Yeni Bir Mikro-Respirometri Aracı Kullanılarak Mercan Holobiontunun Fizyolojik Karakterizasyonu

Özet

Bu protokol, mercan holobiontunun fizyolojik özelliklerini araştırmak için kullanılabilecek bir mikro-respirometri sisteminin kurulumunu ve çalıştırılmasını açıklar.

Özet

Enerji içeren organizma süreçlerinin toplamı olarak tanımlanan metabolik aktivite, dünyadaki yaşamın işlevini ve evrimini anlamada kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, organizmaların metabolik hızlarının ölçülmesi, organizmaların fizyolojik durumlarını, ekolojik rollerini ve çevresel değişimin karasal ve sucul ekosistemlerdeki türler üzerindeki etkisini açıklamanın merkezinde yer almaktadır. Mercan resiflerinde, mercanlar ve zorunlu alg simbiyontları (Symbiodiniaceae) arasındaki simbiyoz işleyişini ölçmek ve iklim değişikliği de dahil olmak üzere çevresel stres faktörlerinin mercan sağlığını nasıl etkileyeceğini değerlendirmek için metabolizma ölçümleri kullanılmıştır. Bu öneme rağmen, muhtemelen küçük boyutlarından dolayı mercan yavrularında metabolik hız ölçümleri ile ilgili yöntem ve dolayısıyla veri eksikliği vardır. Bu boşluğu gidermek için bu çalışma, küçük (milimetre boyut aralığında) deniz hayvanı ekolojilerinin solunumunu ölçmek için özel bir kurulum geliştirmeyi amaçladı. Bu düşük maliyetli ve kolay kurulum, metabolik hızın daha iyi ölçülmesine izin vermelidir. Bu, resif restorasyonu için mercanların cinsel üretimini kullanan uygulamalı ekolojik araştırmalar için gerekli olacaktır.

Giriş

Solunum, bir organizmanın genel metabolik aktivitesini işaret eden kritik bir biyolojik ölçümdür, ancak diğer kritik özellikler (büyüme) gibi, küçük organizmalarda ölçülmesi zordur¹. Solunum, organik moleküllerin oksijen kullanılarak oksidasyonu olarak tanımlanabilir. Bu süreç, organizmaların hayatta kalması için gerekli olan hücresel işlev (yani metabolizma) için gerekli olan kimyasal enerjiyi üretir. Alternatif olarak, anaerobik metabolizma oksijen borcu² ile sonuçlanır. Solunum hızları, genellikle respirometri³ olarak bilinen bir uygulama olan kapalı bir odada zaman içinde oksijen konsantrasyonunun kullanımını (ve dolayısıyla azalmasını) ölçen optodlar kullanılarak belirlenebilir. Organizmaların çoğunluğunun oksijen depolamadığı göz önüne alındığında, metabolizma hızı, solunum ve karbon kullanımı arasındaki doğrudan korelasyon yoluyla çıkarılabilir. Bu nedenle, solunum hızları, genellikle mercanlarda strese veya ağartmaya yol açan sıcak hava dalgası koşulları da dahil olmak üzere, büyüme, üreme ve çevresel stres ^4,5 zamanlarında metabolik homeostazı sürdürme yeteneği gibi kritik metabolik işlevleri bilgilendiren günlük karbon kullanımına dönüştürülebilir.

Mercan resifleri küresel olarak hızlanan bir oranda azalmaktadır. Mercan hayvanı, topluca "holobiont" olarak adlandırılan bir ortaklar konsorsiyumuna (dinoflagellat Symbiodiniaceae, mantarlar, bakteriler ve virüsler dahil) ev sahipliği ^yapar6. Okyanus sıcaklıkları arttıkça, mercanlar ve dolayısıyla mercan resifleri, yüksek sıcaklıklar ağartma⁷ olarak bilinen bir fenomen olan dinoflagellat Symbiodiniaceae'nin (bundan sonra simbiyontlar olarak anılacaktır) kaybına yol açtığından, hayatta kalmak için artan bir baskı altındadır. İnorganik azot ve fosfor⁸ dahil olmak üzere oligotrofik tropikal sulardaki mercanlar için birçok besin maddesi mevcut değildir. Başa çıkmak için mercanlar, mercan konağının hayatta kalması ve kalsiyum karbonat iskeletlerini biriktirmesi için ihtiyaç duyduğu besinlerin çoğunu sağlayan dinoflagellat simbiyontları (Symbiodiniaceae) ile zorunlu bir beslenme simbiyozu oluşturur⁹. İşleyen bir simbiyoz, ortaklar arasında yüksek düzeyde karbon paylaşımı ile karakterize edilebilir^10,11 ve simbiyozun düzenlenmesi dinamik bir homeostazı^{içerir 12}.

Isı stresi sırasında, bu dinamik düzenleme ve iletişim bozulur, bu da disbiyoz ve ağartma ile sonuçlanır (referans^13'te gözden geçirilmiştir). Bu nedenle, fotosentez ve solunum gibi metabolik ölçümler, mercanların hem sağlıklı hem de düzenlenmemiş, disbiyotik durumlarını aydınlatma potansiyeline sahiptir ve bu süreçleri ontogenez boyunca doğru bir şekilde ölçmek, organizma işleyişini anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu, kitlesel ağartma olaylarının sıklığı ve büyüklüğü arttıkça özellikle önemlidir ve sıcaklıklar arttıkça karbon transferinin azaldığı tespit edilen simbiyontlardan besin paylaşımındaki değişiklikleri etkileme potansiyeli vardır¹⁴. Bu, simbiyont ayırıcı besinler tarafından yönlendirilmiş mekanizmalardan veya sert fizyolojik ödünleşimlerden kaynaklanabilir (artan termal tolerans, ancak konakçı sağkalımında bir azalma 15,16,17). Simbiyozdaki bozulmalar hem simbiyondan hem de konakçıdan kaynaklanabilir, ancak önde gelen bir faktör muhtemelen simbiyontun hücresel arızalanmasıdır¹⁸. Bununla birlikte, deniz suyu sıcaklıklarındaki artışların neden olduğu stres bu simbiyozu istikrarsızlaştırır; Ortakyaşamdan konakçıya karbon paylaşımı^{azalır 19,20} ve mercanın açlığı ortaya çıkabilir. Bu, muhtemelen simbiyontlar¹¹ tarafından azalan paylaşımdan dolayı, artan konakçı kullanımı ("sabit karbonun artan katabolizması") nedeniyle mercanlardaki azalan lipit ve karbonhidrat depolarına yansıyabilir. Mercanların simbiyontlarının fotosentezi ve solunumunun katkısının yanı sıra, mercan hayvanının solunumu mercan sağlığını, bu ortaklar arasındaki ağartma ve besin alışverişinin etkilerini ve çevresel değişimden sağ çıkmakla ilgili bir fenotip olan holobiontun büyümesini anlamak için önemli bir önlemdir ^8,21,22. Son olarak, birçok mercanın simbiyotik olduğu göz önüne alındığında, solunuma ek olarak fotosentezi karakterize etmek için respirometrinin kullanılması, P: R oranlarını bağlamsallaştırmak ve simbiyozun stabil olup olmadığını anlamak için özellikle yararlıdır (örneğin, referans²³).

Bu nedenle çevresel değişiklikler, mercanların ve simbiyotlarının enerji bütçelerinde kaymalara neden olarak büyümede farklılıklara yol açar¹⁴. Başa çıkmak için mercan konakçısı, metabolik taleplerini karşılamak için solunum ve lipit kullanımını artırabilir; Isı stresi, çözünmüş oksijendeki bir değişiklikle ölçüldüğü gibi, bu artan solunum¹⁴ nedeniyle net üretkenliği %60 oranında azaltabilir. Symbiodiniaceae ayrıca nitrojen asimilasyonunu ve karbon tutulmasını^14,24 artırabilir ve daha sonra bu rezervleri enerjiyi kendi onarım ve koruyucu mekanizmalarına^{kaydırmak için kullanabilir 25,26}. N ve C'nin dengesi, büyümenin düzenlenmesi için önemlidir ve özellikle P, simbiyont bolluğunun dinamik bir düzenlemesi olarak ortaya çıkabilen²⁷. Gerçekten de, büyük resif genişliklerinde (>1.000 km) mercanlardan toplanan kanıtlar, konakçıların mercan türlerine göre değişmekle birlikte, P'nin düzenlenmesi yoluyla simbiyont büyümesini sınırlama kapasitesine sahip olduğunu göstermektedir²⁷.

Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar, çevresel değişiklikler nedeniyle besinlerin üretiminde veya yer değiştirmesinde (yani simbiyoz eğilimi) eşzamanlı bir azalma ile birlikte bir ısı toleransı kazanımı olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, mikro-respirometri yoluyla oksijen kullanımını ölçmek gibi güçlü tek juvenil yöntemler, metabolizma ile ilgili temel mekanizmaları anlamak için kullanılmalı ve daha sonra ısı toleransı kazanımını anlamak gibi koruma sorularına uygulanmalıdır. Bu, burada mercan yavruları ve alg simbiyontları arasındaki beslenme ilişkisini sorgulamayı amaçlayan, ancak diğer küçük deniz organizmaları için uygun olan fizyolojik önlemler için bir mikro-respirometri aracı olarak sunulmaktadır.

Oksijenin organizmalar tarafından kullanımı veya üretimi, oksijen değişiminin optodlar³ kullanılarak ölçüldüğü bireysel, hermetik olarak kapatılmış respirometri odalarına veya 'respirometrelere' (bundan sonra odalar olarak anılacaktır) yerleştirilerek ölçülebilir. Optodlar, ışık darbeleri kullanarak oksijen konsantrasyonunu ölçen problardır ve zaman içindeki ölçümlerin kaydedilmesi, solunum ve/veya fotosentez oranlarının hesaplanmasına olanak tanır. Uygulamada, solunumun ölçülmesi, mercanların tamamen karanlıkta inkübe edilmesi dışında, mercanlardaki fotosentezin ölçülmesine benzer. Mercan ve simbiyontların toplam günlük solunumunun toplam günlük fotosentezden çıkarılması, bir oksijen diferansiyeli (oksijen deltası) ile ^{sonuçlanır2,3}. Genel olarak, organizmalar ürettiklerinden daha fazla oksijen kullanırlar ve bu da bir eksikliğe neden olur. Oksijen ve karbon sabit bir oranda tüketildiği^{için bu karbon} eşdeğerlerine dönüştürülebilir 2. Karbon fazlası mercan tarafından büyüme, mukus sentezi ve üreme ve diğer temel metabolik ihtiyaçlar için kullanılabilir¹².

Bu protokol, 0,5 μm filtrelenmiş deniz suyu ile doldurulmuş özel yapım 1,5 mL cam hazne tasarımı (GL25 dişli ve 20 mm yüksekliğinde, yumru / çıkıntılı, düz zeminli kenarlı ve delikli vidalı kapaklı şişe; Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak bireysel mercan yavruları için solunum hızlarını (R) ölçmek için kullanılan bir mikro solunum yöntemini (Şekil 1) açıklar. Fiberoptik optodlar (Malzeme Tablosuna bakınız) kapağın yan tarafındaki bir delikten her odaya yerleştirildi. Her bir mercan, hazne içinde suyun yeterli şekilde karışmasını sağlamak için manyetik bir karıştırma çubuğunun üzerindeki sert bir ağ, akışlı karıştırma plakası platformunun üzerine tutturuldu. Buradaki temsili örnekte, aynı anda çalışan birden fazla kontrolörümüz olduğundan, iki kontrol veya "boşluk" (numunenin varlığı dışında aynı olan odalar), üç kopya numune odasına aynı anda ölçüldü. Ancak, kurulum örneği (Şekil 2) yalnızca dört kanalın kullanımını gösterir; Bu, birden fazla kontrolör ve birden fazla akış standı kullanılarak artırılabilir. Bu sistemde sıcaklık, her bir odayı önceden ayarlanmış su sıcaklıklarına (kontrol için 27 °C veya buradaki örnek verilerdeki yüksek sıcaklık gerilimi için 31 °C) sahip özel yapım bir su banyosuna daldırarak bir devridaim akışı (75 L/s'ye ayarlanmış sürekli, yumuşak akış) sistemi kullanarak da kontrol edilebilir. Karıştırıcı plaka platformu ve dişlili karıştırıcı plakası herhangi bir boyutta olabilir ve cam hazne sayısını karşılamak için gerektiği kadar büyük veya küçük yapılabilir. Bu örnekte, platform ve plaka yaklaşık 34 cm x 26 cm x 3 cm idi (Malzeme Tablosu). Optodların kalibrasyonu, bu deney ortamı için uygun su sıcaklığı ve tuzlulukta %0 ve %100 oksijen doygunluğunu temsil eden iki standart çözelti kullanılarak her çalıştırmadan önce gerçekleştirildi.

Protokol

1. Solunum odalarında ekipman ve mercanların kurulumu

NOT: Üremeye hazır mercanlar (yani, Acropora tenuis kolonileri türünden parçalanmış dalcıklardan görülebilen pembemsi pigmentli yumurta / sperm demetlerine sahip olanlar) Manyetik Ada'daki resiften çıkarıldı (19 ° 6.249'S; 146 ° 51.728'E) Ekim 2018'de dolunay gününde (izin numarası: G12 / 35236.1), toplandı ve mercan yumurtlaması için laboratuvara getirildi, genç mercanların yetiştirildiği ve yetiştirildiği yer.

1. Ölçüm gününde, iki su banyosu plakasını mavi polypipe ve konektörler kullanarak bağlayın (bkz. Şekil 1 [5], Şekil 2A,B). Bunlar, mavi polypipe ile su ısıtıcısına/soğutucuya bağlandıktan sonra inkübatör görevi görecektir. Respirometri odaları yerinde değilken motor plakasının şeffaf su banyosu plakalarından net bir şekilde görülebildiğinden emin olun.
2. İki hortumu su ısıtıcısına/soğutucuya bağlayın ( Malzeme Tablosuna bakın). Su ısıtıcısını/soğutucuyu açın ve ardından istenen deneysel sıcaklığı (27 °C veya 31 °C) ayarlayın.
3. Su banyosunun tabanını (adım 1.1) manyetik dişlilerle (Şekil 1 [6, 7] ve Şekil 3A) taban motor plakasına bağlayın ve ardından bu tertibatı bir güç kaynağına bağlayın (Şekil 3B). Haznelerdeki karıştırma çubuklarını etkinleştirecek olan dişlileri etkinleştirmek için güç kaynağını açın.
4. Valf konektör düğmelerini kullanarak su akışını gerektiği gibi modüle edin (örneğin, 75 rpm'de yavaş karıştırma ile 30 L/s'ye ayarlanmış sürekli, yumuşak akış) (Şekil 3C).
5. Respirometri odasını monte etmek için, manyetik boncuğu (Şekil 1 [1.5]) cam hazneye (Şekil 1 [1.6]) ve ardından opak plastik akışlı stand tabanını (Şekil 1 [1.4]) cam hazneye ekleyin (Şekil 4A). Odanın ve manyetik boncuğun boyutu, ilgilenilen organizmaya ve çalışma sistemine bağlı olacaktır.
   NOT: Plastik tabanda, alttaki manyetik boncuğun hareketinden su akışına ve sirkülasyonuna izin veren delikler vardır.
6. Akvaryum tutkalı kullanarak mercanı yapıştırın (Malzeme Tablosuna bakın) plastik tabana yerleştirilmiş siyah fermuara (Şekil 4B-D). Bunu yapmak için, önce mercan yavrusunu bir parça siyah plastiğe yapıştırın ve ardından bu parçayı plastik tabana yapıştırın. Mercan güvenli bir şekilde yapıştırıldıktan sonra (tutkalın kürlenmesi neredeyse anında gerçekleşir), O-ringli kapağı (Şekil 4A) cam hazneye vidalayın. Respirometri odasında hava olmadığından emin olmak için bu işlemleri su altında ayrı bir havzada gerçekleştirin.
   NOT: Respirometredeki su hacmi (yani, etkili hacim = 1.5 ml), odanın tamamen suya daldırılmasıyla belirlendi. Varsayım, su hacmine göre, çok küçük mercanın kütlesinden/yoğunluğundan yer değiştirmenin ihmal edilebilir olduğudur. 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpü burada ölçek için gösterilmiştir (Şekil 4A).
7. Odaları su banyolarına sıkıca yerleştirin (Şekil 5A). Deney için cam haznelerin sıcaklık kontrollü su ile temas halinde olduğundan emin olun.
8. O₂ fiber optik kabloları (bkz. Malzeme Tablosu), oksijen sensörü noktalarıyla (bundan sonra noktalar olarak anılacaktır; Malzeme Tablosuna bakın) temas edecek şekilde, kapak odalarının yan tarafına açılan deliğe sokarak bağlayın. Bu küçük noktalar oksijene duyarlıdır ve fiber optik kablo aracılığıyla odanın içinden gelen sinyali algılar ve iletir.
   1. Kablonun sıkıca oturmasını sağlamak ve su haznesinin içinde sıkıca kalmasını sağlamak için sıhhi tesisat bandı (beyaz ince kendinden sızdırmaz bant) ekleyin. Tek tek mercanın görülebildiğinden emin olun ( Şekil 5B'de görüldüğü gibi), kahverengi dokunaçlar yukarı bakacak şekilde, odanın içinde (Şekil 5B, Video 1).
      NOT: Aparattaki bileşenlerin maliyet tahminleri Tablo 1'de verilmiştir.

2._O2 sistemini kullanarak solunumu ölçmek için standart çalışma prosedürü

1. Oksijen ölçüm yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakın).
2. Kalibrasyonun yapılacağı odanın sıcaklığını ölçün. Bu, daha sonra kalibrasyon aşaması için gerekli olacaktır (adım 2.8).
3. Optik sensörleri ve kapakları monte edin. Bunu yapmak için, tüm fiber optikleri O₂ modülündeki eşleşen bağlantı noktasına bağlayın. Kapak 1'i sensör 1'le, kapak 2'yi sensör 2 ile vb. eşleştirdiğinizden emin olun.
4. Odaları kalibrasyon için ayarlamak için, önce bir parça temiz süngeri biraz ters ozmoz (RO) suyuyla nemlendirin ve her bölmeye yerleştirin.
   NOT: Sünger damlamamalı, sadece nemli olmalıdır. Fiber optik noktaya damlayabilir. Bir sonraki adıma geçmeden önce noktanın ıslak olmadığından emin olun.
5. Bölmeleri eşleşen fiber optik ile baş aşağı yerleştirin (Şekil 6). Bu, fiber optiğe dokunmadan haznenin sökülmesine ve %0 kalibrasyon için sodyum sülfit eklenmesine izin verecektir.
6. Kalibrasyona başlamadan önce her sensörün sinyalini kontrol edin. Yazılım arayüzündeki tüm sekmeleri gözden geçirin ve sinyal değerini (sol üst köşe) kontrol edin (Şekil 7A), önemli ölçüde değişmediklerinden emin olun. Deney düzeneği için kabul edilebilir değerler için O₂ kılavuzuna bakın (organizmaya ve ilgilenilen koşullara bağlı olarak). Bu özel kurulum için, 25,3 °C'lik bir oda sıcaklığında, sinyal 179,5'te iken 20,59'luk bir FTC (hücre normal aralığında oksijen sensörü spot akışı) kabul edilebilir.
7. Program'ı açın ve aşağıda belirtildiği gibi doğru olduklarını onaylamak için yazılımdaki ayarları kontrol edin. Programı açtıktan hemen sonra açılır pencere görünmezse, bu, yazılım arayüzünün sol alt köşesindeki Ayarlar düğmesine tıklanarak yapılabilir.
8. Harici sıcaklık sensörünün etkinleştirildiğini kontrol edin (Şekil 7B). Ayarı Sabit sıcaklık olarak değiştirin (Şekil 7C). Ardından, oda sıcaklığı değerini ekleyin ve ayarı diğer tüm kanallara kopyala'ya tıklayın.
9. Ayarı Sinyal Kaymasını Azalt olarak değiştirin (Şekil 7C). Ardından, Sensör Ayarları'nı seçin ve seviye 2'yi seçin. Aksi takdirde, küçük hacimler kullanılıyorsa, sapma o kadar yüksek olacaktır ki kalibre edilmesi zor olacaktır.
10. Kanalların genel ayarlarını kontrol edin. Yeterliyse Tamam'a basın. Ayarları tüm kanallara kopyala'yı tıklatın ve sonra Tamam'ı tıklatın.
11. Sensörleri kalibre edin. Kanal 1 kalibrasyonu için Kanal 1 sekmesine gidin ve Kalibre Et düğmesine basın. Suda veya nemli havada 2 noktayı seçin.
12. "Hava" kalibrasyonu için bir parça köpüğü suya batırın, haznenin içine yerleştirin ve sinyalin stabilize olmasını bekleyin (hava kalibrasyonu öncesi ve sonrası resimlerine bakın). Stabil olduğunda, "hava ayarla" düğmesine basın. Havayı ayarlayın > kalibre edin > tıklayın.
13. %0 ve %100 kalibrasyonu ayarlayın (Şekil 7D). Hazneyi kapaktan çıkarın ve bir sonraki kapağa yerleştirin, böylece ilk sensördeki %0 kalibrasyon bittiğinde hava kalibrasyon sinyali hazır olur. Bir transfer pipeti kullanın ve kapağı %2 sodyum sülfit ile doldurun. Sinyalin stabilize olmasını bekleyin.
    NOT: Sinyalin stabilize olması genellikle hava kalibrasyonuna kıyasla daha fazla zaman alır. "Değerler tipik aralığın dışında" diyen bir uyarı mesajı görünürse, sodyum sülfitin taze olduğundan emin olun. Tüm kanallar için aynı kalibrasyon işlemini tekrarlayın. 100 mL RO suya 2 g ekleyerek sodyum sülfiti hazırlayın.
14. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra solunum odalarını iyice durulayın ve odaları ve kapakları kurutun. Fiber optik delikte su olmadığından emin olun.
15. Organizmayı (bu örnekte tek mercan yavruları) solunum odalarının içine yerleştirin ve kapaklarla kapatın. Kapakları yerleştirirken, hazneler tamamen suya batırıldığında ve içeride kesinlikle hava olmadığında yaptığınızdan emin olun.
16. Hazneleri karıştırma plakasına sıkıca yerleştirin ve fiber optikleri bağlayın.
17. Güç kaynağını açın. Haznelerin içindeki suyun tamamen karıştığından emin olun. Soğutucudaki/ısıtıcıdaki sıcaklığı seçilen deneysel sıcaklıklara ayarlayın.
18. Pompayı ve ısıtıcıyı açın (adım 1.2 ve 1.4).
19. Kayda başlamak için O₂ ölçüm yazılımı arayüzündeki günlüğe basın.

Sonuçlar

Veri işleme ve analiz
Respirometri deneylerinden elde edilen ham verileri işlemek için çok sayıda yöntem olsa da, R paketi respR^28'in kullanılması önerilir. Açık bilim ve tekrarlanabilirliği savunan yukarıdaki protokollerin paylaşımına uygun olarak, bu paket veri işleme ve analizinin kolayca tekrarlanabilir bir biçimde paylaşılmasına olanak tanır ve bu akılda tutularak tasarlanmıştır. Ücretsiz, açık kaynaklı bir platformdur ve prob sisteminden bağımsızdır ve CRAN veya GitHub'dan kolayca kurulabilir. respR için tam kod ve örnekler korunur ve https://github.com/januarharianto/respR'de bulunabilir.

respR paketi, respirometri verilerini içe aktarma, görselleştirme ve üzerinde kalite kontrolü gerçekleştirme ve solunum hızlarını otomatik olarak veya manuel olarak seçilen bölgelerden hesaplama işlevlerine sahiptir. Ayrıca, arka plan solunumu oranlarını ve yaygın olarak kullanılan çıktı birimlerine dönüştürme oranlarını da ayarlayabilir. Mikro-respirometri sisteminden gelen verileri işleme adımları aşağıda detaylandırılmıştır. Bu çalışmada, respirometri sisteminden elde edilen veriler örnek olarak kullanılmıştır, ancak paket aynı zamanda ticari olarak temin edilebilen oksijen prob sistemlerinin çoğundan ve jenerik R veri nesnelerinden gelen girdileri de kabul etmektedir. Tam belgeler ve öğreticiler de dahil olmak üzere paket hakkında daha fazla ayrıntı, https://januarharianto.github.io/respR/index.html adresindeki paket web sitesinde bulunabilir.

Ham verileri içe aktarma
Ham çıktı dosyası (.txt) içe aktarılır. respR biçimi tanır ve sonraki işlevlerde kullanılabilecek genel bir R veri çerçevesine ayrıştırır. Ancak, bunun isteğe bağlı olduğunu unutmamak önemlidir; bu dosyalar ve hemen hemen tüm oksijen zaman serisi verileri, temel R bilgisine sahip herkes tarafından temel fonksiyonlar (aşağıda verilmiştir) kullanılarak da içe aktarılabilir.

#load respR
Kütüphane(respR)

#Import ---
Veri <- import_file("file.txt")
#Firesting-Pryo dosyası algılandı

Verileri inceleme ve görselleştirme
Herhangi bir veri analizi görevinin hayati bir parçası, bariz anormallikleri veya kalıpları aramak veya hatta sadece anlamaya yardımcı olmak için verileri çizmek ve incelemektir. Burada, sayısal olmayan veya eksik değerler gibi respirometri verilerinde yaygın olan sorunları kontrol eden inceleme işlevi kullanılır (Şekil 8A).

Tek bir oksijen sütunu #inspect
Insp <-inspect (veri, zaman = 3, oksijen = 8, genişlik = 0.2)

Bu fonksiyon aynı zamanda oksijen zaman serisini çizer ve bu hızın deney boyunca nasıl değişebileceğini açıklamaya yardımcı olmak için bir yuvarlanma hızı (alt panel) hesaplar. Bu yuvarlanma hızı grafikleri, bu oran eğrilerinin hangi bölgelerinin çıkarılması gerektiği hakkında bilgi sağlamaya yardımcı olur. Standart veya rutin metabolizma hızları söz konusu olduğunda, istenen bölgeler, hızın stabilite gösterdiği bölgelerdir (örneğin, yaklaşık 3.000 zaman noktasından sonra; Şekil 8B).

Burada, azalan oksijen ancak tam zaman serisi panelinde yaklaşık 200. satırdan sonra tespit edilebilir hale gelir. Bunun gibi modeller respirometri verilerinde çok yaygındır; Bir deneyin başlangıcında, sistem stabilize olduğu ve numune deney koşullarına alıştığı için genellikle uzun bir kararsızlık dönemi vardır. Oranların yalnızca bu ilk istikrarsızlıktan sonra zaman serilerinden çıkarılması önerilir ve bu da görselleştirmelerin önemini vurgular.

Ekstrakt oranları
respR'nin solunum hızlarını çıkarmak için iki işlevi vardır. Birincisi, bir zaman bölgesi, satır veya oksijen seviyesi belirterek bir hızın manuel olarak çıkarılmasına izin veren calc_rate() işlevidir. Bu, respirometri analizlerinde çok yaygındır ve seçim kriterlerine karar verildiği ve tutarlı bir şekilde uygulandığı sürece bir oranın belirlenmesinde tamamen kabul edilebilir bir yöntemdir²⁸.

Daha sağlam ve nesnel bir yol, verilerin doğrusal bölgelerini tanımlayan auto_rate() işlevini kullanmaktır. Bu bölgeler, makine öğrenimi kullanılarak otomatik olarak atanan, tutarlı bir şekilde sürdürülen solunum hızlarına sahip bölgelerdir. Bu işlev aynı zamanda düşük sinyallerin tespiti için de yararlıdır (bu yaştaki düşük biyokütle nedeniyle bu mevcut çalışmada kullanılan örneklerde olduğu gibi). Bu işlev, bağımsız, nesnel ve istatistiksel olarak sağlam yöntemler kullanılarak en doğrusal, minimum ve maksimum oranların tanımlanmasına olanak tanır²⁸. Buradaki örnek, yaklaşık 3.000 ile 5.000 arasındaki zaman noktalarından oluşan doğrusal bir bölgeyi tanımlar. Birden fazla doğrusal bölgenin tanımlanabileceğine dikkat edilmelidir, ancak bu bölüm en yüksek dereceli veya en doğrusal bölgedir (Şekil 8C).

#Determine doğrusal (yani tutarlı) oran
<-auto_rate (INSP) oranı

Arka plan ayarı
Kontrol deneylerinden elde edilen arka plan oranları, yukarıdaki örneğe benzer şekilde belirlenebilir ve adjust_rate() fonksiyonu kullanılarak numune oranlarını ayarlamak için kullanılabilir (Şekil 9A; burada tam analizin gösterilmediğini, yalnızca ayarlamanın gösterildiğini unutmayın). Tam örnekler respR web sitesinde detaylandırılmıştır.

Arka plan için #Adjust oranı
rate_adj <-adjust_rate(oran, = bg) #saved bg nesnesi
Yazdır(rate_adj)

Oranları dönüştürün
Son adım, ham verilerin orijinal birimlerini, respirometrenin etkin hacmini ve boş ölçümlere normalleştirme de dahil olmak üzere diğer deneysel verileri kullanarak oranları istenen çıktı birimlerine dönüştürmektir (Şekil 9B). Çıktı, mutlak bir solunum hızı, yani tüm numunenin veya kütle veya yüzey alanına özgü bir hız olabilir. Yüzey alanına özgü oran, burada kullanılan çıktıydı, bu da özellikle numunenin yüzey alanına bölünen mutlak orandır (Şekil 9C).

Yukarıda tartışıldığı gibi, bu sistem çok küçük numuneleri ölçmek için geliştirilmiştir. Bu nedenle, düşük değerler ve boş ölçümlerle potansiyel örtüşme bekliyorduk. Boşluklar içinde bir miktar sinyal beklenir ve incelendiğinde, bu değerler, muhtemelen prob kayması, hafif sıcaklık değişiklikleri veya problardaki kabarcıklar nedeniyle beklenen genel deneysel gürültü aralığındadır. Tasarım gereği ve küçük numune boyutu ve dolayısıyla kullanılan küçük etkili hacim nedeniyle, özellikle her çalışma için boşlukların kullanılması burada özellikle önemlidir. Temsili değerler burada örnek olarak yer almıştır (Şekil 10). Küçük numune boyutu göz önüne alındığında, çalışma başına ölçümleri standartlaştırmak için her çalışmada boşlukların kullanılmasını öneririz.

Bu boş değerler daha sonra tedavi ölçüm değerlerini standartlaştırmak için kullanılır. Mercanların oksijen üretmenin yanı sıra solunum yaptığı göz önüne alındığında, metabolik hız negatiften pozitif değerlere kadar değişebilir. Mikro solunum aracından tespit edilen solunum değerleri aralığının temsili sonuçlarına bir örnek burada verilmiştir. Bu sonuçlar, tek mercan yavruları üzerinde yapılan başarılı bir deneyden belirlenmiştir (Şekil 10). Genel olarak, örneklerin küçük boyutu göz önüne alındığında, bu örnek veri kümesinde (tasarım gereği) solunumun tespit edilmesinin zor olması bekleniyordu; Bu, bu düşük sinyal eşiğini yakalamada bu yöntemin değerinin altını çizer. Bu temsili sonuçlar, test edilen en küçük numune boyutlarında karanlıkta solunumu gösterir ve bu sistemin minimum algılama eşiğinin altını çizer. Ayrıca iki koşul altında ölçüm yaptık (kontrol ve yüksek sıcaklık stresi). Çalışma başına ölçülen boşluklara göre standartlaştırıldıktan sonra, değerler stres tedavisi için sıfıra yakın (kontrol) ile ~-^5e-5 medyanı arasında değişiyordu. Beklendiği gibi, solunum düşüktü. Bu sonuçlar, boşluklar için temsili değerlerin yanı sıra bu çok küçük numuneler için bir kontrol ve yüksek sıcaklık karşılaştırmasını açıkça göstermektedir.

Şekil 1: Mercan holobiontunun (mercan hayvanı + simbiyontlar) veya herhangi bir küçük organizmanın (<1 mm) fizyolojik karakterizasyonu için yeni mikro-respirometri aracının şematik gösterimi. Kişiye özel respirometri odaları yapıldı (1 numara; 1.1-1.6). Bunlar, oksijen sensörü noktalarına (1.2) sahip kapakları (1.1) içerir ve bireysel yavru (1.3), tümü cam hazneye (1.6) sığan bir manyetik karıştırıcının (1.5) üzerine yerleştirilmiş bir akış standına (1.4) yerleştirilir. Denetleyici (2), kapağa (1) uyan bir fiber optik kablo ile noktaya bağlanır ve bilgisayara (3) bağlanır. Isıtıcı/soğutucu (4), motor (5) ve güç kaynağı (5) tarafından çalıştırılan dişliler (7) ile karıştırma plakasının (7) üzerine oturan akan su (yön için köşeli çift ayraç oklarıyla gösterilir) ile respirometri plakasına (9) bağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Mikro-respirometri kurulumu. (A) bir respirometri plakası veya (B) birden fazla plakaya bağlı olmak üzere birden fazla seçenek mevcuttur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Respirometri plakasının üzerine özel yapım manyetik karıştırıcı plaka. Her bölmenin altında (A) bir manyetik karıştırma dişlisi, (B) bir motorla çalışan ve (C) hortumla ısıtıcıya/soğutucuya bağlanan respirometri plakası bulunur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Özel respirometri odası kurulumu. (A) Bileşenler (soldan sağa: kapak, cam şişe, sehpa, terazi için 1,5 ml'lik tüp ve karıştırma çubuğu). (B) Numunenin içine oturduğu bireysel akış standı. (C) Akış standının yukarıdan aşağıya görünümü. (D) ve kapak vidalanmış olarak cam şişenin içine yerleştirilmiş stand ile. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Karıştırma plakasının içine yerleştirilmiş cam şişeler. (A) Özel yapım karıştırma plakası (B) kapak kurulumuyla birlikte tüm cam şişenin yakın çekimi. Yavru mercan, buradaki kapaktan (kahverengi nokta), fermuarın üstünde, kapak açıklığına yerleştirilmiş fiber optik ile görülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Kalibrasyona hazır, baş aşağı yerleştirilmiş odalar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Oksijen ölçüm yazılımındaki temel adımlar. (A) Her sensörün sinyalini kontrol edin. Bu çalışma ve sensörler için en uygun sinyal, oksijen sensörü noktası FTC'de (normal aralık) gösterilir. (B) Sinyal sapmasını kontrol edin. (C) Tedavi sıcaklıklarını ayarlayın ve kontrol edin. (D) %0 ve %100 kalibrasyonlarını ayarlayın ve kontrol edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: respR analizi çıktı adımları I. (A) Komutu ve çıktıyı inceleyin. (B) Hız kararlılığını kontrol edin. (C) En doğrusal hızı belirleyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: respR analizi çıktı adımları II. (A) Arka plan hızını ayarlayın, (B) Dönüştür ve (C) oranları kontrol edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: Mikro-respirometri aracından üretilen temsili sonuçlar. Boş değerlerin yanı sıra kontrol altındaki bireylerin solunumu ve yüksek sıcaklık stresi koşulları da dahil olmak üzere bireysel mercan yavrularının medyan solunumu (O₂ ± standart hata). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Bir ölçüm seansı sırasında içinde yavru mercan bulunan respirometri odasının yukarıdan aşağıya görünümü. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Respirometri aparatının bileşenlerinin maliyet tahminleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Bu çalışma, küçük sapsız suda yaşayan organizmalar tarafından tüketilen ve üretilen oksijen miktarını ölçmek için kullanılabilecek özel yapım bir mikro-respirometri kurulumunun yapımını özetlemektedir. Bu protokolün kritik bileşenleri, noktalar da dahil olmak üzere odaların kurulumunu ve düşük bir sinyalin sığ veya gürültülü eğimlerle karakterize edilen oranlar olarak tanımlanabildiği respR paketi kullanılarak düşük sinyalin kalibrasyonunu içerir. Özel bölme ve kurulumu, düşük sinyallerin bile algılanmasına izin verirken, R paketinin kullanılması, sığ veya gürültülü eğimlerin ortaya çıkmasının sonuçların yanlış yorumlanmasına yol açabileceği sorunlara (örn. yanlış pozitifler) karşı korumaya yardımcı olur.

Diğer kullanıcılar için ihtiyaç duyulacak potansiyel modifikasyonlar, ilgilenilen organizmanın ısmarlama oda içinde güvence altına alınmasını içerir. Bu durumda, tek yavruyu plastik tabana sabitlemek için küçük, sert bir fermuar ve akvaryum yapıştırıcısı kullanıldı ve daha sonra kravata yapıştırıldı. Bu deney için mercan yavrularının siyah plastik örtü üzerine yerleştirildiğine dikkat edilmelidir. Bu plastik, çıkarma sırasında fiziksel olarak zarar vermemek için plastikten etkili bir şekilde kayan mercan yavrularının kolayca çıkarılmasına izin verdi. Mercan yavruları yerleştikleri alt tabakaya yapışırlar, bu nedenle yapıştırma işlemi için çıkarılmalarını kolaylaştırmak için yapay bir peptit¹⁶ kullanarak benzer plastik malzeme üzerine yerleştirilmeleri önerilir. Taşıma stresini ve solunum tepkisi üzerindeki etkiyi daha da en aza indirmek için, birçok yetişkin mercan stres deneyinde yaygın olduğu gibi, fermuarlara monte edilen mercanların 1-2 hafta boyunca alışmasına izin verilmesi önerilir. Organizmayı kapaktaki noktanın üzerine sabitlemek ve su sirkülasyonuna izin vermek için başka modifikasyonlar gerekebilir. Bir diğer önemli sorun giderme adımı, özellikle hızların belirlenmesi gereken oksijen zaman serisinin eğiminde sinyal algılamayı içerir. Sonuç olarak, bu, açıkça kararsız verileri hariç tutmak için iyi muhakeme kullanmanın ve oranların tutarlı bir şekilde seçilen bölgelerden veya verilerin doğrusal bölgelerini tanımlayarak otomatik olarak çıkarılmasına izin vermek için respR içindeki işlevlerin bir kombinasyonuna bağlıdır. Bunun nasıl yapılacağına dair daha fazla örnek respR web sitesinde mevcuttur.

Bu yöntem, solunumun alt sınırının ölçümlerini son derece küçük, sapsız deniz omurgasızlarına genişletmek için geliştirilmiştir. Bariz sınırlama, bu protokolün daha büyük biyokütleler için tasarlanmış protokollere kıyasla yanlış pozitiflere daha yatkın olabilmesidir. Bununla birlikte, tasarımın amacının bu olduğu göz önüne alındığında - bu alt limitleri ölçmek için - bu, tasarıma dahil edilmiştir ve prosedür, yanlış pozitiflere karşı daha iyi koruma sağlamak için respR paketi ile birlikte kullanılabilir. Solunumu³⁰ ölçmek için başka sistemlerin de mevcut olduğunu ve bundan daha küçük hacimlerde (~0.5-1 mL) bireysel kopepodlar³¹ üzerinde respirometri de dahil olmak üzere küçük organizmaların ölçülmesi için başka sistemlerin mevcut olduğunu kabul etmek de önemlidir, ancak ya pahalıdır ya da spesifik bileşenlerden yoksundur (karıştırma yeteneği). Bununla birlikte, bu sistem açık kaynaklıdır ve ticari sistemlere kıyasla nispeten düşük maliyetlidir (örneğin, Çekirdek Mikroplaka sistemi). Bu sistem aynı zamanda diğer sistemlerde eksik olabilecek karıştırma gibi temel metodolojik hususları da içerir. Dahili karıştırma çubuğu özelliği, birçok deniz organizmasının (örneğin, yüzme yoluyla kopepodlar) doğal su karışımını çoğaltmak için gereklidir, bu genellikle mümkün değildir ve verileri büyük ölçüde kullanılamaz hale getirebilir. Buna karşılık, mevcut diğer karıştırma yöntemleri, tüm respirometreyi, ek ekipman gerektiren ve karıştırmada sınırlı başarıya sahip olan dev bir külbütör tezgahına yerleştirmeyi veya organizmada rahatsızlığa neden olabilecek titreşim yoluyla karıştırmayı içerir. Bu nedenle, genç mercanlar veya diğer çok küçük sapsız organizmalar üzerinde respirometri yapabilen tek sistem budur. Referans olarak, burada yer alan örneklerin boyut aralığı 2.1 ila 3.6 polip (sadece birkaç aylığa karşılık gelir) arasında değişmekte olup, minimum ila maksimum ortalama alan 1.3 ila 4.5^mm2'dir.

Respirometri, ekolojik çalışmalarda temel bir önlemdir ve bu amaçla birçok yöntem mevcuttur. Bununla birlikte, bu mevcut yöntemlerin çoğu, bütün balıklar, mercan parçaları veya deniz çayırları dahil olmak üzere yüksek biyokütle örneklerini hedeflemektedir 32,33,34. Bu yöntem, bireysel mercan yavrularını kullanan ilk yöntemdir. Ek olarak, organizmanın işleyişi hakkında önemli fizyolojik bilgiler sağladığı için bu yöntem için birçok potansiyel uygulama vardır. Bu, temel sağlık tahminlerini³⁵ karakterize etmek, ısı stresi³⁶ gibi mercan ontogenezi sırasında akut veya uzun vadeli stresin rolünü anlamak veya yöneticilerin mercan resiflerinin sağlığını korumaya ve iyileştirmeye yardımcı olmak için belirleyebilecekleri eşikler sağlamak isteyen çalışmalar için önemli olabilir³⁷. Mercanın bir holobiont olduğu ve simbiyont topluluğunun bu aşamada ve yaşamın ilk yılı boyunca nispeten esnek olduğu göz önüne alındığında³⁸, organizmanın işleyişini bir bütün olarak tam olarak bağlamsallaştırmak için respirometri verilerini zaman içinde topluluklardaki değişikliklerle eşleştirmek ilginç olacaktır. Daha da önemlisi, bu yöntem, açık bir şekilde paylaşılabilen, geliştirilebilen ve standartlaştırılabilen özel deney düzenekleri oluşturmak için bir taslak sağlamaya yardımcı olan 'açık bilim' tekniklerine katkıda bulunur.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Cost
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers	LabGlass Party Ldt.	1.5 ml	$407.26
1.1 lids	AIMS workshop	Vial GL25 thread	~$10
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes)	PyroScience	Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947	$41.25 AUD each
1.3 individual organism	NA	NA	NA
1.4 flow-through stand	AIMS workshop	Custom	included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through
1.5 magnetic stirrer	Any manufactuer is suitable	NA	~$2?
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD)	Labglass Pty Ltd, Stafford QLD	Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole	$50.9 AUD
2 FireSting controller (2)	PyroSciences	NA	4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here.
3 computer	NA	NA	NA
4 heater/chiller	VWR International	NA	Small models around $4,000 AUD
5 respirometry plate platform	AIMS workshop	34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers)	$1250 AUD
6 stirrer plate with gears (7)	AIMS workshop	34 cm x 26 cm x 3 cm	$1250 AUD
8 powered by the motor	AIMS workshop	Custom	$700 AUD
9 power supply	Non-specific	NA	~$300 AUD
Aquarium glue	Seachem reef glue	20g	$14
Oxygen Logger Software	PyroScience	NA	NA
Polypipe and connectors	John Guest	NA	$20
Sodium Sulfite	Sigma	S0505-250G (CAS number 7757-83-7)	$54