Caratterizzazione fisiologica dell'olobionte di corallo mediante un nuovo strumento di micro-respirometria

Riepilogo

Questo protocollo descrive la messa a punto e il funzionamento di un sistema di micro-respirometria che può essere impiegato per studiare le caratteristiche fisiologiche dell'olobionte corallo.

Abstract

L'attività metabolica, definita come la somma dei processi dell'organismo che coinvolgono l'energia, è di fondamentale importanza per comprendere la funzione e l'evoluzione della vita sulla terra. La misurazione dei tassi metabolici degli organismi è, quindi, al centro della spiegazione degli stati fisiologici degli organismi, dei loro ruoli ecologici e dell'impatto dei cambiamenti ambientali sulle specie all'interno degli ecosistemi terrestri e acquatici. Sulle barriere coralline, le misure del metabolismo sono state utilizzate per quantificare il funzionamento della simbiosi tra i coralli e i loro simbionti algali obbligati (Symbiodiniaceae), nonché per valutare in che modo i fattori di stress ambientale, compresi i cambiamenti climatici, avranno un impatto sulla salute dei coralli. Nonostante questa importanza, mancano metodi, e quindi dati, relativi alle misurazioni del tasso metabolico nella prole dei coralli, probabilmente a causa delle loro piccole dimensioni. Per colmare questa lacuna, questo studio mirava a sviluppare una configurazione personalizzata per misurare la respirazione di piccole ecologie di animali marini (gamma di dimensioni millimetriche). Questo basso costo e la facile configurazione dovrebbero consentire una migliore misurazione del tasso metabolico. Questo sarà essenziale per la ricerca ecologica applicata che utilizza la produzione sessuale di coralli per il ripristino della barriera corallina.

Introduzione

La respirazione è una misura biologica critica che segnala l'attività metabolica complessiva di un organismo, ma come altri tratti critici (crescita), è difficile da misurare nei piccoli organismi¹. La respirazione può essere definita come l'ossidazione di molecole organiche attraverso l'utilizzo dell'ossigeno. Questo processo genera l'energia chimica necessaria per la funzione cellulare (cioè il metabolismo), che è essenziale per la sopravvivenza degli organismi. In alternativa, il metabolismo anaerobico provoca un debito di ossigeno². Le frequenze respiratorie possono essere determinate utilizzando optodi che misurano l'utilizzo (e quindi la diminuzione) della concentrazione di ossigeno nel tempo in una camera chiusa, una pratica generalmente nota come respirometria³. Dato che la maggior parte degli organismi non immagazzina ossigeno, il tasso di metabolismo può essere dedotto attraverso la correlazione diretta tra la respirazione e l'utilizzo del carbonio. Per questo motivo, i tassi di respirazione possono essere convertiti in consumo giornaliero di carbonio, che informa le funzioni metaboliche critiche come la crescita, la riproduzione e la capacità di mantenere l'omeostasi metabolica durante i periodi di stress ambientale ^4,5, comprese le condizioni di ondata di calore che generalmente portano a stress o sbiancamento nei coralli.

Le barriere coralline stanno diminuendo a livello globale a un ritmo accelerato. L'animale corallo ospita un consorzio di partner (tra cui dinoflagellati Symbiodiniaceae, funghi, batteri e virus), collettivamente denominati "olobionte"⁶. Con l'aumento delle temperature oceaniche, i coralli, e quindi le barriere coralline, sono sottoposti a una crescente pressione per sopravvivere, poiché le alte temperature portano alla perdita delle dinoflagellate Symbiodiniaceae (di seguito simbionti), un fenomeno noto come sbiancamento⁷. Molti nutrienti non sono altrimenti disponibili per i coralli nelle acque tropicali oligotrofiche, tra cui l'azoto inorganico e il fosforo⁸. Per far fronte a questa situazione, i coralli formano una simbiosi nutrizionale obbligata con i loro simbionti dinoflagellati (Symbiodiniaceae), che forniscono la maggior parte dei nutrienti necessari al corallo ospite per sopravvivere e depositare i loro scheletri di carbonato di calcio⁹. Una simbiosi funzionante può essere caratterizzata da alti livelli di condivisione del carbonio tra i partner ^10,11 e la regolazione della simbiosi comporta un'omeostasi dinamica¹².

Durante lo stress da calore, questa regolazione dinamica e la comunicazione vengono interrotte, con conseguente disbiosi e sbiancamento (esaminato nel riferimento¹³). Le misurazioni metaboliche, come la fotosintesi e la respirazione, hanno quindi il potenziale per chiarire sia gli stati sani che quelli disbiotici non regolati dei coralli, e misurare con precisione questi processi attraverso l'ontogenesi è fondamentale per comprendere il funzionamento dell'organismo. Ciò è particolarmente importante con l'aumento della frequenza e dell'entità degli eventi di sbiancamento di massa, con il potenziale di influenzare i cambiamenti nella condivisione dei nutrienti da parte dei simbionti, dove è stato riscontrato che il trasferimento di carbonio diminuisce con l'aumento delle temperature¹⁴. Ciò potrebbe essere dovuto a meccanismi diretti dal simbionte che sequestra i nutrienti o da compromessi fisiologici (aumento della tolleranza termica ma diminuzione della sopravvivenza dell'ospite 15,16,17). Le interruzioni della simbiosi possono derivare sia dal simbionte che dall'ospite, anche se un fattore principale è probabilmente il malfunzionamento cellulare del simbionte¹⁸. Tuttavia, lo stress causato dall'aumento delle temperature dell'acqua di mare destabilizza questa simbiosi; La condivisione del carbonio dal simbionte all'ospite è diminuita^19,20 e può verificarsi la fame del corallo. Ciò può riflettersi in una diminuzione delle riserve di lipidi e carboidrati nei coralli a causa dell'aumento dell'uso dell'ospite ("aumento del catabolismo del carbonio fisso"), probabilmente a causa della diminuita condivisione da parte dei simbionti¹¹. Oltre al contributo della fotosintesi e della respirazione dei simbionti dei coralli, la respirazione dell'animale corallo è una misura importante per comprendere la salute dei coralli, gli impatti dello sbiancamento e dello scambio di nutrienti tra questi partner e la crescita dell'olobionte, un fenotipo rilevante per sopravvivere ai cambiamenti ambientali ^8,21,22. Infine, dato che molti coralli sono simbiotici, l'uso della respirometria per caratterizzare la fotosintesi oltre alla respirazione è particolarmente utile per contestualizzare i rapporti P:R e capire se la simbiosi è stabile o meno (ad esempio, riferimento²³).

I cambiamenti ambientali, quindi, causano cambiamenti nei bilanci energetici del corallo e dei suoi simbionti, portando a differenze nella crescita¹⁴. Per far fronte a questa situazione, l'ospite corallo può aumentare la respirazione e l'utilizzo dei lipidi per soddisfare le sue richieste metaboliche; Lo stress da calore può ridurre la produttività netta del 60% a causa di questo aumento della respirazione¹⁴, misurato da una variazione dell'ossigeno disciolto. Le Symbiodiniaceae possono anche aumentare l'assimilazione dell'azoto e la ritenzione di carbonio^14,24, e quindi utilizzare queste riserve per spostare l'energia verso i propri meccanismi di riparazione e protezione^25,26. L'equilibrio di N e C è importante per regolare la crescita, e P in particolare²⁷, che può manifestarsi come una regolazione dinamica dell'abbondanza dei simbionti. In effetti, le prove raccolte dai coralli attraverso grandi distese di barriera corallina (>1.000 km) suggeriscono che gli ospiti hanno la capacità di limitare la crescita dei simbionti attraverso la regolazione di P, anche se questo varia a seconda delle specie di corallo²⁷.

Nel loro insieme, questi studi suggeriscono un aumento della tolleranza al calore con una concomitante diminuzione della produzione o della traslocazione di nutrienti (cioè la propensione alla simbiosi) a causa dei cambiamenti ambientali. Potenti metodi mono-giovanili, come la quantificazione dell'uso dell'ossigeno tramite micro-respirometria, dovrebbero quindi essere utilizzati per comprendere i meccanismi fondamentali relativi al metabolismo e quindi applicati a questioni di conservazione come la comprensione dell'acquisizione della tolleranza al calore. Questo è qui presentato come uno strumento di micro-respirometria per misure fisiologiche, destinato a indagare la relazione nutrizionale tra i giovani di corallo e i loro simbionti algali, ma adatto ad altri piccoli organismi marini.

L'uso o la produzione di ossigeno da parte degli organismi può essere misurato collocandoli in singole camere respirometriche ermeticamente sigillate o «respirometri» (di seguito "camere"), in cui la variazione di ossigeno viene misurata utilizzando optodi³. Gli optodi sono sonde che misurano la concentrazione di ossigeno utilizzando impulsi luminosi e la registrazione delle misurazioni nel tempo consente il calcolo dei tassi di respirazione e/o fotosintesi. In pratica, misurare la respirazione è simile alla misurazione della fotosintesi nei coralli, tranne per il fatto che i coralli vengono incubati nell'oscurità totale. Sottraendo la respirazione giornaliera totale del corallo e dei simbionti dalla fotosintesi giornaliera totale si ottiene un differenziale di ossigeno (delta di ossigeno)^2,3. Generalmente, gli organismi utilizzano più ossigeno di quello che producono, con conseguente deficit. Questo può essere convertito in equivalenti di carbonio poiché l'ossigeno e il carbonio vengono consumati in un rapporto fisso². Il surplus di carbonio può essere utilizzato dal corallo per la crescita, la sintesi e la riproduzione del muco e altre esigenze metaboliche essenziali¹².

Questo protocollo descrive un metodo di microrespirazione (Figura 1) che è stato impiegato per misurare la frequenza respiratoria (R) per i singoli giovani di corallo utilizzando una camera di vetro da 1,5 mL su misura (fiala con filettatura GL25 e alta 20 mm, con protuberanza/cresta, bordo piatto e tappo a vite con foro; vedi Tabella dei materiali) riempita con acqua di mare filtrata da 0,5 μm. Gli optodi a fibre ottiche (vedi Tabella dei materiali) sono stati inseriti in ciascuna camera attraverso un foro sul lato del coperchio. Ogni singolo corallo è stato fissato sopra una piattaforma a rete rigida, una piastra di agitazione a flusso continuo sopra una barra di agitazione magnetica per garantire un'adeguata miscelazione dell'acqua all'interno della camera. Nell'esempio rappresentativo qui, due controlli o "blank" (camere identiche tranne che per la presenza del campione) sono stati misurati contemporaneamente alle tre camere del campione replicato, poiché avevamo più controller in funzione contemporaneamente. Tuttavia, l'esempio di configurazione (Figura 2) mostra solo l'uso di quattro canali; Questo può essere aumentato utilizzando più controller e più supporti a flusso continuo. La temperatura può anche essere controllata in questo sistema immergendo ogni camera in un bagno d'acqua su misura con temperature dell'acqua preimpostate (27 °C per il controllo o 31 °C per lo stress ad alta temperatura nei dati di esempio qui) utilizzando un sistema a flusso continuo (flusso continuo e delicato impostato a 75 L/h). La piattaforma della piastra dell'agitatore e la piastra dell'agitatore con ingranaggi possono essere di qualsiasi dimensione e possono essere realizzate grandi o piccole a seconda delle esigenze per adattarsi al numero di camere di vetro. In questo esempio, la piattaforma e il piatto misuravano circa 34 cm x 26 cm x 3 cm (Tabella dei materiali). La calibrazione degli optodi è stata eseguita prima di ogni corsa utilizzando due soluzioni standard che rappresentano lo 0% e il 100% di saturazione di ossigeno alla temperatura dell'acqua e alla salinità appropriate per questo ambiente sperimentale.

Protocollo

1. Installazione di attrezzature e coralli all'interno delle camere di respirazione

NOTA: I coralli pronti per la riproduzione (cioè quelli che avevano fasci di uova/spermatozoi pigmentati rosati visibili da rametti frammentati delle colonie della specie Acropora tenuis ) sono stati rimossi dalla barriera corallina di Magnetic Island (19° 6.249'S; 146° 51.728'E) il giorno di luna piena nell'ottobre 2018 (numero di permesso: G12/35236.1), raccolti e portati in laboratorio per la deposizione delle uova dei coralli, dove sono stati allevati e cresciuti i coralli giovani.

1. Il giorno delle misurazioni, collegare le due piastre a bagnomaria utilizzando un tubo di polietilene blu e connettori (vedi Tabella dei materiali; Figura 1 [5], Figura 2A,B). Questi fungeranno da incubatrici dopo il collegamento con il politubo blu allo scaldabagno/refrigeratore. Assicurarsi che la piastra del motore sia chiaramente visibile attraverso le piastre trasparenti del bagno d'acqua quando le camere di respirometria non sono in posizione.
2. Collegare i due tubi allo scaldabagno/refrigeratore (vedi Tabella dei materiali). Accendere lo scaldabagno/refrigeratore e quindi impostare la temperatura sperimentale desiderata (27 °C o 31 °C).
3. Collegare la base del bagnomaria (passaggio 1.1) alla piastra del motore di base con gli ingranaggi magnetici (Figura 1 [6, 7] e Figura 3A), quindi collegare questo gruppo a una fonte di alimentazione (Figura 3B). Accendere la fonte di alimentazione per attivare gli ingranaggi, che attiveranno le barre di agitazione nelle camere.
4. Modulare il flusso d'acqua secondo necessità (ad es. flusso continuo e delicato impostato a 75 L/h con agitazione lenta a 30 giri/min) utilizzando le manopole del connettore della valvola (Figura 3C).
5. Per assemblare la camera di respirometria, aggiungere la microsfera magnetica (Figura 1 [1.5]) alla camera di vetro (Figura 1 [1.6]), quindi la base del supporto a flusso continuo in plastica opaca (Figura 1 [1.4]) nella camera di vetro (Figura 4A). La dimensione della camera e della perla magnetica dipenderà dall'organismo e dal sistema di studio di interesse.
   NOTA: Ci sono dei fori nella base in plastica per consentire il flusso e la circolazione dell'acqua dal movimento della perlina magnetica sul fondo.
6. Incollare il corallo con la colla per acquari (vedi Tabella dei materiali) alla fascetta nera posta nella base di plastica (Figura 4B-D). Per fare questo, per prima cosa, incolla il corallo giovanile a un pezzo di plastica nera, quindi incolla questo pezzo alla base di plastica. Una volta fissato saldamente il corallo (l'indurimento della colla è quasi istantaneo), avvitare il coperchio con l'O-ring (Figura 4A) sulla camera di vetro. Eseguire queste azioni sott'acqua in una bacinella separata per assicurarsi che non ci sia aria all'interno della camera di respirometria.
   NOTA: Il volume d'acqua nel respirometro (cioè il volume effettivo = 1,5 ml) è stato determinato attraverso l'immersione completa della camera sott'acqua. L'ipotesi è che, rispetto al volume d'acqua, lo spostamento dalla massa/densità del piccolissimo corallo sia trascurabile. La provetta per microcentrifuga da 1,5 mL è mostrata qui per la scala (Figura 4A).
7. Posizionare saldamente le camere nei bagni d'acqua (Figura 5A). Assicurarsi che le camere di vetro siano a contatto con l'acqua a temperatura controllata per l'esperimento.
8. Collegare i cavi in fibra ottica O₂ (vedi Tabella dei materiali) in modo che siano a contatto con i punti del sensore di ossigeno (di seguito denominati punti; vedere Tabella dei materiali) inserendoli nel foro praticato sul lato delle camere del coperchio. Questi piccoli punti sono sensibili all'ossigeno e rilevano e trasmettono il segnale dall'interno della camera attraverso il cavo in fibra ottica.
   1. Aggiungere del nastro idraulico (nastro bianco sottile autosigillante) per far aderire perfettamente il cavo e farlo rimanere saldamente all'interno della camera dell'acqua. Assicurarsi che il singolo corallo possa essere visto (come si vede nella Figura 5B), con i tentacoli marroni rivolti verso l'alto, all'interno della camera (Figura 5B, Video 1).
      NOTA: Le stime dei costi dei componenti dell'apparecchio sono fornite nella Tabella 1.

2. Procedura operativa standard per la misurazione della respirazione con il sistema O₂

1. Aprire il software di misurazione dell'ossigeno (vedere la tabella dei materiali).
2. Misurare la temperatura della stanza in cui verrà eseguita la calibrazione. Questo sarà necessario in seguito per la fase di calibrazione (passaggio 2.8).
3. Assemblare i sensori ottici e i tappi. A tale scopo, collegare tutte le fibre ottiche alla porta corrispondente nel modulo O₂ . Assicurati di far corrispondere il tappo 1 con il sensore 1, il cappuccio 2 con il sensore 2 e così via.
4. Per impostare le camere per la calibrazione, inumidire prima un pezzo di spugna pulita con un po' di acqua ad osmosi inversa (RO) e inserirlo in ciascuna camera.
   NOTA: La spugna non deve gocciolare, deve essere solo umida. Potrebbe gocciolare sul punto della fibra ottica. Assicurarsi che il punto non sia bagnato prima di procedere al passaggio successivo.
5. Capovolgere le camere con la fibra ottica corrispondente (Figura 6). Ciò consentirà di svitare la camera senza toccare la fibra ottica e aggiungere il solfito di sodio per la calibrazione dello 0%.
6. Controllare il segnale di ciascun sensore prima di iniziare la calibrazione. Scorrere tutte le schede dell'interfaccia software e controllare il valore del segnale (angolo in alto a sinistra) (Figura 7A), assicurandosi che non varino in modo significativo. Consultare il manuale O₂ per i valori accettabili per la configurazione sperimentale (a seconda dell'organismo e delle condizioni di interesse). Per questa configurazione specifica, a una temperatura ambiente di 25,3 °C, è accettabile un FTC (flusso spot del sensore di ossigeno attraverso l'intervallo normale della cella) di 20,59 con il segnale a 179,5.
7. Apri Programma e controlla le impostazioni nel software per confermare che siano corrette come descritto di seguito. Se la finestra pop-up non viene visualizzata immediatamente dopo l'apertura del programma, è possibile fare clic sul pulsante Impostazioni nell'angolo in basso a sinistra dell'interfaccia del software.
8. Verificare che il sensore di temperatura esterna sia attivato (Figura 7B). Modificare l'impostazione su Temperatura fissa (Figura 7C). Quindi, aggiungere il valore della temperatura ambiente e fare clic su copia impostazione su tutti gli altri canali.
9. Modificate l'impostazione su Riduci deriva segnale (Reduce Signal Drift) (Riduci deriva segnale ) (Figura 7C). Quindi, selezionare Impostazioni sensore e selezionare il livello 2. In caso contrario, se si utilizzano piccoli volumi, la deriva sarà così elevata che sarà difficile da calibrare.
10. Controllare le impostazioni generali dei canali. Premere Ok se necessario. Fare clic su Copia impostazioni in tutti i canali, quindi fare clic su OK.
11. Calibrare i sensori. Per la calibrazione del canale 1, andare alla scheda Canale 1 e premere il pulsante Calibra. Selezionare 2 punti in acqua o aria umida.
12. Per la calibrazione "dell'aria", immergere un pezzo di schiuma in acqua, posizionarlo all'interno della camera e attendere che il segnale si stabilizzi (vedere le immagini di calibrazione dell'aria prima e dopo). Quando è stabile, premere "set air". Fare clic su aria > Calibra > impostare l'aria.
13. Impostare la calibrazione 0% e 100% (Figura 7D). Rimuovere la camera dal tappo e posizionarla nel tappo successivo in modo che il segnale di calibrazione dell'aria sia pronto al termine della calibrazione dello 0% nel primo sensore. Utilizzare una pipetta di trasferimento e riempire il tappo con solfito di sodio al 2%. Attendere che il segnale si stabilizzi.
    NOTA: Il segnale di solito impiega più tempo per stabilizzarsi rispetto alla calibrazione dell'aria. Se viene visualizzato un messaggio di avviso che indica che i valori sono al di fuori dell'intervallo tipico, assicurarsi che il solfito di sodio sia fresco. Ripetere lo stesso processo di calibrazione per tutti i canali. Preparare il solfito di sodio aggiungendo 2 g in 100 mL di acqua RO.
14. Una volta completata la calibrazione, sciacquare bene le camere di respirazione e asciugare le camere e i tappi. Assicurarsi che non ci sia acqua nel foro della fibra ottica.
15. Posizionare l'organismo (in questo esempio i singoli giovani di corallo) all'interno delle camere di respirazione e chiudere con i coperchi. Quando si posizionano i coperchi, assicurarsi di farlo quando le camere sono completamente sommerse e non c'è assolutamente aria all'interno.
16. Posizionare saldamente le camere nella piastra di agitazione e collegare le fibre ottiche.
17. Accendere l'alimentazione. Assicurarsi che l'acqua all'interno delle camere venga miscelata completamente. Impostare la temperatura nel refrigeratore/riscaldatore alle temperature sperimentali scelte.
18. Accendere la pompa e il riscaldatore (passaggi 1.2 e 1.4).
19. Premere log sull'interfaccia del software di misura O₂ per avviare la registrazione.

Risultati

Elaborazione e analisi dei dati
Sebbene esistano numerosi metodi per elaborare i dati grezzi degli esperimenti di respirometria, si consiglia di utilizzare il pacchetto R respR²⁸. In linea con la condivisione dei protocolli di cui sopra, che sostengono la scienza aperta e la riproducibilità, questo pacchetto consente di condividere l'elaborazione e l'analisi dei dati in una forma facilmente riproducibile ed è stato progettato tenendo conto di questo. Si tratta di una piattaforma gratuita e open source e indipendente dal sistema di sonde e facilmente installabile da CRAN o GitHub. Il codice completo e gli esempi per respR sono mantenuti e possono essere trovati all'indirizzo https://github.com/januarharianto/respR.

Il pacchetto respR dispone di funzioni per importare, visualizzare ed eseguire il controllo di qualità sui dati della respirometria e per calcolare la frequenza respiratoria automaticamente o da regioni scelte manualmente. Può anche regolare i tassi per la respirazione di fondo e i tassi di conversione in unità di uscita comunemente usate. I passaggi per elaborare i dati dal sistema di micro-respirometria sono descritti di seguito. In questo studio, i dati del sistema di respirometria sono stati utilizzati come esempio, ma il pacchetto accetta anche input dalla maggior parte dei sistemi di sonde di ossigeno disponibili in commercio, nonché oggetti dati R generici. Maggiori dettagli sul pacchetto, inclusa la documentazione completa e le esercitazioni, sono disponibili sul sito Web del pacchetto all'indirizzo https://januarharianto.github.io/respR/index.html.

Importazione di dati grezzi
Il file di output non elaborato (.txt) viene importato. respR riconosce il formato e lo analizza in un frame di dati R generico che può essere usato nelle funzioni successive. Tuttavia, è importante notare che questo è facoltativo; questi file e praticamente tutti i dati delle serie temporali dell'ossigeno possono anche essere importati utilizzando le funzioni di base (fornite di seguito) da chiunque abbia una conoscenza di base di R.

#load respR
Libreria(respR)

#Import ---
Dati <- import_file("file.txt")
#Firesting rilevato un file Pryo

Ispezione e visualizzazione dei dati
Una parte vitale di qualsiasi attività di analisi dei dati consiste nel tracciare e ispezionare i dati per cercare anomalie o modelli evidenti, o anche solo per aiutare a comprenderli. In questo caso viene utilizzata la funzione inspect (Figura 8A), che verifica la presenza di problemi comuni ai dati di respirometria, ad esempio valori non numerici o mancanti.

#inspect una singola colonna di ossigeno
Insp <-inspect(dati, tempo = 3, ossigeno = 8, larghezza = 0,2)

Questa funzione traccia anche le serie temporali dell'ossigeno e calcola una velocità mobile (pannello inferiore) per aiutare a chiarire come questa velocità può cambiare nel corso dell'esperimento. Questi grafici a velocità mobile aiutano a fornire informazioni su quali regioni di tali curve di velocità devono essere estratte. Nel caso di tassi metabolici standard o di routine, le regioni desiderate sono quelle in cui il tasso mostra stabilità (ad esempio, dopo circa 3.000 punti; Figura 8B).

In questo caso, la diminuzione dell'ossigeno diventa rilevabile solo dopo circa la riga 200 nel pannello completo delle serie temporali. Modelli come questo sono molto comuni nei dati di respirometria; C'è spesso un lungo periodo di instabilità all'inizio di un esperimento, quando il sistema si stabilizza e il campione si acclimata alle condizioni sperimentali. Si consiglia di estrarre i tassi dalle serie temporali solo dopo questa instabilità iniziale, il che evidenzia anche l'importanza delle visualizzazioni.

Tassi di estrazione
respR ha due funzioni per l'estrazione della frequenza respiratoria. La prima è la funzione calc_rate(), che consente di estrarre manualmente una velocità specificando una regione di tempo, una riga o un livello di ossigeno. Questo è molto comune nelle analisi respirometriche ed è un metodo perfettamente accettabile per determinare un tasso, a condizione che i criteri di selezione siano decisi e applicati in modo coerente²⁸.

Un modo più robusto e oggettivo consiste nell'utilizzare la funzione auto_rate(), che identifica le regioni lineari dei dati. Queste regioni sono quelle di frequenze respiratorie costantemente sostenute, assegnate automaticamente utilizzando l'apprendimento automatico. Questa funzione è utile anche per la rilevazione di segnali bassi (come nei campioni utilizzati in questo studio, a causa della bassa biomassa a questa età). Questa funzione consente di identificare le percentuali più lineari, minime e massime utilizzando metodi indipendenti, oggettivi e statisticamente robusti²⁸. L'esempio qui identifica un'area lineare che si verifica da circa i punti temporali da 3.000 a 5.000. Va notato che possono essere identificate più regioni lineari, ma questa sezione è la regione con il punteggio più alto, o la più lineare, (Figura 8C).

#Determine tasso più lineare (cioè coerente)
Tasso <-auto_rate(INSP)

Regolazione dello sfondo
I tassi di fondo degli esperimenti di controllo possono essere determinati in modo simile all'esempio precedente e possono essere utilizzati per regolare i tassi dei campioni utilizzando la funzione adjust_rate() (Figura 9A; si noti che l'analisi completa non è mostrata qui, ma solo la regolazione). Esempi completi sono dettagliati sul sito web di respR .

#Adjust tasso per lo sfondo
rate_adj <-adjust_rate(tasso, di = bg) #saved oggetto bg
stampa(rate_adj)

Tassi di conversione
Il passaggio finale consiste nel convertire le velocità nelle unità di output desiderate, utilizzando le unità originali dei dati grezzi, il volume effettivo del respirometro e altri dati sperimentali, inclusa la normalizzazione in misurazioni in bianco (Figura 9B). L'output può essere una frequenza respiratoria assoluta, cioè dell'intero campione, o una frequenza specifica della massa o della superficie. Il tasso specifico dell'area superficiale è stato l'output utilizzato qui, che in particolare è il tasso assoluto diviso per l'area superficiale del provino (Figura 9C).

Come discusso in precedenza, questo sistema è stato sviluppato per misurare campioni molto piccoli. Pertanto, ci aspettavamo valori bassi e potenziali sovrapposizioni con le misurazioni in bianco. Ci si aspetta un certo livello di segnale all'interno dei blank e, quando esaminati, questi valori rientrano nell'intervallo previsto di rumore sperimentale generale, probabilmente a causa della deriva della sonda, di lievi variazioni di temperatura o di bolle sulle sonde. Per progettazione e a causa delle piccole dimensioni del campione, e quindi del piccolo volume effettivo utilizzato, l'uso di pezzi grezzi è particolarmente importante qui, soprattutto per ogni tiratura. I valori rappresentativi sono stati inclusi qui come esempio (Figura 10). Date le dimensioni ridotte del campione, si consiglia l'uso dei grezzi ad ogni corsa per standardizzare le misurazioni per ogni corsa.

Questi valori vuoti vengono quindi utilizzati per standardizzare i valori delle misurazioni del trattamento. Dato che i coralli respirano oltre a produrre ossigeno, il tasso metabolico può variare da valori negativi a positivi. Di seguito è riportato un esempio di risultati rappresentativi dell'intervallo di valori respiratori rilevati dallo strumento di microrespirazione. Questi risultati sono stati determinati da un esperimento di successo su singoli giovani di corallo (Figura 10). Nel complesso, ci si aspettava che la respirazione fosse difficile da rilevare in questo set di dati di esempio (in base alla progettazione), date le piccole dimensioni dei campioni; Ciò sottolinea il valore di questo metodo nell'acquisizione di questa soglia di segnale basso. Questi risultati rappresentativi mostrano la respirazione al buio alle dimensioni più piccole dei campioni testati, sottolineando la soglia minima di rilevamento di questo sistema. Abbiamo anche misurato in due condizioni (controllo e stress ad alta temperatura). Dopo la standardizzazione dei grezzi misurati per corsa, i valori variavano da vicino a zero (controllo) a una mediana di ~-^5e-5 per il trattamento dello stress. Come previsto, la respirazione era bassa. Questi risultati mostrano chiaramente valori rappresentativi per i bianchi, nonché un confronto tra controllo e alta temperatura per questi campioni molto piccoli.

Figura 1: Rappresentazione schematica del nuovo strumento di micro-respirometria per la caratterizzazione fisiologica dell'olobionte del corallo (animale corallo + simbionti) o di qualsiasi piccolo organismo (<1 mm). Sono state realizzate camere di respirometria personalizzate (numero 1; 1.1-1.6). Questi includono coperchi (1.1) con punti per sensori di ossigeno (1.2) e il singolo novellame (1.3) è posizionato su un supporto a flusso continuo (1.4) posto sopra un agitatore magnetico (1.5), che si inserisce tutti all'interno della camera di vetro (1.6). Il controller (2) è collegato allo spot con un cavo in fibra ottica che si inserisce nel coperchio (1) e collegato al computer (3). Il riscaldatore/refrigeratore (4) si collega alla piastra respirometrica (5) con l'acqua a flusso continuo (indicata dalle frecce a farfalla per la direzione), che si trova sopra la piastra dell'agitatore (6) con ingranaggi (7), alimentati dal motore (8) e dall'alimentazione (9). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Configurazione della micro-respirometria. Sono disponibili diverse opzioni, tra cui (A) una piastra respirometrica o (B) collegata a più piastre. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Piastra di agitazione magnetica costruita su misura sulla parte superiore della piastra di respirometria. Ogni camera ha (A) un ingranaggio di agitazione magnetica sottostante, (B) alimentato da un motore, con (C) la piastra di respirometria collegata tramite tubo al riscaldatore/refrigeratore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Configurazione personalizzata della camera di respirometria. (A) Componenti (da sinistra a destra: coperchio, flaconcino di vetro, supporto, provetta da 1,5 ml per bilancia e barra di agitazione). (B) Singolo supporto a flusso continuo all'interno del quale si trova il campione. (C) Vista dall'alto verso il basso del supporto a scorrimento. (D) e con il supporto posto all'interno del flaconcino di vetro con il coperchio avvitato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Fiale di vetro posizionate all'interno della piastra di agitazione. (A) Piastra di agitazione costruita su misura con (B) un primo piano dell'intera fiala di vetro con la configurazione del coperchio. Il corallo giovanile può essere visto attraverso il coperchio qui (punto marrone), sopra la fascetta, con la fibra ottica posizionata nell'apertura del coperchio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Camere capovolte, pronte per la calibrazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Passaggi chiave del software di misurazione dell'ossigeno. (A) Controllare il segnale di ciascun sensore. Un segnale ottimale per questo studio e per i sensori è mostrato nel punto del sensore di ossigeno FTC (intervallo normale). (B) Controllare la deriva del segnale. (C) Impostare e controllare le temperature di trattamento. (D) Impostare e controllare le calibrazioni 0% e 100%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: fasi dell'output dell'analisi respR I. (A) Ispezionare il comando e l'output. (B) Verificare la stabilità della velocità. (C) Determinare il tasso più lineare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Fasi II dell'output dell'analisi respR . (A) Regolare la velocità per lo sfondo, (B) Convertire e (C) controllare le tariffe. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Risultati rappresentativi prodotti dallo strumento di micro-respirometria. Respirazione mediana (O₂ ± errore standard) dei singoli giovani di corallo replicati, compresi i valori in bianco e la respirazione di individui sotto controllo e in condizioni di stress ad alta temperatura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Vista dall'alto verso il basso della camera di respirometria con il corallo giovane all'interno durante una sessione di misurazione. Clicca qui per scaricare questo video.

Tabella 1: Stime dei costi dei componenti dell'apparato respirometrico. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Questo lavoro delinea la costruzione di una configurazione di micro-respirometria su misura che può essere utilizzata per quantificare la quantità di ossigeno consumata e prodotta da piccoli organismi acquatici sessili. I componenti critici di questo protocollo includono la configurazione delle camere, compresi gli spot, e la calibrazione del segnale basso utilizzando il pacchetto respR , in cui un segnale basso può essere definito come velocità tipiche di pendii poco profondi o rumorosi. La camera personalizzata e la sua configurazione consentono il rilevamento anche di segnali bassi, mentre l'uso del pacchetto R aiuta a proteggersi da problemi in cui il verificarsi di pendii poco profondi o rumorosi potrebbe portare a un'errata interpretazione dei risultati (ad esempio, falsi positivi).

Le potenziali modifiche che saranno necessarie per altri utenti includono la messa in sicurezza dell'organismo di interesse all'interno della camera personalizzata. In questo caso, sono stati utilizzati una piccola fascetta rigida e una colla per acquari per fissare il singolo giovane alla base di plastica, che è stata poi incollata alla fascetta. Va notato che, per questo esperimento, i giovani di corallo sono stati sistemati su teli di plastica nera. Questa plastica ha permesso una facile rimozione dei giovani di corallo, che sono scivolati via dalla plastica, in modo da non danneggiarli fisicamente durante la rimozione. I novellami di corallo si fissano al substrato su cui si depositano, quindi si consiglia di depositarli su materiale plastico simile, utilizzando un peptide^{artificiale 16} per facilitarne la rimozione per il processo di incollaggio. Per ridurre ulteriormente lo stress da manipolazione e l'impatto sulla risposta respiratoria, si raccomanda di consentire ai coralli montati su fascette di acclimatarsi per 1-2 settimane, come è comune in molti esperimenti di stress sui coralli adulti. Potrebbero essere necessarie altre modifiche per fissare l'organismo sopra il punto nel coperchio e per consentire la circolazione dell'acqua. Un'altra fase chiave per la risoluzione dei problemi riguarda il rilevamento del segnale, in particolare sulla pendenza della serie temporale dell'ossigeno in cui devono essere determinati i tassi. In definitiva, ciò si riduce a una combinazione di utilizzo del buon senso per escludere dati ovviamente instabili e funzioni all'interno di respR per consentire l'estrazione di tassi da regioni scelte in modo coerente o automaticamente identificando regioni lineari dei dati. Ulteriori esempi di come farlo sono disponibili sul sito web di respR .

Questo metodo è stato sviluppato per estendere le misurazioni del limite inferiore della respirazione a invertebrati marini estremamente piccoli e sessili. L'ovvia limitazione è che questo protocollo può essere più incline ai falsi positivi rispetto ai protocolli progettati per biomasse più grandi. Tuttavia, dato che questo era lo scopo del progetto, misurare questi limiti inferiori, questo è stato preso in considerazione nella progettazione e la procedura può essere utilizzata con il pacchetto respR per proteggersi meglio dai falsi positivi. È anche importante riconoscere che esistono altri sistemi per misurare la respirazione³⁰ e la misurazione di piccoli organismi, inclusa la respirometria su singoli copepodi³¹ in volumi più piccoli di questo (~0,5-1 mL), ma sono costosi o mancano di componenti specifici (capacità di agitazione). Tuttavia, questo sistema è open-source e di costo relativamente basso rispetto ai sistemi commerciali (ad esempio, il sistema Core Microplate). Questo sistema incorpora anche considerazioni metodologiche chiave come l'agitazione, che altri sistemi potrebbero non avere. La funzione di barra di agitazione interna è essenziale per replicare il naturale rimescolamento dell'acqua di molti organismi marini (ad esempio, i copepodi attraverso il nuoto), che spesso non è possibile e può rendere i dati in gran parte inutilizzabili. Al contrario, altri metodi di miscelazione disponibili prevedono il posizionamento dell'intero respirometro su un gigantesco banco a bilanciere, che richiede attrezzature aggiuntive e ha un successo limitato nella miscelazione, o la miscelazione tramite vibrazione, che può causare disturbi all'organismo. Per questo motivo, questo è l'unico sistema in grado di eseguire respirometria su coralli giovani o altri organismi sessili molto piccoli. A titolo di riferimento, l'intervallo di dimensioni degli esemplari qui inclusi variava da 2,1 a 3,6 polipi (corrispondenti a pochi mesi di età), con un'area media da minima a massima compresa tra 1,3 e 4,5 mm².

La respirometria è una misura fondamentale negli studi ecologici ed esistono molti metodi per questo scopo. La maggior parte di questi metodi esistenti, tuttavia, si rivolge a campioni ad alta biomassa, tra cui pesci interi, frammenti di corallo o fanerogame marine 32,33,34. Questo metodo è il primo a utilizzare singoli giovani di corallo. Inoltre, ci sono molte potenziali applicazioni per questo metodo, in quanto fornisce informazioni fisiologiche chiave sul funzionamento dell'organismo. Questo può essere importante per gli studi che cercano di caratterizzare le stime di salute di base³⁵, comprendere il ruolo dello stress acuto o a lungo termine durante l'ontogenesi dei coralli come lo stress da calore³⁶ o fornire soglie che i gestori possono impostare per aiutare a proteggere e migliorare la salute delle barriere coralline³⁷. Dato che il corallo è un olobionte e la comunità simbionte è relativamente flessibile in questa fase e per tutto il primo anno di vita³⁸, sarebbe interessante accoppiare i dati di respirometria con i cambiamenti nelle comunità nel tempo, per contestualizzare completamente il funzionamento dell'organismo nel suo complesso. È importante sottolineare che questo metodo contribuisce alle tecniche di "scienza aperta" che aiutano a fornire uno schema per la creazione di configurazioni sperimentali personalizzate che possono essere condivise, migliorate e standardizzate apertamente.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Cost
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers	LabGlass Party Ldt.	1.5 ml	$407.26
1.1 lids	AIMS workshop	Vial GL25 thread	~$10
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes)	PyroScience	Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947	$41.25 AUD each
1.3 individual organism	NA	NA	NA
1.4 flow-through stand	AIMS workshop	Custom	included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through
1.5 magnetic stirrer	Any manufactuer is suitable	NA	~$2?
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD)	Labglass Pty Ltd, Stafford QLD	Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole	$50.9 AUD
2 FireSting controller (2)	PyroSciences	NA	4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here.
3 computer	NA	NA	NA
4 heater/chiller	VWR International	NA	Small models around $4,000 AUD
5 respirometry plate platform	AIMS workshop	34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers)	$1250 AUD
6 stirrer plate with gears (7)	AIMS workshop	34 cm x 26 cm x 3 cm	$1250 AUD
8 powered by the motor	AIMS workshop	Custom	$700 AUD
9 power supply	Non-specific	NA	~$300 AUD
Aquarium glue	Seachem reef glue	20g	$14
Oxygen Logger Software	PyroScience	NA	NA
Polypipe and connectors	John Guest	NA	$20
Sodium Sulfite	Sigma	S0505-250G (CAS number 7757-83-7)	$54