JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكولات تصنيع هلام الجيلاتين ميثاكريلويل عالي الإنتاجية باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة ، وتحويل الهلاميات الدقيقة إلى مسحوق قابل للإنعاش (الهلاميات الهوائية الدقيقة) ، والتجميع الكيميائي للهلام الدقيق لتشكيل سقالات هيدروجيل حبيبية ، وتطوير أحبار هيدروجيل حيوية حبيبية مع مسامية دقيقة محفوظة للطباعة الحيوية 3D.

Abstract

أدى ظهور سقالات هيدروجيل الحبيبية (GHS) ، المصنعة عن طريق تجميع الجسيمات الدقيقة الهيدروجيل (HMPs) ، إلى تمكين تكوين سقالة صغيرة يسهل اختراقها في الموقع. على عكس الهلاميات المائية السائبة التقليدية ، تسهل المسام المجهرية المترابطة في GHS تسلل الخلايا المستقل عن التدهور بالإضافة إلى نقل الأكسجين والمغذيات والمنتجات الثانوية الخلوية. تم استخدام الجيلاتين المعدل بالميثاكريلويل (GelMA) ، وهو بوليمر حيوي (ضوئي) متشابك كيميائيا وقائم على البروتين يحتوي على مادة لاصقة للخلايا وأجزاء قابلة للتحلل ، على نطاق واسع كمادة حيوية مستجيبة للخلايا / مفيدة. قد يؤدي تحويل GelMA السائب إلى GHS إلى فتح عدد كبير من الفرص لهندسة الأنسجة وتجديدها. في هذه المقالة ، نوضح إجراءات تصنيع الهلام الدقيق GelMA عالي الإنتاجية ، والتحويل إلى الهلاميات الدقيقة الجافة القابلة للإعادة (الهلاميات الهوائية الدقيقة) ، وتشكيل GHS عبر التجميع الكيميائي للهلام الدقيق ، وتصنيع الحبر الحيوي الحبيبي للطباعة الحيوية بالبثق. نوضح كيف أن المعالجة الفيزيائية والكيميائية المتسلسلة عن طريق التبريد والتشابك الضوئي تمكن من تكوين GHS قوي ميكانيكيا. عندما يتعذر الوصول إلى الضوء (على سبيل المثال ، أثناء حقن الأنسجة العميقة) ، يمكن تجميع GelMA HMPs المتشابكة بشكل فردي بشكل فردي عبر التشابك الأنزيمي باستخدام transglutaminases. أخيرا ، يتم إظهار الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد (3D) ل GHS الصغيرة التي يسهل اختراقها بكثافة تعبئة HMP منخفضة من خلال التجميع الذاتي البيني للجسيمات النانوية المشحونة بشكل غير متجانس.

Introduction

اكتسب تجميع اللبنات الأساسية HMP لتشكيل سقالات هندسة الأنسجة اهتماما هائلا في السنوات القليلة الماضية1. تتميز GHS ، المصنعة عبر تجميع HMP ، بخصائص فريدة مقارنة بنظيراتها السائبة ، بما في ذلك المسامية الدقيقة على نطاق الخلية الناشئة من المساحات الفارغة بين لبنات البناء المنفصلة. الخصائص الإضافية ، مثل قابلية الحقن ، والنمطية ، والصلابة المنفصلة عن المسامية ، تجعل GHS منصة واعدة لتعزيز إصلاح الأنسجة وتجديدها2. تم استخدام مواد حيوية مختلفة لتصنيع GHS ، بما في ذلك البوليمرات الاصطناعية القائمة على PEG3,4 والسكريات ، مثل الجينات5 وحمض الهيالورونيك 6,7. من بين البوليمرات المشتقة بشكل طبيعي ، فإن البوليمر الحيوي الأكثر شيوعا القائم على البروتين لتصنيع GHS هو GelMA8،9،10،11 ، وهو مادة حيوية قابلة للربط المتشابك ومتوافقة حيويا ولاصقة حيوية وقابلة للتحلل الحيوي12,13.

يمكن تصنيع HMPs عن طريق استحلاب الدفعات8 ، أو التركيز على التدفق 14,15 أو الاستحلابالتدريجي 9,11 أجهزة الموائع الدقيقة ، أو المزج 16 ، أو التراكمالمعقد 17,18. عادة ، هناك مقايضة بين إنتاجية التصنيع والتشتت الأحادي HMP. على سبيل المثال ، تنتج تقنية المزج HMPs غير منتظمة الشكل ومتعددة التشتت للغاية. يتيح استحلاب الدفعات أو التكثيف المعقد إنتاج كميات كبيرة من HMPs الكروية متعددة التشتت. تم استخدام أجهزة الموائع الدقيقة التي تركز على التدفق لتصنيع قطرات أحادية التشتت بدرجة عالية مع معامل تباين يبلغ <5٪ ، ولكن الإنتاجية منخفضة بشكل ملحوظ. في أجهزة الموائع الدقيقة ذات الاستحلاب التدريجي ، تتيح الخطوات المتوازية للغاية تصنيع HMPs أحادي التشتت19 عالي الإنتاجية.

تتميز كتل بناء الجيلاتين المعدل بالميثاكريلويل (GelMA) HMP بأنها مستجيبة للحرارة وقابلة للتشابك كيميائيا (للصور) ، مما يتيح تصنيع GHS السهل20. عند التبريد تحت درجة حرارة المحلول الحرجة العليا (UCST) 21 (على سبيل المثال ، عند 4 درجات مئوية) ، يتم تحويل القطرات التي تحتوي على محلول GelMA إلى HMPs متشابكة ماديا. ثم يتم تعبئة كتل بناء HMP هذه باستخدام قوى خارجية (على سبيل المثال ، عن طريق الطرد المركزي) لإنتاج معلقات ميكروهلامية محشورة. يتم إنشاء روابط بين الجسيمات بين HMPs المجاورة عبر التشابك الكيميائي (الضوئي) لتشكيل GHS14 القوي ميكانيكيا. واحدة من أهم خصائص GHS هي المسامية الدقيقة ، مما يتيح اختراق الخلايا السهلة في المختبر11 وتعزيز نمو الأنسجة في الجسم الحي22. يتم إجراء الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد (3D) ل HMPs بشكل تقليدي باستخدام معلقات ميكروجيل معبأة بإحكام ، مما يضر بالمسامية الدقيقة23.

لقد طورنا مؤخرا فئة جديدة من الأحبار الحيوية الحبيبية تعتمد على الهندسة النانوية البينية للهلام الدقيق GelMA عبر امتزاز الجسيمات النانوية غير المتجانسة ، متبوعة بالتجميع الذاتي القابل للانعكاس للجسيمات النانوية. هذه الاستراتيجية تجعل الهلاميات الدقيقة المعبأة بشكل فضفاض تنتج القص والبثق 3D قابلة للطباعة الحيوية ، مما يحافظ على المسامية المجهرية ل GHS11 المصنعة بشكل إضافي. تقدم هذه المقالة طرق تصنيع قطرات GelMA عالية الإنتاجية ، وتحويل هذه القطرات إلى HMPs متشابكة جسديا ، وتصنيع GelMA HMPs باستخدام مسحوق قابل لإعادة التدوير ، وتشكيل GelMA GHS ، وإعداد الحبر الحيوي الحبيبي النانوي GelMA (NGB) ، والطباعة الحيوية 3D.

Protocol

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. توليف GelMA

ملاحظة: يجب إجراء تخليق GelMA في غطاء دخان كيميائي ، ويجب استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) طوال الوقت.

  1. أضف 200 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS ، 1x) إلى دورق Erlenmeyer وقم بتسخين المحلول حتى يصل إلى 50 درجة مئوية. قم بتغطية القارورة بورق الألمنيوم لمنع التبخر.
  2. أضف 20 جم من مسحوق الجيلاتين إلى محلول DPBS عند 50 درجة مئوية مع التحريك عند 240 دورة في الدقيقة حتى يذوب المسحوق تماما.
  3. أضف 16 أو 2.5 أو 0.5 مل من أنهيدريد ميثاكريلات (MA) إلى محلول الجيلاتين بالتنقيط عبر ماصة باستور زجاجية لتصنيع GelMA بدرجة عالية أو متوسطة أو منخفضة من استبدال الميثاكريلويل ، على التوالي.
    تنبيه: MA مادة خطرة. يجب استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند العمل مع MA. MA أيضا حساس للضوء ، لذا احم التفاعل من الضوء عن طريق لف القارورة بورق الألمنيوم.
  4. بعد 2 ساعة ، أضف 400 مل من DPBS عند 50 درجة مئوية لإيقاف التفاعل. اترك التحريك يستمر على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  5. صب المحلول في أنبوب غشاء غسيل الكلى مع قطع الوزن الجزيئي 12-14 كيلو دالتون ، ثم ضع الأنبوب في دورق سعة 5 لتر مملوء بماء فائق النقاء 40 درجة مئوية. حرك الماء عند 240 دورة في الدقيقة و 40 درجة مئوية.
  6. قم بغسيل المحلول ضد الماء عالي النقاء لمدة 10 أيام وقم بتغيير الماء 2x يوميا لإزالة أنهيدريد ميثاكريلات غير المتفاعل والمنتجات الثانوية والشوائب الأخرى.
  7. بعد 10 أيام ، أضف 400 مل من الماء عالي النقاء عند 40 درجة مئوية إلى محلول GelMA. حرك المحلول عند 240 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة.
  8. قم بتصفية المحلول مرتين باستخدام مرشحات القهوة ، متبوعا بالترشيح بالفراغ عبر وحدة ترشيح فراغ 0.2 ميكرومتر.
  9. صب 25 مل من المحلول المصفى في أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بتجميدها عند -80 درجة مئوية ، مع وضع الأنابيب أفقيا.
  10. بعد 2 أيام ، قم بإزالة الأغطية وتغطية أنابيب الطرد المركزي بمناديل مختبرية. استخدم شريطا لاصقا أو شريطا مطاطيا لتثبيت المناديل بإحكام.
  11. قم بتجفيد محلول GelMA المجمد لإنتاج GelMA أبيض صلب.
  12. لإجراء التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي للبروتون (1 H NMR) ، أضف بشكل منفصل 30 مجم من مسحوق الجيلاتين (التحكم) أو GelMA المجفف بالتجميد في 1مل من أكسيد الديوتيريوم (D2O) والحفاظ على العينات عند 37 درجة مئوية حتى يذوب مسحوق الجيلاتين أو GelMA تماما.
  13. الحصول على أطياف الرنين المغناطيسي النووي 1H وتحديد درجة استبدال الميثاكريلويل عن طريق دمج الأحماض العطرية وقمم بروتون الميثيلين ليسين عند التحولات الكيميائية ~ 6.5-7.5 و ~ 3.0 جزء في المليون ، على التوالي. استخدم قمة الأحماض العطرية كمرجع وحدد درجة الاستبدال (DS) باستخدام قمم الميثيلين ليسين بناء على المعادلة (1):
    DS (٪) = [1 - (مساحة ليسين الميثيلين في GelMA / مساحة ليسين الميثيلين في الجيلاتين)] × 100 (1)

figure-protocol-2992
الشكل 1: تخليق وتوصيف GelMA. (أ) تفاعل تخليق GelMA. يتم تعديل الجيلاتين باستخدام أنهيدريد الميثاكريليك عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. (ب) أطياف الرنين المغناطيسي النووي للبروتون (1H NMR) للجيلاتين و GelMA: (أ) ذروة الأحماض العطرية ، والتي يتم اختيارها كمرجع للمعايرة ، (ب) قمم المجموعة الوظيفية للفينيل بعد تعديل MA للجيلاتين ، و (ج) ذروة بروتينات اللايسين. في هذا المثال ، كانت درجة MA للاستبدال 71٪ ± 3٪ (n = 3). تم تعديل هذا الرقم بإذن من Ataie et al.11 الاختصارات: GelMA = الجيلاتين ميثاكريلويل. DPBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات في Dulbecco ؛ MA = ميثاكريلويل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. تصنيع هلام GelMA عالي الإنتاجية

  1. التصنيع الدقيق للقالب الرئيسي للجهاز
    ملاحظة: يمكن تصنيع القوالب الرئيسية عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة باستخدام سلسلة KMPR 1000 السلبية المقاومةللضوء 19.
    1. ذوبان الجليد KMPR 1025 و 1035 بين عشية وضحاها. تجنب أي تعرض للضوء.
    2. لطلاء الطبقة الأولى على الرقاقة ، أضف KMPR 1025 مباشرة إلى منتصف الرقاقة لعمل دائرة مقاومة للضوء يبلغ طولها حوالي 5 سم. قم بتشغيل طبقة الدوران عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
    3. تخبز العجينة لمدة 12 دقيقة على موقد على حرارة 100 درجة مئوية. ثم تبرد على لوحة التبريد لمدة 5 دقائق.
    4. قم بتوصيل قناع الطبقة الأولى بجير الصودا الفارغ ، ثم قم بتعريض الرقاقة المطلية لضوء الأشعة فوق البنفسجية باستخدام مصفف قناع ل 645 مللي جول / سم2 من الجرعة.
    5. يوضع المزيج لمدة 3 دقائق على موقد على حرارة 100 درجة مئوية. يبرد على لوحة التبريد لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: لا تتطور بعد هذه الخطوة. تطوير مرة واحدة فقط في نهاية العملية.
    6. قم بتدوير الطبقة الثانية على الرقاقة باستخدام KMPR 1035. قم بتشغيل طبقة الدوران عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
    7. تخبز الخبزة لمدة 30 دقيقة على موقد على حرارة 100 درجة مئوية. يبرد على لوحة التبريد لمدة 5 دقائق.
    8. قم بتوصيل قناع الطبقة الثانية بجير الصودا الفارغ وقم بمحاذاة القناع الثاني باستخدام التقويم من خلال علامات المحاذاة القياسية. تعرض للأشعة فوق البنفسجية باستخدام مصفف قناع يصل إلى 2000 مللي جول / سم2.
    9. يوضع المزيج لمدة 5 دقائق على موقد بدرجة حرارة 100 درجة مئوية.
    10. تطوير لمدة >6 دقيقة في مطور SU-8.
      ملاحظة: إذا كانت الرقاقة تبدو حليبية ، فيجب أن يستمر التطوير لفترة أطول. استخدم مطورا جديدا في كل مرة وما بينها للحصول على نتيجة أفضل.
    11. رش مع الأيزوبروبانول. تأكد من أن الرقاقة واضحة ، مع عدم وجود بقايا حليبي. جفف الرقاقة تماما باستخدام غاز النيتروجين (N2).
  2. تصنيع جهاز الموائع الدقيقة
    1. صب 50 جم من الجزء الأساسي بوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) في كوب بلاستيكي شفاف. ثم أضف 5 غرام من الرابط المتشابك إلى الكوب البلاستيكي. امزج القاعدة والتشابك باستخدام ملعقة بقوة حتى يتم الحصول على قوام كريمي.
    2. قم بتفريغ الخليط بالمكنسة الكهربائية باستخدام مجفف لمدة 20 دقيقة حتى يصبح واضحا. يسكب المزيج على القالب الرئيسي ، الذي يوضع في الداخل ويسجل على طبق بتري.
      ملاحظة: تأكد من أن سمك (ارتفاع) PDMS المصبوب ≤8 مم.
    3. ضع طبق بتري في المجفف وقم بتفريغ خليط PDMS مرة أخرى لمدة 20 دقيقة حتى تتم إزالة جميع الفقاعات. ضع طبق بتري في فرن على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 2 ساعة حتى يتم ربط PDMS. أخرج طبق بتري من الفرن واتركه ليبرد.
    4. اقطع الأجهزة من القالب باستخدام مشرط. افصل الأجهزة ببطء عن القالب الرئيسي. استخدم لكمة الخزعة (قطرها 1.5 مم) لقطع الثقوب من خلال المداخل والمخرج.
    5. قم بإزالة أي غبار من أجهزة PDMS والشرائح الزجاجية باستخدام شريط لاصق ، وضع الشرائح الزجاجية والأجهزة في غرفة منظف البلازما. قم بإجراء معالجة البلازما لمدة 45 ثانية (تبدأ عندما تتحول الغرفة إلى اللون الأرجواني) بضغط هواء أقل من 400 mTorr. قم بإزالة الشرائح والأجهزة من الحجرة ، وضع الجهاز على الشرائح الزجاجية ، واضغط قليلا. ضع الجهاز في فرن 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتعزيز الترابط.
    6. املأ الأجهزة بثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane (F-silane ، 2٪ v / v) في السائل المصمم هندسيا لجعل سطح القناة محبا للفلور. قم بحقن محلول F-silane من خلال المخرج وتأكد من تعرض جميع الأجهزة. انتظر لمدة 5-10 دقائق.
      ملاحظة: يجب تحضير F-silane طازجا. بالإضافة إلى ذلك ، لا ينبغي أن يتعرض F-silane للهواء لفترة طويلة.
    7. نضح محلول F-silane خارج الجهاز من خلال مدخل المحلول المائي. اغسل الجهاز مرتين باستخدام السائل الهندسي ونضح مرة أخرى. ضع الجهاز في فرن 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتبخير الزيت المتبقي.
  3. تشكيل القطيرات وتصنيع الجل الدقيق GelMA
    1. أضف 10 ملغ من ليثيوم فينيل -2،4،6-ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفينات (LAP) إلى 10 مل من DPBS لتحضير محلول بادئ ضوئي (PI) (0.1٪ وزن / حجم). احم المحلول من الضوء عن طريق لفه بورق الألمنيوم.
    2. قم بإذابة الكمية المطلوبة من GelMA في محلول PI وضعها في فرن 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة حتى يتم الحصول على محلول واضح. احم المحلول من الضوء عن طريق لفه بورق الألمنيوم.
    3. لتحضير مرحلة الزيت ، اصنع 2٪ v / v من محلول الفاعل بالسطح المتوافق حيويا في السائل الهندسي.
    4. أدخل أنبوب Tygon في مداخل ومخرج جهاز PDMS. أدخل إبرة حادة 25 جيجا في الطرف الآخر من أنابيب Tygon للمداخل. استخدم الحد الأدنى الممكن لطول الأنبوب.
    5. ضع الجهاز تحت المجهر. حافظ على دفء البيئة (~ 40 درجة مئوية) باستخدام مجفف شعر و / أو سخان مساحة.
    6. قم بتحميل المحاليل المائية والزيتية في محاقن منفصلة متصلة بالجهاز. ابدأ مضخات الحقن بمعدلات تدفق 160 و 80 ميكرولتر / دقيقة لمراحل الزيت (المستمر) والمائي (المشتت) ، على التوالي.
      ملاحظة: ابدأ مرحلة الزيت أولا ؛ تأكد من أن الزيت يملأ القناة ، ثم ابدأ المرحلة المائية.
    7. اجمع القطرات في حاوية وقم بتقييمها في غرفة التصوير عبر التصوير المجهري الضوئي.
    8. ضع القطرات على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل مع حمايتها من الضوء لبدء التشابك المادي GelMA HMP وتحويل القطرات إلى كبسولات هلامية مستقرة عند 4 درجات مئوية.

3. تحويل الهلاميات الدقيقة إلى مسحوق قابل لإعادة التدوير عبر تقنية المستحلب الدقيق إلى مسحوق (MEtoP)

ملاحظة: تم تطوير تقنية MEtoP لتحويل HMPs القائمة على مستحلب الزيت المائي إلى مسحوق الجسيمات الدقيقة (الهلاميات الهوائية) ذات الخصائص المحفوظة ، مثل قابلية الإنعاش والشكل والحجم والتجميع.

  1. لتنفيذ MEtoP ، اجمع HMPs المتشابكة جسديا في السائل الهندسي باستخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المتينة حراريا أو cryovials. افتح أغطية الأنبوب وأغلقها بمسح وشريط مختبري.
  2. قم بتجميد HMPs المتشابكة جسديا في النيتروجين السائل (-196 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق.
  3. انقل الأنابيب المجمدة بالفلاش إلى أداة تجفيف بالتجميد. قم بتجفيف الأنابيب بالتجميد عند ضغط منخفض (على سبيل المثال ، 0.06 ملي بار) لمدة 6 ساعات على الأقل لإنتاج مسحوق.
    ملاحظة: عند الانتهاء من دورة التجفيد ، اكسر الضغط ببطء حتى لا يضيع المسحوق.
  4. أضف 1 مل من محلول PI المبرد (0.1٪ وزن / وزن ، 4 درجات مئوية) إلى المسحوق لعمل معلقات ميكروجيل. دوامة لمدة 5 ثوان ، ثم أجهزة طرد مركزي عند 3000 × جم لمدة 15 ثانية. تخلص من المادة الطافية.
  5. انقل معلق الميكروجيل المعبأ إلى قالب باستخدام ماصة إزاحة موجبة ، متبوعا بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية بطول موجة 400 نانومتر بكثافة 15 ميجاوات / سم2 لمدة 60 ثانية لتشكيل GHS.

figure-protocol-10327
الشكل 2: تحضير مسحوق الجسيمات الدقيقة GelMA عبر تقنية MEtoP. (أ) صور مسحوق GelMA التي تم الحصول عليها من تقنية MEtoP أو التجفيد التقليدي ل HMP. في تقنية MEtoP أو التجفيد التقليدي ، يتم تعليق HMPs في الفاعل بالسطح النفطي أو الوسائط المائية ، على التوالي. يحمي السائل الهندسي المرحلة المشتتة (HMPs) من التجميع ويحافظ على الخصائص الفيزيائية والكيميائية للجسيمات الدقيقة GelMA أثناء التجفيد. (ب) رسم تخطيطي ل HMPs المجففة المحضرة عبر MEtoP مقارنة ب HMP المجفف بالتجميد تقليديا في وسط مائي. (C) صور SEM لجسيمات GelMA الدقيقة المجففة المحضرة عبر MEtoP مقارنة بالتجفيف بالتجميد التقليدي. قضبان المقياس = 2 مم (يسار; A) ، 500 ميكرومتر (يمين ؛ A) ، 10 ميكرومتر (يسار ؛ C) ، و 200 ميكرومتر (يمين ؛ C). تم تعديل هذا الرقم بإذن من شيخي وآخرون.26 الاختصارات: GelMA = الجيلاتين ميثاكريلويل. DPBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات في Dulbecco ؛ MEtoP = مستحلب دقيق إلى مسحوق ؛ HMP = جسيمات هيدروجيل دقيقة ؛ SEM = المجهر الإلكتروني الماسح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. تشكيل جيلما جي أس

ملاحظة: هذا البروتوكول مخصص لإعداد 400 ميكرولتر من معلق ميكروهل. بالنسبة للكميات الأكبر ، هناك حاجة إلى التوسع. للحفاظ على تشابك GelMA HMPs جسديا ، يجب تنفيذ جميع الخطوات عند حوالي 4 درجات مئوية عن طريق وضع حاويات microgel في دلو ماء مثلج.

  1. أضف 400 ميكرولتر من محلول 1H ، 1H-perfluoro-1-octanol (PFO) في السائل الهندسي (20٪ v / v) إلى GelMA HMPs المتشابكة جسديا. ثم ، دوامة لمدة 5 ثوان وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية عند 300 × جم.
    ملاحظة: يجب تحضير محلول PFO في السائل الهندسي طازجا وتخزينه في حاوية مغلقة لمنع التبخر.
  2. قم بإزالة مرحلة الزيت من GelMA HMPs عن طريق الماصة.
  3. أضف 400 ميكرولتر من محلول PI (0.1٪ وزن / حجم) عند 4 درجات مئوية إلى تعليق microgel. ثم ، دوامة لمدة 5 ثوان وأجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 15 ثانية. تخلص من الزيت بعد ذلك.
  4. كرر الخطوة السابقة ولكن أجهزة الطرد المركزي عند 3000 × جم. قم بإزالة المادة الطافية ل GelMA HMPs المعبأة عن طريق الماصة.
  5. انقل GelMA HMPs المعبأة إلى قالب باستخدام ماصة إزاحة موجبة ، متبوعة بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي = 400 نانومتر ، الكثافة = 15 ميجاوات / سم2 ، وقت التعرض = 60 ثانية).

5. الأحبار الحيوية الحبيبية المهندسة نانويا (NGB) للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد ل GHS مع المسامية الدقيقة المحفوظة

  1. أضف 100 مجم من مسحوق الصفائح الدموية النانوية إلى 3 مل من الماء عالي النقاء 4 درجات مئوية لتشكيل تشتت الجسيمات النانوية (3.33٪ وزن / حجم). دوامة التشتت بقوة داخل ثلاجة 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتقشير الجسيمات النانوية المجمعة. تنتج الجسيمات النانوية المقشرة بشكل صحيح تشتتا واضحا.
  2. قم بإذابة 50 مجم من LAP في 5 مل من الماء عالي النقاء 4 درجات مئوية لتحضير محلول PI للمخزون (1٪ وزن / حجم).
  3. أضف 333 ميكرولتر من محلول PI (1٪ وزن / حجم) إلى تشتت الجسيمات النانوية المقشرة. لف بورق الألمنيوم للحماية من الإضاءة المحيطة. دوامة لمدة 1 دقيقة لخلط تشتت الجسيمات النانوية و PI. تركيزات الطين و PI النهائية هي 3٪ وزن / وزن و 0.1٪ وزن / وزن ، على التوالي.
  4. أضف PFO 20٪ v / v في السائل الهندسي (4 °C) إلى GelMA HMPs المتشابكة ماديا بنسبة حجم 1: 1. دوامة بدقة لمدة 5 ثوان. ثم ، أجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 15 ثانية وتجاهل مرحلة النفط التي تحتوي على الفاعل بالسطح.
  5. أضف تشتت الجسيمات النانوية المكمل ب LAP (4 درجات مئوية) إلى GelMA HMPs المغسولة. دوامة لمدة 15 ثانية ، وأجهزة طرد مركزي عند 3000 × جم لمدة 15 ثانية ، وتخلص من الزيت المتبقي في القاع بالإضافة إلى تشتت المواد الطافية.
  6. تخزين التعليق في 4 °C مع حمايته من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم لمدة 1 يوم. منتج هذه الخطوة هو GelMA NGB.
  7. قم بتحميل NGB في حقنة سعة 3 مل ، وأغلق المحقنة المحملة بغطاء وبارافيلم ، وأجهزة طرد مركزي نبضية عند 200 × جم لإزالة الهواء المحبوس. انقل الحبر الحيوي إلى خرطوشة سعة 3 مل باستخدام موصل Luer-Lok أنثى أنثى. أجهزة الطرد المركزي خرطوشة لفترة وجيزة في 200 × غرام مرة أخرى لإزالة الهواء المحبوس. احتفظ ب NGB عند 4 درجات مئوية في الثلاجة قبل الاستخدام.
  8. قبل تحضير الحبر الحيوي المحمل بالخلايا ، قم بإعداد معلق خلية مركز (على سبيل المثال ، خلايا الخلايا الليفية للفأر NIH / 3T3) ، تحتوي على ~ 24 مليون خلية في 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا. قم بتحميل تعليق الخلية في حقنة سعة 3 مل ، وقم بإقران المحقنة المحملة ب NGB والمحقنة المحملة بالخلايا باستخدام موصل Luer-Lok الأنثوي الأنثوي ، وامزج الخلايا و NGB برفق عن طريق الدفع ذهابا وإيابا 40x.
  9. اطبع NGB أو NGB المحمل بالخلايا باستخدام طابعة حيوية مناسبة مع فوهة مخروطية قياسية. قم بتحميل الفوهة في رأس الطباعة سعة 3 مل. حافظ على درجة حرارة فراش الطباعة أقل من 10 درجات مئوية. قم بتحسين معلمات الطباعة مثل السرعة والضغط الخلفي قبل الطباعة.
  10. حدد نوع الركيزة والفوهة (حقنة هوائية سعة 3 مل مزودة بفوهة مخروطية قياسية) ، وقم بمعايرة الطابعة الحيوية باستخدام إرشادات الجهاز ، وحدد ملف gcode أو STL المرغوب فيه ، وابدأ الطباعة.
    ملاحظة: عند إجراء الطباعة الحيوية المحملة بالخلايا ، يجب الحفاظ على جميع المواد والأجهزة تحت خزانة السلامة البيولوجية لتقليل التلوث.
  11. بعد الطباعة ، قم بتعريض البنية لضوء الأشعة فوق البنفسجية للربط الضوئي (الطول الموجي = 400 نانومتر ، الشدة = 15 ميجاوات / سم2 ، وقت التعرض = 60 ثانية).

figure-protocol-16030
الشكل 3: مخططات تكوين ميكروجيل GelMA و GHS. (أ) مخططات فصل الهلام الدقيق GelMA عن الزيت وإعداد NGB. تمت إضافة PFO (20٪ v / v في السائل الهندسي) إلى مستحلب زيت GelMA microgel-Oil بنسبة 1: 1 ، تليها الدوامة والطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 15 ثانية. لتصنيع GelMA GHS ، تمت إضافة حل PI (LAP 0.1٪ w / v في DPBS) إلى GelMA HMPs ، يليه الدوامة والطرد المركزي عند 3000 × جم لمدة 15 ثانية. لتحضير NGB ، تمت إضافة محلول PI (LAP 0.1٪ w / v في الماء عالي النقاء) وتشتت الصفائح الدموية النانوية (3٪ وزن / v في الماء عالي النقاء) إلى تعليق GelMA HMP ، متبوعا بالدوامات والطرد المركزي عند 3000 × جم لمدة 15 ثانية. تم تعديل الشكل 3A بإذن من Ataie، Z. et al.11 (B) تعريض GelMA HMPs المعبأة للضوء ينتج GHS. تم تعديل الشكل 3B بإذن من شيخي وآخرون.15 الاختصارات: GelMA = الجيلاتين ميثاكريلويل. GHS = سقالة هيدروجيل حبيبية ؛ NGB = الحبر الحيوي الحبيبي النانوي ؛ PFO = 1H ، 1H-بيرفلورو-1-أوكتانول ؛ PI = البادئ الضوئي ؛ LAP = ليثيوم فينيل -2،4،6-ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفينات ؛ HMP = جسيمات هيدروجيل دقيقة ؛ DPBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

تم تصنيع GelMA من خلال تفاعل الجيلاتين مع MA ، كما هو موضح في الشكل 1A. من خلال تكييف ظروف التفاعل ، مثل تركيز MA ، تم الحصول على درجات مختلفة من استبدال MA. لتحديد درجة استبدال MA ، تم تقييم GelMA عبر التحليل الطيفي 1H NMR (الشكل 1B). أكدت مجموعات الفينيل الوظيفي?...

Discussion

الجيلاتين ومشتقاته هي المواد الحيوية القائمة على البروتين الأكثر استخداما لتصنيع HMP. يمكن التغلب على التحدي المتمثل في مفاضلة الإنتاجية مقابل حجم الجسيمات أحادية التشتت باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة ذات الاستحلاب التدريجي. هذه الأجهزة قادرة على تكوين أكثر من 40 مليون قطرة في الساعة ، مع...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا T. Pond ، أخصائي دعم الأبحاث في قسم الهندسة الكيميائية بجامعة ولاية بنسلفانيا (ولاية بنسلفانيا) ، وموظفي مختبر التصنيع النانوي في ولاية بنسلفانيا ، والدكتور J. de Rutte من Partillion Bioscience للمساعدة والمناقشة المتعلقة بعمليات التصنيع النانوي. يقر A. شيخي بدعم معهد أبحاث المواد (MRI) وكلية المواد الهندسية على المستوى البشري ، ومركز التقارب لأنظمة المواد الحية متعددة الوظائف (LiMC2) ومجموعة أنظمة المواد الحية والتكيف والطاقة المستقلة (livMatS) برنامج منحة البذور البحثية التعاونية للمواد الحية متعددة الوظائف ، وصندوق بدء التشغيل من ولاية بنسلفانيا. تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور جزئيا من قبل المعهد الوطني للتصوير الطبي الحيوي والهندسة الحيوية (NIBIB) التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت رقم الجائزة R56EB032672.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1H,1H-perfluoro-1-octanolAlfa Aesar, MA, USAB20156-1898% purity
Biopsy punchIntegra Miltex, NY, USA33-31A-P/251.5 mm Biopsy Punch with Plunger System
Blunt needleSANANTS30-002-2525 G
Bruker Avance NEO 400 MHz400 MHz Bruker NEO, MA, USANMR device
CentrifugeEppendorf, Germany5415 C
Centrifuge tubeCelltreat, MA ,USA229423
Coffee filtersBUNN, IL, USA20104.0006BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct
DesiccatorThermo Scientific5311-0250Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD
Deuterium oxideSigma, MA, USA151882
Dialysis membrane (12-14 kDa)Spectrum Laboratories, NJ, USA08-667E
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x)Sigma, MA, USA56064C-10Ldry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture
Erlenmeyer flaskCorning, NY, USA4980Corning PYREX 
EthanolVWR, PA, USA89125-188Koptec 200 proof
External thread cryogenic vials (cryovials)Corning, NY, USA430659
Freeze dryerLabconco, MO, USA71042000Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)
Gelatin powderSigma, MA, USAG1890-5100GType A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom
Glass microscope slidesVWR, PA, USA82027-788
HotplateFOUR E'S SCIENTIFICMI01020035 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F 
KimwipesFischer scientific, MA, USA06-666
KMPR 1000 negative photoresist seriesKayaku Advanced Materials, MA, USA121619KMPR1025 and KMP1035 are included
LAPONITE XLGBYK USA Inc., CT, USA2344265
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)Sigma, MA, USA900889-1G>95%
Luer-Lok connectorBD, NJ, USABD 302995 
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-AlignerSÜSS MicroTeck, GermanNanofabrication device
Methacylate anhydrideSigma, MA, USA276685-100MLcontains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94%
Milli-Q waterMillipore Corporation, MA, USAZRQSVR5WWelectrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System
Novec 7500 engineering fluid3M, MN, USA3M ID 7100003723
OvenVWR, PA, USAVWR-14101410 Vacuum Oven
ParafilmFischer scientific, MA, USAHS234526C
Pasteur pipetteVWR, PA, USA14673-010
Petri dishVWR, PA, USA25384-092polystyrene
Pico-SurfSphere Fluidics, UKC022(5% (w/w) in Novec 7500)
PipetteVWR, PA, USA89079-970
Pipette tipsVWR, PA, USA87006-060
Plasma cleaner chamberHarrick Plasma, NY, USAPDC-001-HP 
PolydimethylsiloxaneDow Corning, MI, USA 2065623SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit
Positive displacement pipetteMicroman E M100E, Gilson, OH, USAM100E
Silicon wafersUniversityWafer, MA, USA452/11964-inch mechanical grade
SpatulaVWR, PA, USA231-0104Disposable
SU-8 Kayaku Advanced Materials, MA, USA
Syringe pumpHarvard Apparatus, MA, USA70-2001PHD 2000
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaneMillipore Sigma, MA, USA448931-10G97%
Tygon tubingsSaint-globain, PA, USAAAD04103 
UV light QUANSVoltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W
Vacuum filtration unitVWR, PA, USA10040-4600.20 µm
VortexFischer scientific, USA14-955-151Mini Vortex Mixer

References

  1. Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine. Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).
  2. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  3. Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
  4. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  5. Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
  6. Muir, V. G., et al. Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. 18 (36), 2201115 (2022).
  7. Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
  8. Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication. Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).
  9. Zoratto, N., et al. In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering. Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).
  10. Yuan, Z., et al. In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care. Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).
  11. Ataie, Z., et al. Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting. Small. 18 (37), 2202390 (2022).
  12. Annabi, N., et al. 25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
  13. Rajabi, N., et al. Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair. Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).
  14. Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity. U.S. Patent Application. , (2021).
  15. Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
  16. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
  17. Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
  18. Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  19. de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
  20. Sheikhi, A., et al. Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization. MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).
  21. Van Den Bulcke, A. I., et al. Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels. Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).
  22. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
  23. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3d printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
  24. Claaßen, C., et al. Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls. Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).
  25. Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids. U.S. Patent Application. , (2022).
  26. Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
  27. Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules. ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).
  28. Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. Mechanical reinforcement of granular hydrogels. Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved