerado. O animal coral abriga um consórcio de parceiros (incluindo o dinoflagelado Symbiodiniaceae, fungos, bactérias e vírus), coletivamente referido como "holobionte"⁶. À medida que a temperatura dos oceanos aumenta, os corais e, portanto, os recifes de coral, estão sob crescente pressão para sobreviver, pois as altas temperaturas levam à perda do dinoflagelado Symbiodiniaceae (doravante simbiontes), fenômeno conhecido como branqueamento⁷. Muitos nutrientes não estão disponíveis para os corais em águas tropicais oligotróficas, incluindo nitrogênio inorgânico e fósforo⁸. Para o enfrentamento, os corais formam uma simbiose nutricional obrigatória com seus simbiontes dinoflagelados (Symbiodiniaceae), que fornecem a maioria dos nutrientes necessários para que o hospedeiro coral sobreviva e deposite seus esqueletos de carbonato de cálcio⁹. Uma simbiose funcional pode ser caracterizada por altos níveis de compartilhamento de carbono entre parceiros ^10,11, e a regulação da simbiose envolve uma homeostase dinâmica¹².

Durante o estresse térmico, essa regulação dinâmica e comunicação são interrompidas, resultando em disbiose e clareamento (revisado na referência¹³). Medidas metabólicas, como fotossíntese e respiração, portanto, têm o potencial de elucidar os estados disbióticos saudáveis e não regulados dos corais, e medir com precisão esses processos através da ontogenia é fundamental para entender o funcionamento do organismo. Isso é particularmente importante à medida que a frequência e a magnitude dos eventos de branqueamento em massa aumentam, com o potencial de influenciar mudanças no compartilhamento de nutrientes dos simbiontes, onde a transferência de carbono diminui com o aumento das temperaturas¹⁴. Isso pode ser devido a mecanismos direcionados pelo sequestro simbionte de nutrientes ou a trade-offs fisiológicos difíceis (aumento da tolerância térmica, mas diminuição da sobrevivência do hospedeiro 15,16,17). Rupturas na simbiose podem decorrer tanto do simbionte quanto do hospedeiro, embora um fator preponderante seja provavelmente o mau funcionamento celular do simbionte¹⁸. No entanto, o estresse causado pelo aumento da temperatura da água do mar desestabiliza essa simbiose; O compartilhamento de carbono do simbionte para o hospedeiro é diminuído^19,20, e a fome do coral pode ocorrer. Isso pode ser refletido na diminuição dos estoques de lipídios e carboidratos nos corais devido ao aumento do uso do hospedeiro ("aumento do catabolismo do carbono fixo"), provavelmente devido à diminuição do compartilhamento pelos simbiontes¹¹. Ao lado da contribuição da fotossíntese e da respiração dos simbiontes dos corais, a respiração do animal coral é uma medida importante para entender a saúde dos corais, os impactos do branqueamento e da troca de nutrientes entre esses parceiros e o crescimento do holobionte, fenótipo relevante para sobreviver às mudanças ambientais ^8,21,22. Finalmente, dado que muitos corais são simbióticos, o uso da respirometria para caracterizar a fotossíntese além da respiração é particularmente útil para contextualizar as razões P:R e entender se a simbiose é estável ou não (por exemplo, referência²³).

As mudanças ambientais, portanto, causam mudanças nos orçamentos energéticos dos corais e seus simbiontes, levando a diferenças no crescimento¹⁴. Para lidar, o hospedeiro coral pode aumentar a respiração e o uso de lipídios para atender às suas demandas metabólicas; O estresse térmico pode reduzir a produtividade líquida em 60% devido a esse aumento da respiração¹⁴, medido por uma mudança no oxigênio dissolvido. Symbiodiniaceae também pode aumentar a assimilação de nitrogênio e a retenção de carbono^14,24 e, então, utilizar essas reservas para deslocar energia para seus próprios mecanismos de reparo e proteção^25,26. O balanço de N e C é importante para regular o crescimento, e o P em particular²⁷, que pode se manifestar como uma regulação dinâmica da abundância de simbiontes. De fato, evidências coletadas de corais em grandes extensões recifais (>1.000 km) sugerem que os hospedeiros têm a capacidade de limitar o crescimento simbionte por meio da regulação do P, embora isso varie de acordo com a espécie de coral²⁷.

Em conjunto, esses estudos sugerem um ganho de tolerância ao calor com uma diminuição concomitante na produção ou translocação de nutrientes (ou seja, a propensão à simbiose) devido a mudanças ambientais. Métodos potentes unijuvenis, como a quantificação do uso de oxigênio via microrrespirometria, devem, portanto, ser usados para entender os mecanismos fundamentais relacionados ao metabolismo e, em seguida, aplicados a questões de conservação, como a compreensão da aquisição de tolerância ao calor. Esta é apresentada aqui como uma ferramenta de micro-respirometria para medidas fisiológicas, destinada a consultar a relação nutricional entre juvenis de corais e seus simbiontes algais, mas adequada para outros pequenos organismos marinhos.

O uso ou a produção de oxigênio pelos organismos pode ser medido colocando-os em câmaras de respirometria individuais hermeticamente fechadas ou "respirômetros" (doravante câmaras), onde a mudança de oxigênio é medida usando optodes³. Optodes são sondas que medem a concentração de oxigênio usando pulsos de luz, e registrar medições ao longo do tempo permite o cálculo das taxas de respiração e/ou fotossíntese. Na prática, medir a respiração é semelhante a medir a fotossíntese em corais, exceto que os corais são incubados na escuridão total. Subtraindo a respiração diária total dos corais e simbiontes da fotossíntese diária total resulta em um diferencial de oxigênio (delta de oxigênio)^2,3. Geralmente, os organismos usam mais oxigênio do que produzem, resultando em um déficit. Isso pode ser convertido em carbono equivalente, uma vez que o oxigênio e o carbono são consumidos em uma razão fixa². O excedente de carbono pode ser utilizado pelo coral para crescimento, síntese e reprodução de muco e outras necessidades metabólicas essenciais¹².

Este protocolo descreve um método de micro-respiração (Figura 1) que foi empregado para medir as taxas de respiração (R) para juvenis de coral individuais usando um design de câmara de vidro personalizado de 1,5 mL (frasco com rosca GL25 e 20 mm de altura, com solavanco/crista, borda plana e tampa de rosca com furo; ver Tabela de Materiais) preenchida com água do mar filtrada de 0,5 μm. Os optodes de fibra óptica (ver Tabela de Materiais) foram inseridos em cada câmara através de um orifício na lateral da tampa. Cada coral individual foi fixado acima de uma plataforma de placa de agitação de malha dura, fluída, acima de uma barra de agitação magnética para garantir a mistura adequada de água dentro da câmara. No exemplo representativo aqui, dois controles ou "blanks" (câmaras que eram idênticas, exceto pela presença do espécime) foram medidos simultaneamente às três câmaras de réplica do corpo de prova, pois tínhamos vários controladores funcionando simultaneamente. No entanto, o exemplo de configuração (Figura 2) mostra apenas o uso de quatro canais; Isso pode ser aumentado usando vários controladores e vários suportes de fluxo. A temperatura também pode ser controlada neste sistema submergindo cada câmara em banho-maria personalizado com temperaturas de água predefinidas (27 °C para controle ou 31 °C para o estresse de alta temperatura nos dados de exemplo aqui) usando um sistema de fluxo recirculante (fluxo contínuo e suave definido em 75 L/h). A plataforma da placa do agitador e a placa do agitador com engrenagens podem ser de qualquer tamanho e podem ser feitas tão grandes ou tão pequenas quanto necessário para acomodar o número de câmaras de vidro. Neste exemplo, a plataforma e a placa tinham cerca de 34 cm x 26 cm x 3 cm (Tabela de Materiais). A calibração dos optodes foi realizada antes de cada corrida usando duas soluções-padrão representando 0% e 100% de saturação de oxigênio na temperatura e salinidade da água adequadas para este cenário experimental.

Protocolo

1. Instalação de equipamentos e corais dentro das câmaras de respiração

NOTA: Corais reprodutivamente prontos (ou seja, aqueles que tinham feixes de óvulos/espermatozoides pigmentados rosados visíveis de galhos fragmentados das colônias da espécie Acropora tenuis ) foram desalojados do recife na Ilha Magnética (19° 6.249'S; 146° 51.728'E) no dia de uma lua cheia em outubro de 2018 (número de licença: G12/35236.1), coletados e trazidos ao laboratório para desova de corais, onde corais juvenis foram criados e crescidos.

1. No dia das medições, conecte as duas placas de banho-maria usando politubo azul e conectores (consulte Tabela de Materiais; Figura 1 [5], Figura 2A,B). Estes servirão como incubadoras após a conexão com o polypipe azul ao aquecedor de água/chiller. Certifique-se de que a placa do motor possa ser claramente vista através das placas de banho-maria transparentes quando as câmaras de respirometria não estiverem no lugar.
2. Conecte as duas mangueiras ao aquecedor/chiller de água (consulte a Tabela de Materiais). Ligue o aquecedor/chiller de água e, em seguida, ajuste a temperatura experimental desejada (27 °C ou 31 °C).
3. Conecte a base do banho-maria (passo 1.1) à placa do motor de base com as engrenagens magnéticas (Figura 1 [6, 7] e Figura 3A) e, em seguida, conecte este conjunto a uma fonte de alimentação (Figura 3B). Ligue a fonte de alimentação para ativar as engrenagens, que ativarão as barras agitadoras nas câmaras.
4. Module o fluxo de água conforme necessário (por exemplo, fluxo contínuo e suave definido em 75 L/h com agitação lenta a 30 rpm) usando os botões do conector da válvula (Figura 3C).
5. Para montar a câmara de respirometria, adicionar o cordão magnético (Figura 1 [1.5]) à câmara de vidro (Figura 1 [1.6]) e, em seguida, a base do suporte de fluxo plástico opaco (Figura 1 [1.4]) na câmara de vidro (Figura 4A). O tamanho da câmara e do cordão magnético dependerá do organismo e do sistema de estudo de interesse.
   NOTA: Existem furos na base plástica para permitir o fluxo e circulação de água a partir do movimento do talão magnético no fundo.
6. Cole o coral usando cola de aquário (ver Tabela de Materiais) na gravata preta colocada na base plástica (Figura 4B-D). Para fazer isso, primeiro, cole o coral juvenil em um pedaço de plástico preto e, em seguida, cole esse pedaço na base de plástico. Uma vez que o coral esteja fixado de forma segura (a cura da cola é quase instantânea), rosqueie a tampa com o anel O (Figura 4A) na câmara de vidro. Execute essas ações debaixo d'água em uma bacia separada para garantir que nenhum ar esteja dentro da câmara de respirometria.
   NOTA: O volume de água no respirômetro (ou seja, volume efetivo = 1,5 ml) foi determinado através da submersão completa da câmara debaixo d'água. A suposição é que, em relação ao volume de água, o deslocamento da massa/densidade do coral muito pequeno é insignificante. O tubo de microcentrífuga de 1,5 mL é mostrado aqui para a escala (Figura 4A).
7. Coloque firmemente as câmaras nos banhos-maria (Figura 5A). Certifique-se de que as câmaras de vidro estejam em contato com a água com temperatura controlada para o experimento.
8. Conecte os cabos de fibra óptica O₂ (consulte Tabela de Materiais) para que eles estejam em contato com os pontos do sensor de oxigênio (doravante referidos como pontos; consulte Tabela de Materiais) inserindo-os no orifício perfurado na lateral das câmaras da tampa. Esses pequenos pontos são sensíveis ao oxigênio e detectam e transmitem o sinal de dentro da câmara através do cabo de fibra óptica.
   1. Adicione fita adesiva (fita auto-selante fina branca) para fazer o cabo encaixar confortavelmente e deixá-lo permanecer firmemente dentro da câmara de água. Certifique-se de que o coral individual possa ser visto (como visto na Figura 5B), com tentáculos marrons voltados para cima, dentro da câmara (Figura 5B, Vídeo 1).
      NOTA: As estimativas de custos dos componentes do aparelho são apresentadas na Tabela 1.

2. Procedimento operacional padrão para medir a respiração usando o sistema O₂

1. Abra o software de medição de oxigênio (consulte Tabela de Materiais).
2. Meça a temperatura da sala onde será realizada a calibração. Isso será necessário posteriormente para a etapa de calibração (etapa 2.8).
3. Monte os sensores ópticos e tampas. Para fazer isso, conecte toda a fibra óptica à porta correspondente no módulo O₂ . Certifique-se de combinar a tampa 1 com o sensor 1, a tampa 2 com o sensor 2 e assim por diante.
4. Para configurar as câmaras para calibração, primeiro umedeça um pedaço de esponja limpa com um pouco de água de osmose reversa (RO) e insira-o em cada câmara.
   OBS: A esponja não deve pingar, apenas estar úmida. Pode pingar no ponto de fibra óptica. Certifique-se de que o local não está molhado antes de prosseguir para a próxima etapa.
5. Coloque as câmaras de cabeça para baixo com a fibra óptica correspondente (Figura 6). Isso permitirá desaparafusar a câmara sem tocar na fibra óptica e adicionar o sulfito de sódio para a calibração de 0%.
6. Verifique o sinal de cada sensor antes do início da calibração. Percorra todas as abas da interface do software e verifique o valor do sinal (canto superior esquerdo) (Figura 7A), garantindo que elas não variem significativamente. Verifique no manual do O₂ os valores aceitáveis para o arranjo experimental (dependendo do organismo e das condições de interesse). Para esta configuração específica, a uma temperatura ambiente de 25,3 °C, um FTC (fluxo pontual do sensor de oxigênio através da faixa normal da célula) de 20,59 com o sinal em 179,5 é aceitável.
7. Abra o Programa e verifique as configurações no software para confirmar se estão corretas, conforme descrito abaixo. Se a janela pop-up não aparecer imediatamente após abrir o programa, isso pode ser feito clicando no botão Configurações no canto inferior esquerdo da interface do software.
8. Verifique se o sensor de temperatura externo está ativado (Figura 7B). Altere a configuração para Temperatura fixa (Figura 7C). Em seguida, adicione o valor de temperatura ambiente e clique em copiar configuração para todos os outros canais.
9. Altere a configuração para Reduce Signal Drift (Reduzir desvio de sinal ) (Figura 7C). Em seguida, selecione Configurações do sensor e selecione o nível 2. Caso contrário, se usar pequenos volumes, a deriva será tão alta que será difícil de calibrar.
10. Verifique as configurações gerais dos canais. Pressione Ok se adequado. Clique em copiar configurações para todos os canais e, em seguida, clique em ok.
11. Calibre os sensores. Para a calibração do canal 1, vá para a guia Canal 1 e pressione o botão Calibrar . Selecione 2 pontos na água ou no ar úmido.
12. Para a calibração do "ar", mergulhe um pedaço de espuma na água, coloque-o dentro da câmara e aguarde que o sinal se estabilize (veja as imagens de calibração do ar antes e depois). Quando estiver estável, pressione "set air". Clique em ar > Calibrar > definir o ar.
13. Ajuste a calibração de 0% e 100% (Figura 7D). Retire a câmara da tampa e coloque-a na próxima tampa para que o sinal de calibração do ar esteja pronto quando a calibração de 0% no primeiro sensor estiver concluída. Use uma pipeta de transferência e encha a tampa com 2% de sulfito de sódio. Aguarde o sinal se estabilizar.
    NOTA: O sinal geralmente leva mais tempo para estabilizar em comparação com a calibração do ar. Se aparecer uma mensagem de aviso informando que os "valores estão fora da faixa típica", verifique se o sulfito de sódio está fresco. Repita o mesmo processo de calibração para todos os canais. Preparar o sulfito de sódio adicionando 2 g em 100 mL de água RO.
14. Uma vez concluída a calibração, enxágue bem as câmaras de respiração e seque as câmaras e tampas. Certifique-se de que não há água no orifício de fibra óptica.
15. Coloque o organismo (juvenis de coral único, neste exemplo) dentro das câmaras de respiração e feche com tampas. Ao colocar as tampas, certifique-se de fazê-lo quando as câmaras estiverem totalmente submersas e não houver absolutamente nenhum ar dentro.
16. Coloque as câmaras firmemente na placa de agitação e conecte a fibra óptica.
17. Ligue a fonte de alimentação. Certifique-se de que a água dentro das câmaras se misture completamente. Ajuste a temperatura no chiller/aquecedor para as temperaturas experimentais escolhidas.
18. Ligue a bomba e o aquecedor (passos 1.2 e 1.4).
19. Pressione log na interface do software de medição O₂ para iniciar a gravação.

Resultados

Processamento e análise de dados
Embora existam vários métodos para processar os dados brutos de experimentos de respirometria, recomenda-se o uso do pacote R respR²⁸. De acordo com o compartilhamento dos protocolos acima, que defendem a ciência aberta e a reprodutibilidade, este pacote permite que o processamento e a análise de dados sejam compartilhados de forma facilmente reprodutível e foi projetado com isso em mente. É uma plataforma gratuita de código aberto e independente do sistema de sonda, e facilmente instalável a partir de CRAN ou GitHub. O código completo e os exemplos para respR são mantidos e podem ser encontrados em https://github.com/januarharianto/respR.

O pacote respR tem funções para importar, visualizar e executar o controle de qualidade em dados de respirometria e calcular as taxas de respiração automaticamente ou a partir de regiões escolhidas manualmente. Ele também pode ajustar as taxas de respiração de fundo e taxas de conversão para unidades de saída comumente usadas. As etapas para processar os dados do sistema de microrrespirometria são detalhadas abaixo. Neste estudo, os dados do sistema de respirometria foram usados como exemplo, mas o pacote também aceita entradas da maioria dos sistemas de sonda de oxigênio disponíveis comercialmente, bem como objetos de dados R genéricos. Mais detalhes sobre o pacote, incluindo documentação completa e tutoriais, podem ser encontrados no site do pacote em https://januarharianto.github.io/respR/index.html.

Importando dados brutos
O arquivo de saída bruto (.txt) é importado. O respR reconhece o formato e o analisa para um quadro de dados R genérico que pode ser usado em funções subsequentes. No entanto, é importante ressaltar que isso é opcional; esses arquivos e praticamente todos os dados de séries temporais de oxigênio também podem ser importados usando funções de base (dadas abaixo) por qualquer pessoa com um conhecimento básico de R.

#load respR
Biblioteca(respR)

#Import ---
Dados <- import_file("file.txt")
Arquivo #Firesting-Pryo detectado

Inspecionando e visualizando os dados
Uma parte vital de qualquer tarefa de análise de dados é plotar e inspecionar os dados para procurar anomalias ou padrões óbvios, ou mesmo apenas para ajudar a entendê-los. A função de inspeção é usada aqui (Figura 8A), que verifica problemas comuns aos dados de respirometria, como valores não numéricos ou ausentes.

#inspect uma única coluna de oxigênio
Insp <-inspect(dados, tempo = 3, oxigênio = 8, largura = 0,2)

Essa função também plota a série temporal de oxigênio e calcula uma taxa de rolamento (painel inferior) para ajudar a elucidar como essa taxa pode mudar ao longo do experimento. Esses gráficos de taxa contínua ajudam a informar sobre quais regiões dessas curvas de taxa devem ser extraídas. No caso de taxas metabólicas padrão ou de rotina, as regiões desejadas são aquelas onde a taxa mostra estabilidade (por exemplo, após cerca de 3.000; Figura 8B).

Aqui, o declínio do oxigênio só se torna detectável após cerca de 200 na linha 200 no painel completo da série temporal. Padrões como esse são muito comuns em dados de respirometria; Muitas vezes há um período prolongado de instabilidade no início de um experimento à medida que o sistema se estabiliza e o espécime se aclimata às condições experimentais. Recomenda-se que as taxas só sejam extraídas das séries temporais após essa instabilidade inicial, o que também ressalta a importância das visualizações.

Taxas de extrato
respR tem duas funções para extrair taxas respiratórias. A primeira é a função calc_rate(), que permite que uma taxa seja extraída manualmente especificando uma região de tempo, linha ou nível de oxigênio. Isso é muito comum em análises respirométricas, e um método perfeitamente aceitável para determinar uma taxa, desde que os critérios de seleção sejam decididos e aplicados de forma consistente²⁸.

Uma forma mais robusta e objetiva é utilizar a função auto_rate(), que identifica regiões lineares dos dados. Essas regiões são aquelas de taxas de respiração sustentadas consistentemente, atribuídas automaticamente usando aprendizado de máquina. Esta função também é útil para a detecção de baixos sinais (como nas amostras utilizadas neste estudo, devido à baixa biomassa nesta idade). Essa função permite a identificação das taxas mais lineares, mínimas e máximas por meio de métodos independentes, objetivos e estatisticamente robustos²⁸. O exemplo aqui identifica uma região linear que ocorre de cerca de 3.000 a 5.000. Deve-se notar que várias regiões lineares podem ser identificadas, mas esta seção é a região mais bem classificada, ou mais linear, (Figura 8C).

#Determine taxa mais linear (ou seja, consistente)
Taxa <-auto_rate(INSP)

Ajuste de plano de fundo
As taxas de fundo dos experimentos de controle podem ser determinadas de maneira semelhante ao exemplo acima, e podem ser usadas para ajustar as taxas de amostra usando a função adjust_rate() (Figura 9A; note que a análise completa não é mostrada aqui, apenas o ajuste). Os exemplos completos estão detalhados no site da respR .

#Adjust taxa para fundo
rate_adj <-adjust_rate(taxa, por = bg) #saved objeto bg
impressão(rate_adj)

Converta taxas
A etapa final é converter as taxas para as unidades de saída desejadas, usando as unidades originais dos dados brutos, volume efetivo do respirômetro e outros dados experimentais, incluindo a normalização para medidas em branco (Figura 9B). A saída pode ser uma taxa de respiração absoluta, isto é, de todo o espécime, ou uma taxa específica de massa ou área de superfície. A taxa específica de área de superfície foi a saída usada aqui, que especificamente é a taxa absoluta dividida pela área de superfície do espécime (Figura 9C).

Como discutido acima, este sistema foi desenvolvido para medir espécimes muito pequenos. Portanto, esperava-se valores baixos e potencial sobreposição com medidas em branco. Algum nível de sinal é esperado dentro dos espaços em branco e, quando examinados, esses valores estão dentro da faixa esperada de ruído experimental geral, possivelmente devido à deriva da sonda, pequenas mudanças de temperatura ou bolhas nas sondas. Pelo design e devido ao pequeno tamanho do espécime e, portanto, pequeno volume efetivo usado, o uso de espaços em branco é particularmente importante aqui, especialmente para cada corrida. Valores representativos foram incluídos aqui como exemplo (Figura 10). Dado o pequeno tamanho do espécime, recomendamos o uso dos espaços em branco a cada corrida para padronizar as medidas por corrida.

Esses valores em branco são então usados para padronizar os valores das medidas de tratamento. Como os corais respiram, além de produzir oxigênio, a taxa metabólica pode variar de valores negativos a positivos. Um exemplo de resultados representativos da gama de valores respiratórios detectados a partir da ferramenta de micro-respiração é dado aqui. Estes resultados foram determinados a partir de um experimento bem sucedido em juvenis de coral solteiros (Figura 10). Em geral, esperava-se que a respiração fosse difícil de detectar neste conjunto de dados de exemplo (por design), dado o pequeno tamanho das amostras; Isso ressalta o valor desse método na captura desse baixo limiar de sinal. Estes resultados representativos mostram respiração no escuro nos menores tamanhos de espécimes testados, ressaltando o limiar mínimo de detecção deste sistema. Também medimos sob duas condições (controle e estresse de alta temperatura). Após a padronização para os espaços em branco medidos por corrida, os valores variaram de próximo a zero (controle) a uma mediana de ~-^5e-5 para o tratamento de estresse. Como esperado, a respiração foi baixa. Estes resultados mostram claramente valores representativos para brancos, bem como uma comparação controle versus alta temperatura para essas amostras muito pequenas.

Figura 1: Representação esquemática da nova ferramenta de microrrespirometria para a caracterização fisiológica do holobionte coral (animal coral + simbiontes) ou de qualquer pequeno organismo (<1 mm). Foram confeccionadas câmaras de respirometria personalizadas (número 1; 1.1-1.6). Estes incluem tampas (1.1) com pontos de sensor de oxigénio (1.2), e o indivíduo juvenil (1.3) é colocado num suporte de fluxo (1.4) colocado no topo de um agitador magnético (1.5), todos os quais cabem dentro da câmara de vidro (1.6). O controlador (2) é conectado ao ponto com um cabo de fibra óptica que se encaixa na tampa (1) e conectado ao computador (3). O aquecedor/chiller (4) conecta-se à placa de respirometria (5) com a água de fluxo (indicada pelas setas de divisa para direção), que fica em cima da placa agitadora (6) com engrenagens (7), acionada pelo motor (8) e pela fonte de alimentação (9). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Configuração da microrrespirometria. Várias opções estão disponíveis, incluindo (A) uma placa de respirometria ou (B) conectada a várias placas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Placa de agitador magnético personalizada na parte superior da placa de respirometria. Cada câmara tem (A) uma engrenagem agitadora magnética embaixo, (B) alimentada por um motor, com (C) a placa de respirometria conectada por tubulação ao aquecedor/chiller. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Configuração personalizada da câmara de respirometria. (A) Componentes (da esquerda para a direita: tampa, frasco para injetáveis de vidro, suporte, tubo de 1,5 ml para balança e barra agitadora). (B) Suportes de escoamento individuais em que o espécime se encontra. (C) Vista de cima para baixo do suporte de fluxo. (D) e com o suporte colocado dentro do frasco de vidro com a tampa rosqueada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Frascos para injetáveis de vidro colocados no interior da placa agitadora. (A) Placa de agitador personalizada com (B) um close-up do frasco para injetáveis de vidro completo com a configuração da tampa. O coral juvenil pode ser visto através da tampa aqui (ponto marrom), em cima da gravata-zíper, com a fibra óptica colocada na abertura da tampa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Câmaras colocadas de cabeça para baixo, prontas para calibração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Principais etapas do software de medição de oxigênio. (A) Verifique o sinal de cada sensor. Um sinal ótimo para este estudo e sensores é mostrado no ponto do sensor de oxigênio FTC (faixa normal). (B) Verifique a deriva do sinal. (C) Definir e verificar as temperaturas de tratamento. (D) Definir e verificar as calibrações de 0% e 100%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Etapas de saída da análise respR I. (A) Inspecione o comando e a saída. (B) Verificar a estabilidade da taxa. (C) Determine a taxa mais linear. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Etapas II de saída da análise respR . (A) Ajuste a taxa para fundo, (B) Converter e (C) verificar as taxas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Resultados representativos produzidos a partir da ferramenta de microrrespirometria. Respiração mediana (O₂ ± erro padrão) de juvenis de coral individuais replicados, incluindo valores em branco, bem como respiração de indivíduos sob controle e condições de estresse de alta temperatura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Vista de cima para baixo da câmara de respirometria com o coral juvenil dentro durante uma sessão de medição. Clique aqui para baixar este vídeo.

Tabela 1: Estimativas de custo dos componentes do aparelho de respirometria. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

Este trabalho descreve a construção de um sistema de micro-respirometria feito sob medida que pode ser usado para quantificar a quantidade de oxigênio consumido e produzido por pequenos organismos aquáticos sésseis. Os componentes críticos deste protocolo incluem a configuração das câmaras, incluindo os pontos, e a calibração do sinal baixo usando o pacote respR , no qual um sinal baixo pode ser definido como taxas tipificadas por inclinações rasas ou ruidosas. A câmara personalizada e sua configuração permitem a detecção de sinais ainda baixos, enquanto o uso do pacote R ajuda a proteger contra problemas em que a ocorrência de inclinações rasas ou barulhentas pode levar à interpretação errônea dos resultados (por exemplo, falso-positivos).

Possíveis modificações que serão necessárias para outros usuários incluem a segurança do organismo de interesse dentro da câmara personalizada. Neste caso, uma pequena gravata rígida e cola de aquário foram usadas para prender o único jovem à base plástica, que foi então colada na gravata. Deve-se notar que, para este experimento, os juvenis de coral foram assentados em lonas plásticas pretas. Este plástico permitiu a fácil remoção dos juvenis de coral, que efetivamente deslizaram para fora do plástico, de modo a não prejudicá-los fisicamente durante a remoção. Os juvenis de corais se afixam ao substrato em que se instalam, por isso recomenda-se assentá-los em material plástico semelhante, usando um peptídeo artificial¹⁶ para facilitar sua remoção para o processo de colagem. Para minimizar ainda mais o estresse de manuseio e o impacto na resposta respiratória, recomenda-se permitir que os corais montados em zíperes se aclimatem por 1-2 semanas, como é comum em muitos experimentos de estresse de corais adultos. Outras modificações podem ser necessárias para fixar o organismo acima do ponto na tampa e permitir a circulação de água. Outra etapa importante de solução de problemas envolve a detecção de sinal, especificamente na inclinação da série temporal de oxigênio, onde as taxas devem ser determinadas. Em última análise, isso se resume a uma combinação de usar o bom senso para excluir dados obviamente instáveis e as funções dentro do respR para permitir que as taxas sejam extraídas de regiões escolhidas consistentemente ou automaticamente identificando regiões lineares dos dados. Outros exemplos de como fazer isso estão disponíveis no site da respR .

Este método foi desenvolvido para estender as medidas do limite inferior da respiração a invertebrados marinhos extremamente pequenos e sésseis. A limitação óbvia é que este protocolo pode ser mais propenso a falso-positivos em comparação com protocolos projetados para biomassas maiores. No entanto, dado que este era o ponto do projeto - para medir esses limites inferiores - isso foi levado em consideração no projeto, e o procedimento pode ser usado com o pacote respR para melhor proteger contra falso-positivos. Também é importante reconhecer que existem outros sistemas para medir a respiração³⁰ e a medição de pequenos organismos, incluindo a respirometria em copépodes individuais³¹ em volumes menores do que este (~0,5-1 mL), mas são caros ou carecem de componentes específicos (capacidade de agitação). No entanto, este sistema é de código aberto e de custo relativamente baixo em comparação com sistemas comerciais (por exemplo, sistema Core Microplate). Esse sistema também incorpora considerações metodológicas importantes, como a agitação, que outros sistemas podem não ter. O recurso de barra de agitação interna é essencial para replicar a mistura natural de água de muitos organismos marinhos (por exemplo, copépodes através da natação), que muitas vezes não é possível e pode tornar os dados em grande parte inutilizáveis. Em contraste, outros métodos de mistura disponíveis envolvem a colocação de todo o respirômetro em um banco balancim gigante, que requer equipamento adicional e tem sucesso limitado na mistura, ou mistura via vibração, o que pode causar distúrbios ao organismo. Por esta razão, este é o único sistema que pode realizar a respirometria em corais juvenis ou outros organismos sésseis muito pequenos. Para referência, a faixa de tamanho dos espécimes aqui incluídos variou de 2,1 a 3,6 pólipos (correspondendo a apenas alguns meses de idade), com área média mínima a máxima de 1,3 a 4,5^mm2.

A respirometria é uma medida fundamental em estudos ecológicos, e muitos métodos existem para esse fim. A maioria desses métodos existentes, no entanto, visa amostras de alta biomassa, incluindo peixes inteiros, fragmentos de corais ou ervas marinhas 32,33,34. Este método é o primeiro a usar juvenis de coral individuais. Além disso, existem muitas aplicações potenciais para este método, uma vez que fornece informações fisiológicas fundamentais sobre o funcionamento do organismo. Isso pode ser importante para estudos que procuram caracterizar estimativas de saúde basais³⁵, entender o papel do estresse agudo ou de longo prazo durante a ontogenia dos corais, como o estresse térmico³⁶, ou fornecer limiares que os gestores podem definir para ajudar a proteger e melhorar a saúde dos recifes de coral³⁷. Dado que o coral é um holobionte e a comunidade simbionte é relativamente flexível nesta fase e ao longo do primeiro ano de vida³⁸, seria interessante combinar dados de respirometria com mudanças nas comunidades ao longo do tempo, para contextualizar completamente o funcionamento do organismo como um todo. É importante ressaltar que esse método contribui para técnicas de "ciência aberta" que ajudam a fornecer um esboço para a criação de configurações experimentais personalizadas que podem ser compartilhadas, melhoradas e padronizadas abertamente.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Cost
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers	LabGlass Party Ldt.	1.5 ml	$407.26
1.1 lids	AIMS workshop	Vial GL25 thread	~$10
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes)	PyroScience	Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947	$41.25 AUD each
1.3 individual organism	NA	NA	NA
1.4 flow-through stand	AIMS workshop	Custom	included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through
1.5 magnetic stirrer	Any manufactuer is suitable	NA	~$2?
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD)	Labglass Pty Ltd, Stafford QLD	Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole	$50.9 AUD
2 FireSting controller (2)	PyroSciences	NA	4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here.
3 computer	NA	NA	NA
4 heater/chiller	VWR International	NA	Small models around $4,000 AUD
5 respirometry plate platform	AIMS workshop	34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers)	$1250 AUD
6 stirrer plate with gears (7)	AIMS workshop	34 cm x 26 cm x 3 cm	$1250 AUD
8 powered by the motor	AIMS workshop	Custom	$700 AUD
9 power supply	Non-specific	NA	~$300 AUD
Aquarium glue	Seachem reef glue	20g	$14
Oxygen Logger Software	PyroScience	NA	NA
Polypipe and connectors	John Guest	NA	$20
Sodium Sulfite	Sigma	S0505-250G (CAS number 7757-83-7)	$54