Jelatin Metakriloil Granül Hidrojel İskeleleri: Yüksek Verimli Mikrojel İmalatı, Liyofilizasyon, Kimyasal Montaj ve 3D Biyobaskı

Özet

Bu makalede, mikroakışkan cihazlar kullanılarak yüksek verimli jelatin metakriloil mikrojel üretimi, mikrojellerin yeniden askıya alınabilir toza (mikro-aerojeller) dönüştürülmesi, granüler hidrojel iskeleleri oluşturmak için mikrojellerin kimyasal montajı ve 3D biyobaskı için korunmuş mikroporoziteye sahip granüler hidrojel biyomürekkeplerinin geliştirilmesi için protokoller açıklanmaktadır.

Özet

Hidrojel mikropartiküllerinin (HMP'ler) birleştirilmesiyle üretilen granüler hidrojel iskelelerin (GHS) ortaya çıkması, mikro gözenekli iskele oluşumunu in situ olarak sağlamıştır. Geleneksel dökme hidrojellerin aksine, GHS'deki birbirine bağlı mikro ölçekli gözenekler, bozunmadan bağımsız hücre infiltrasyonunun yanı sıra oksijen, besin ve hücresel yan ürün transferini kolaylaştırır. Metakriloil-modifiye jelatin (GelMA), hücre yapıştırıcısı ve biyolojik olarak parçalanabilir moieties içeren (fotoğraf) kimyasal olarak çapraz bağlanabilen, protein bazlı bir biyopolimer, hücreye duyarlı / öğretici bir biyomateryal olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Toplu GelMA'yı GHS'ye dönüştürmek, doku mühendisliği ve rejenerasyonu için çok sayıda fırsat yaratabilir. Bu makalede, yüksek verimli GelMA mikrojel üretimi, yeniden askıya alınabilir kuru mikrojellere (mikro-aerojeller) dönüştürme, mikrojellerin kimyasal montajı yoluyla GHS oluşumu ve ekstrüzyon biyobaskısı için granüler biyomürekkep üretimi prosedürlerini göstereceğiz. Soğutma ve fotoçapraz bağlama yoluyla sıralı bir fizikokimyasal işlemin mekanik olarak sağlam GHS'nin oluşumunu nasıl sağladığını gösteriyoruz. Işığa erişilemediğinde (örneğin, derin doku enjeksiyonu sırasında), ayrı ayrı çapraz bağlı GelMA HMP'ler, transglutaminazlar kullanılarak enzimatik çapraz bağlama yoluyla biyoortogonal olarak birleştirilebilir. Son olarak, düşük HMP paketleme yoğunluğunda mikrogözenekli GHS'nin üç boyutlu (3D) biyobaskısı, heterojen olarak yüklü nanopartiküllerin ara yüzey kendi kendine montajı yoluyla gösterilmiştir.

Giriş

Doku mühendisliği iskeleleri oluşturmak için HMP yapı taşlarının montajı son birkaç yılda büyük ilgi görmüştür¹. HMP montajı ile üretilen GHS, ayrık yapı taşları arasındaki boşluk boşluklarından kaynaklanan hücre ölçeğinde mikro gözeneklilik de dahil olmak üzere, toplu muadilleriyle karşılaştırıldığında benzersiz özelliklere sahiptir. Enjekte edilebilirlik, modülerlik ve gözeneklilikten ayrılmış sertlik gibi ek özellikler, GHS'yi doku onarımını ve yenilenmesini geliştirmek için umut verici bir platform haline getirir². GHS üretimi için sentetik PEG bazlı polimerler^3,4 ve aljinat⁵ ve hyaluronik asit ^6,7 gibi polisakkaritler dahil olmak üzere farklı biyomalzemeler kullanılmıştır. Doğal olarak türetilmiş polimerler arasında, GHS üretimi için en yaygın protein bazlı biyopolimer, çapraz bağlanabilir, biyouyumlu, biyoyapıştırıcı ve biyolojik olarak parçalanabilir bir biyomalzeme olan GelMA 8,9,10,11'dir ^12,13.

HMP'ler, toplu emülsifikasyon⁸, akış odaklı 14,15 veya adım emülsifikasyon 9,11 mikroakışkan cihazlar,^{harmanlama 16} veya karmaşık koapervasyon^17,18 yoluyla üretilebilir. Genellikle, imalat verimi ile HMP monodispersitesi arasında bir denge vardır. Örneğin, karıştırma tekniği düzensiz şekilli ve yüksek oranda polidağılmış HMP'ler verir. Toplu emülsifikasyon veya karmaşık koaservasyon, büyük hacimlerde çok dağınık küresel HMP'lerin üretilmesini sağlar. Akış odaklı mikroakışkan cihazlar,% <5'lik bir varyasyon katsayısına sahip yüksek oranda monodisperse damlacıklar üretmek için kullanılmıştır, ancak verim önemli ölçüde düşüktür. Kademeli emülsifikasyon mikroakışkan cihazlarda, yüksek oranda paralelleştirilmiş adımlar, monodisperse HMP'lerin^19'unun yüksek verimli imalatını sağlar.

Metakriloil modifiye jelatin (GelMA) HMP yapı taşları ısıya duyarlı ve (fotoğraf) kimyasal olarak çapraz bağlanabilir, bu da kolay GHS üretimi^{sağlar 20}. Üst kritik çözelti sıcaklığının (UCST)²¹ altında soğutulduktan sonra (örneğin, 4 °C'de), bir GelMA çözeltisi içeren damlacıklar fiziksel olarak çapraz bağlı HMP'lere dönüştürülür. Bu HMP yapı taşları daha sonra sıkışmış mikrojel süspansiyonları elde etmek için dış kuvvetler (örneğin, santrifüjleme yoluyla) kullanılarak paketlenir. Parçacıklar arası bağlantılar, mekanik olarak sağlam GHS^14'ü oluşturmak için bitişik HMP'ler arasında (fotoğraf) kimyasal çapraz bağlama yoluyla kurulur. GHS'nin en önemli özelliklerinden biri, in vitro¹¹ facile hücre penetrasyonunu ve in vivo^22'de gelişmiş doku büyümesini sağlayan mikro gözenekliliktir. HMP'lerin üç boyutlu (3D) biyobaskısı, geleneksel olarak sıkıca paketlenmiş mikrojel süspansiyonları kullanılarak gerçekleştirilir ve mikroporoziteden ödün verir²³.

Son zamanlarda, heterojen olarak yüklü nanopartiküllerin adsorpsiyonu yoluyla GelMA mikrojellerinin ara yüz nanomühendisliğine dayanan yeni bir granüler biyomürekkep sınıfı geliştirdik, ardından nanopartikül geri dönüşümlü kendi kendine montaj. Bu strateji, gevşek bir şekilde paketlenmiş mikrojelleri kesme verimli ve ekstrüzyon 3D biyo-yazdırılabilir hale getirir, bu da eklemeli olarak üretilen GHS^11'in mikro ölçekli gözenekliliğini korur. Bu makalede, yüksek verimli GelMA damlacık üretimi, bu damlacıkların fiziksel olarak çapraz bağlı HMP'lere dönüştürülmesi, yeniden askıya alınabilir toz kullanılarak GelMA HMP'lerin üretilmesi, GelMA GHS oluşumu, GelMA nanomühendislik granüler biyomürekkep (NGB) hazırlığı ve 3D biyobaskı yöntemleri sunulmaktadır.

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, aletler ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. GelMA sentezi

NOT: GelMA sentezi kimyasal bir davlumbazda yapılmalı ve her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanılmalıdır.

1. Bir Erlenmeyer şişesine 200 mL Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS, 1x) ekleyin ve çözeltiyi 50 ° C'ye ulaşana kadar ısıtın. Buharlaşmayı önlemek için şişeyi alüminyum folyo ile örtün.
2. DPBS çözeltisine 50 ° C'de 20 g jelatin tozu ekleyin ve toz tamamen çözünene kadar 240 rpm'de karıştırın.
3. GelMA'yı sırasıyla yüksek, orta veya düşük derecede metakriloil ikamesi ile sentezlemek için bir cam Pasteur pipeti aracılığıyla jelatin çözeltisine damla damla 16, 2.5 veya 0.5 mL metakrilat anhidrit (MA) ekleyin.
   DİKKAT: MA tehlikeli bir maddedir. MA ile çalışırken uygun KKD kullanılmalıdır. MA ayrıca ışığa duyarlıdır, bu nedenle şişeyi alüminyum folyo ile sararak reaksiyonu ışıktan koruyun.
4. 2 saat sonra, reaksiyonu durdurmak için 50 ° C'de 400 mL DPBS ekleyin. Karıştırmanın 50 °C'de 10 dakika boyunca devam etmesine izin verin.
5. Çözeltiyi 12-14 kDa moleküler ağırlık kesme ile bir diyaliz membran borusuna dökün ve ardından tüpü 40 ° C ultra saf su ile doldurulmuş 5 L'lik bir beher içine yerleştirin. Suyu 240 rpm ve 40 °C'de karıştırın.
6. Çözeltiyi 10 gün boyunca ultra saf suya karşı diyaliz edin ve reaksiyona girmemiş metakrilat anhidrit, yan ürünler ve diğer safsızlıkları gidermek için suyu günde 2 kez değiştirin.
7. 10 gün sonra, GelMA çözeltisine 40 ° C'de 400 mL ultra saf su ekleyin. Çözeltiyi 240 rpm'de 15 dakika karıştırın.
8. Kahve filtrelerini kullanarak çözeltiyi iki kez filtreleyin, ardından 0,2 μm vakum filtreleme ünitesi ile vakum filtrelemesi yapın.
9. Filtrelenmiş çözeltinin 25 mL'sini 50 mL santrifüj tüplerine dökün ve tüpleri yatay olarak yerleştirerek -80 ° C'de dondurun.
10. 2 gün sonra, kapakları çıkarın ve santrifüj tüplerini laboratuvar mendilleriyle örtün. Mendilleri sıkıca tutmak için bant veya lastik bant kullanın.
11. Beyaz katı GelMA elde etmek için dondurulmuş GelMA çözeltisini liyofilize edin.
12. Proton nükleer manyetik rezonans (¹H NMR) spektroskopisi yapmak için, ayrı ayrı 1 mL döteryum oksit (_D2O) içine 30 mg jelatin tozu (kontrol) veya liyofilize GelMA ekleyin ve jelatin tozu veya GelMA tamamen çözünene kadar numuneleri 37 ° C'de tutun.
13. ¹H NMR spektrumunu elde edin ve aromatik asitleri ve lizin metilen proton zirvelerini sırasıyla ~ 6.5-7.5 ve ~ 3.0 ppm'lik kimyasal kaymalarda entegre ederek metakriloil ikame derecesini belirleyin. Aromatik asitlerin pik noktasını referans olarak kullanın ve denkleme (1) dayanarak lizin metilen piklerini kullanarak ikame derecesini (DS) belirleyin:
    DS (%) = [1 - (GelMA'da lizin metilen alanı / Jelatinde lizin metilen alanı)] × 100 (1)

Resim 1: GelMA sentezi ve karakterizasyonu. (A) GelMA sentez reaksiyonu. Jelatin, 2 saat boyunca 50 ° C'de metakrilik anhidrit ile modifiye edilir. (B) Jelatin ve GelMA'nın proton nükleer manyetik rezonans (¹H NMR) spektrumları: (a) kalibrasyon için referans olarak seçilen aromatik asitler için zirve, (b) jelatinin MA modifikasyonundan sonra vinil fonksiyonel grup zirveleri ve (c) lizin proteinleri için zirve. Bu örnekte, MA ikame derecesi% 71 ±% 3 idi (n = 3). Bu rakam Ataie et ^al.11 Kısaltmaların izniyle değiştirilmiştir: GelMA = jelatin metakriloil; DPBS = Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini; MA = metakriloil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Yüksek verimli GelMA mikrojel imalatı

1. Cihaz ana kalıp mikrofabrikasyonu
   NOT: Ana kalıplar, KMPR 1000 negatif fotorezistli seri¹⁹ kullanılarak yumuşak litografi yoluyla mikrofabrikasyon yapılabilir.
   1. KMPR 1025 ve 1035'i bir gecede çözün. Işığa maruz kalmaktan kaçının.
   2. Gofret üzerindeki ilk katmanı kaplamak için, yaklaşık 5 cm'lik bir fotodirenç çemberi oluşturmak için KMPR 1025'i doğrudan gofretin ortasına ekleyin. Sıkma kaplayıcıyı 30 s boyunca 3.000 rpm'de çalıştırın.
   3. 100 °C'lik bir ocakta 12 dakika yumuşak pişirin. Ardından, soğutma plakasında 5 dakika soğutun.
   4. İlk katman maskesini boş soda kirecine takın, ardından kaplanmış gofreti 645 mJ /^cm2 dozaj için bir maske hizalayıcı kullanarak UV ışığına maruz bırakın.
   5. 100 ° C'lik bir ocakta 3 dakika pişirin. Soğutma plakasında 5 dakika soğutun.
      NOT: Bu adımdan sonra geliştirmeyin. Sürecin sonunda sadece bir kez geliştirin.
   6. KMPR 1035'i kullanarak gofret üzerindeki ikinci katmanı döndürün. Sıkma kaplayıcıyı 30 s boyunca 1.000 rpm'de çalıştırın.
   7. 100 °C'lik bir ocakta 30 dakika yumuşak pişirin. Soğutma plakasında 5 dakika soğutun.
   8. İkinci katman maskesini boş soda kirecine takın ve hizalayıcıyı kullanarak ikinci maskeyi standart hizalama işaretleriyle hizalayın. 2.000 mJ/^cm2'ye kadar bir maske hizalayıcı kullanarak UV ışığına maruz bırakın.
   9. 100 ° C'lik bir ocakta 5 dakika pişirin.
   10. SU-8 geliştiricisinde >6 dakika boyunca geliştirin.
       NOT: Gofret sütlü görünüyorsa, geliştirme daha uzun süre devam ettirilmelidir. Daha iyi bir sonuç için her seferinde ve arada yeni geliştirici kullanın.
   11. İzopropanol ile püskürtün. Gofretin temiz olduğundan ve sütlü kalıntı kalmadığından emin olun. Gofreti azot (_N2) gazı kullanarak iyice kurulayın.
2. Mikroakışkan cihaz imalatı
   1. 50 g polidimetilsiloksan (PDMS) baz kısmını şeffaf bir plastik kaba dökün. Ardından, plastik kaba 5 g çapraz bağlayıcı ekleyin. Tabanı ve çapraz bağlayıcıyı kremsi bir doku elde edene kadar bir spatula kullanarak kuvvetlice karıştırın.
   2. Berraklaşana kadar 20 dakika boyunca bir kurutucu kullanarak karışımın gazını vakumlayın. Karışımı, içine yerleştirilen ve bir Petri kabına bantlanan ana kalıba dökün.
      NOT: Dökülen PDMS'nin kalınlığının (yüksekliğinin) ≤8 mm olduğundan emin olun.
   3. Petri kabını kurutucuya koyun ve tüm kabarcıklar çıkarılana kadar PDMS karışımını 20 dakika boyunca tekrar gazdan arındırın. Petri kabını, PDMS çapraz bağlanana kadar 2 saat boyunca 70 ° C'lik bir fırına koyun. Petri kabını fırından çıkarın ve soğumasını bekleyin.
   4. Bir neşter kullanarak cihazları kalıptan kesin. Cihazları ana kalıptan yavaşça ayırın. Giriş ve çıkıştan delikler açmak için biyopsi zımbasını (1,5 mm çapında) kullanın.
   5. Maskeleme bandını kullanarak PDMS cihazlarından ve cam kızaklardan tozları temizleyin ve cam kızakları ve cihazları bir plazma temizleme odasına yerleştirin. Plazma işlemini 400 mTorr'un altındaki hava basıncıyla 45 s (oda mora döndüğünde başlayarak) gerçekleştirin. Slaytları ve cihazları odadan çıkarın, cihazı cam slaytların üzerine yerleştirin ve hafif bir basınç uygulayın. Yapıştırmayı arttırmak için cihazı 70 ° C fırında 30 dakika bekletin.
   6. Kanal yüzeyini florofilik hale getirmek için cihazları mühendislik sıvısında trikloro(1H,1H,2H,2H-perflorooktil)silan (F-silan, %2 v/v) ile doldurun. F-silan çözeltisini prizden enjekte edin ve tüm cihazların açıkta olduğundan emin olun. 5-10 dakika bekleyin.
      NOT: F-silan taze olarak hazırlanmalıdır. Ek olarak, F-silan uzun süre havaya maruz bırakılmamalıdır.
   7. F-silan çözeltisini sulu çözelti girişinden cihazdan dışarı aspire edin. Mühendislik sıvısını kullanarak cihazı iki kez yıkayın ve tekrar aspire edin. Kalan yağı buharlaştırmak için cihazı 70 °C fırında 30 dakika bekletin.
3. Damlacık oluşumu ve GelMA mikrojel imalatı
   1. Bir fotobaşlatıcı (PI) çözeltisi (% 0,1 w / v) hazırlamak için 10 mL DPBS'ye 10 mg lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP) ekleyin. Çözeltiyi alüminyum folyoya sararak ışıktan koruyun.
   2. İstenilen miktarda GelMA'yı PI çözeltisi içinde çözün ve berrak bir çözelti elde edilene kadar 1 saat boyunca 37 °C fırında bekletin. Alüminyum folyoya sararak çözeltiyi ışıktan koruyun.
   3. Yağ fazını hazırlamak için, mühendislik sıvısında% 2 v / v biyouyumlu yüzey aktif madde çözeltisi yapın.
   4. Tygon borusunu PDMS cihazının giriş ve çıkışlarına takın. Girişler için Tygon borusunun diğer ucuna 25 G künt bir iğne yerleştirin. Mümkün olan minimum boru uzunluğunu kullanın.
   5. Cihazı mikroskop altına yerleştirin. Bir saç kurutma makinesi ve / veya bir alan ısıtıcı kullanarak ortamı sıcak tutun (~ 40 ° C).
   6. Sulu ve yağ çözeltilerini cihaza bağlı ayrı şırıngalara yükleyin. Şırınga pompalarını, yağ (sürekli) ve sulu (dağınık) fazlar için sırasıyla 160 ve 80 μL/dak akış hızlarıyla çalıştırın.
      NOT: Önce yağ fazını başlatın; Yağın kanalı doldurduğundan emin olun, ardından sulu fazı başlatın.
   7. Damlacıkları bir kapta toplayın ve optik mikroskopi görüntüleme ile görüntüleme odasında değerlendirin.
   8. GelMA HMP fiziksel çapraz bağlamayı başlatmak için damlacıkları gece boyunca 4 ° C'ye yerleştirin ve damlacıkları 4 ° C'de kararlı mikrojellere dönüştürün.

3. Mikro mühendislik ürünü emülsiyon-to-toz (MEtoP) teknolojisi ile mikrojellerin yeniden askıya alınabilir toza dönüştürülmesi

NOT: Su içinde yağ emülsiyonu bazlı HMP'leri, yeniden askıya alınabilirlik, şekil, boyut ve montaj gibi korunmuş özelliklere sahip mikropartikül tozuna (mikro-aerojeller) dönüştürmek için MEtoP teknolojisi geliştirilmiştir.

1. MEtoP'yi uygulamak için, termal olarak dayanıklı mikrosantrifüj tüpleri veya kriyovyaller kullanarak mühendislik sıvısında fiziksel olarak çapraz bağlı HMP'leri toplayın. Tüp kapaklarını açın ve bir laboratuvar mendili ve bandı ile kapatın.
2. Fiziksel olarak çapraz bağlı HMP'leri sıvı azotta (-196 ° C) 10 dakika boyunca derin dondurun.
3. Flaş dondurulmuş tüpleri bir dondurarak kurutucu cihaza aktarın. Toz elde etmek için tüpleri düşük basınçta (örneğin, 0,06 mbar) en az 6 saat boyunca liyofilize edin.
   NOT: Liyofilizasyon döngüsü bittiğinde, tozun kaybolmaması için basıncı yavaşça kırın.
4. Mikrojel süspansiyonları yapmak için toza 1 mL soğutulmuş PI çözeltisi (% 0,1 w / s, 4 ° C) ekleyin. 5 sn boyunca vorteks, daha sonra 15 s için 3.000 × g'da santrifüj. Supernatan'ı atın.
5. Paketlenmiş mikrojel süspansiyonunu pozitif deplasmanlı bir pipet kullanarak bir kalıba aktarın, ardından GHS oluşturmak için 60 sn boyunca 15 mW/^cm2 yoğunluğa sahip 400 nm dalga boyunda UV ışığına maruz bırakın.

Resim 2: MEtoP teknolojisi ile GelMA mikropartikül tozu hazırlama. (A) MEtoP teknolojisinden veya HMP'nin konvansiyonel liyofilizasyonundan elde edilen GelMA tozunun görüntüleri. MEtoP teknolojisinde veya konvansiyonel liyofilizasyonda, HMP'ler sırasıyla yağ-yüzey aktif madde veya sulu ortamda askıya alınır. Mühendislik sıvısı, dağınık fazı (HMP'ler) agregasyondan korur ve liyofilizasyon sırasında GelMA mikropartiküllerinin fizyokimyasal özelliklerini korur. (B) MEtoP aracılığıyla hazırlanan kurutulmuş HMP'lerin sulu bir ortamda geleneksel olarak liyofilize HMP ile karşılaştırıldığında şematik gösterimi. (C) MEtoP aracılığıyla hazırlanan kurutulmuş GelMA mikropartiküllerinin SEM görüntüleri, geleneksel liyofilizasyon ile karşılaştırıldığında. Ölçek çubukları = 2 mm (sol; A), 500 μm (sağda; A), 10 μm (solda; C) ve 200 μm (sağda; C). Bu şekil Şeyhi ve ^ark.26 Kısaltmaların izniyle değiştirilmiştir: GelMA = jelatin metakriloil; DPBS = Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini; MEtoP = mikromühendislik ürünü emülsiyondan toza; HMP = hidrojel mikropartikül; SEM = taramalı elektron mikroskobu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. GelMA GHS oluşumu

NOT: Bu protokol 400 μL mikrojel süspansiyonu hazırlamak içindir. Daha büyük miktarlar için ölçek büyütme gereklidir. GelMA HMP'leri fiziksel olarak çapraz bağlı tutmak için, mikrojel kapları buzlu su kovasına yerleştirerek tüm adımlar yaklaşık 4 ° C'de gerçekleştirilmelidir.

1. Fiziksel olarak çapraz bağlı GelMA HMP'lere mühendislik sıvısında 400 μL 1H, 1H-perfloro-1-oktanol (PFO) çözeltisi (% 20 v / v) ekleyin. Daha sonra, 5 s vorteks ve 300 × g'da 15 s santrifüj.
   NOT: Mühendislik sıvısındaki PFO çözeltisi taze olarak hazırlanmalı ve buharlaşmayı önlemek için kapalı bir kapta saklanmalıdır.
2. Yağ fazını pipetleme yoluyla GelMA HMP'lerden çıkarın.
3. Mikrojel süspansiyonuna 4 °C'de 400 μL PI çözeltisi (%0,1 w/v) ekleyin. Daha sonra, 5 s için vorteks ve 15 s için 300 × g'da santrifüj. Daha sonra yağı atın.
4. Önceki adımı tekrarlayın, ancak 3.000 × g'da santrifüj yapın. Paketlenmiş GelMA HMP'lerin süpernatantını pipetleme yoluyla çıkarın.
5. Paketlenmiş GelMA HMP'leri pozitif yer değiştirmeli bir pipet kullanarak bir kalıba aktarın, ardından UV ışığına maruz bırakın (dalga boyu = 400 nm, yoğunluk = 15 mW/^cm2, pozlama süresi = 60 sn).

5. Korunmuş mikroporoziteye sahip GHS'nin 3D biyobaskısı için nanomühendislik granüler biyomürekkepler (NGB)

1. Bir nanopartikül dispersiyonu oluşturmak için 3 mL 4 °C ultra saf suya 100 mg nanoplatelet tozu ekleyin (% 3.33 w / v). Aksi takdirde toplanmış nanopartikülleri pul pul dökmek için dispersiyonu 4 ° C'lik bir buzdolabında 15 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde vorteksleyin. Düzgün pul pul dökülmüş nanopartiküller net bir dağılım sağlar.
2. Bir stok PI çözeltisi hazırlamak için 50 mg LAP'yi 5 mL 4 °C ultra saf suda çözün (% 1 w / v).
3. Pul pul dökülmüş nanopartikül dispersiyonuna 333 μL PI çözeltisi (% 1 w / v) ekleyin. Ortam ışığına karşı korumak için alüminyum folyoya sarın. Nanopartikül dispersiyonu ve PI'yi karıştırmak için 1 dakika boyunca vorteks. Son kil ve PI konsantrasyonları sırasıyla% 3 w / v ve% 0.1 w / v'dir.
4. Fiziksel olarak çapraz bağlı GelMA HMP'lere 1:1 hacim oranında mühendislik sıvısında PFO %20 v/v (4 °C) ekleyin. 5 s boyunca iyice vorteks. Daha sonra, 15 s boyunca 300 × g'da santrifüj yapın ve yüzey aktif maddeyi içeren yağ fazını atın.
5. LAP takviyeli nanopartikül dispersiyonunu (4 °C) yıkanmış GelMA HMP'lere ekleyin. 15 s için vorteks, 15 s için 3.000 × g'da santrifüj yapın ve altta kalan yağı ve süpernatant dispersiyonu atın.
6. Süspansiyonu 4 ° C'de saklayın ve 1 gün boyunca alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun. Bu adımın ürünü GelMA NGB'dir.
7. NGB'yi 3 mL'lik bir şırıngaya yükleyin, yüklü şırıngayı bir kapak ve parafilmle kapatın ve sıkışmış havayı gidermek için 200 × g'da santrifüj darbesi santrifüjü yapın. Dişi Luer-Lok konektörünü kullanarak biyomürekkebi 3 mL'lik bir kartuşa aktarın. Sıkışan havayı gidermek için kartuşu tekrar 200 × g'da kısa bir süre santrifüj edin. NGB'yi kullanmadan önce buzdolabında 4 °C'de saklayın.
8. Hücre yüklü biyomürekkep preparatından önce, 100 μL hücre kültürü ortamında ~ 24 milyon hücre içeren konsantre bir hücre süspansiyonu (örneğin, NIH / 3T3 murin fibroblast hücreleri) hazırlayın. Hücre süspansiyonunu 3 mL'lik bir şırıngaya yükleyin, RGB yüklü şırıngayı ve hücre yüklü şırıngayı dişi-dişi Luer-Lok konektörü kullanarak birleştirin ve hücreleri ve NGB'yi 40x ileri geri iterek yavaşça karıştırın.
9. NGB veya hücre yüklü NGB'yi, standart konik nozullu uygun bir biyoyazıcı kullanarak yazdırın. Püskürtme ucunu 3 mL yazıcı kafasına takın. Baskı yatağı sıcaklığını 10 °C'nin altında tutun. Yazdırmadan önce hız ve geri basınç gibi yazdırma parametrelerini optimize edin.
10. Alt tabaka ve nozul tipini seçin (standart konik nozul ile donatılmış pnömatik 3 mL şırınga), cihaz yönergelerini kullanarak biyoyazıcıyı kalibre edin, istediğiniz gcode veya STL dosyasını seçin ve yazdırmaya başlayın.
    NOT: Hücre yüklü biyobaskı yapılırken, kontaminasyonu en aza indirmek için tüm malzemeler ve cihazlar biyolojik güvenlik kabini altında tutulmalıdır.
11. Baskıdan sonra, fotoçapraz bağlantı için yapıyı UV ışığına maruz bırakın (dalga boyu = 400 nm, yoğunluk = 15 mW /^cm2, pozlama süresi = 60 sn).

Şekil 3: GelMA mikrojel şemaları ve GHS oluşumu . (A) GelMA mikrojelinin yağdan ayrılması ve NGB preparatının şemaları. PFO (mühendislik sıvısında% 20 v / v), GelMA mikrojel-yağ emülsiyonuna 1: 1 hacimsel bir oranda eklendi, ardından 15 s boyunca 300 × g'da vorteks ve santrifüjleme yapıldı. GelMA GHS'yi üretmek için, GelMA HMP'lere PI çözeltisi (DPBS'de LAP% 0.1 w / v) eklendi, ardından 15 s için 3.000 × g'da vorteks ve santrifüjleme yapıldı. NGB'yi hazırlamak için, GelMA HMP süspansiyonuna PI çözeltisi (ultra saf suda LAP% 0.1 w / v) ve nanoplatelet dispersiyonu (ultra saf suda% 3 w / v) eklendi, ardından 15 s için 3.000 × g'da vorteksleme ve santrifüjleme yapıldı. Şekil 3A , Ataie, Z. ve ^ark.11 (B) Paketlenmiş GelMA HMP'lerin ışık verimine maruz bırakılması GHS'nin izniyle değiştirilmiştir. Şekil 3B , Sheikhi et ^al.15 Kısaltmalar: GelMA = jelatin metakriloil; GHS = granüler hidrojel iskele; NGB = nanomühendislik ürünü granüler biyomürekkep; PFO = 1H,1H-perfloro-1-oktanol; PI = fotobaşlatıcı; LAP = lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat; HMP = hidrojel mikropartikül; DPBS = Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

GelMA, Şekil 1A'da gösterildiği gibi jelatinin MA ile reaksiyonu yoluyla sentezlendi. MA konsantrasyonu gibi reaksiyon koşullarını uyarlayarak, farklı derecelerde MA ikamesi elde edildi. MA ikame derecesini ölçmek için, GelMA ¹H NMR spektroskopisi ile değerlendirildi (Şekil 1B). ~ 5-6 ppm'lik kimyasal kaymalarda temsili zirvelere sahip vinil fonksiyonel gruplar, jelatinden başarılı GelMA sentezini doğruladı. Diyaliz ve steri...

Tartışmalar

Jelatin ve türevleri, HMP üretimi için en yaygın kullanılan protein bazlı biyomalzemelerdir. Verim ve partikül boyutu monodispersite dengesi zorluğu, kademeli emülsifikasyon mikroakışkan cihazları kullanılarak aşılabilir. Bu cihazlar saatte 40 milyondan fazla damlacık oluşturabilir ve varyasyon katsayısı %5'ten ^az27'dir. Bu makalede, GelMA çözeltileri içeren damlacıkların mikrofabrikasyonunu tartıştık ve ardından bunları GelMA HMP'lere, toza, GHS'ye ve NGB'ye dönüşt...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1H,1H-perfluoro-1-octanol	Alfa Aesar, MA, USA	B20156-18	98% purity
Biopsy punch	Integra Miltex, NY, USA	33-31A-P/25	1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System
Blunt needle	SANANTS	30-002-25	25 G
Bruker Avance NEO 400 MHz	400 MHz Bruker NEO, MA, USA		NMR device
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5415 C
Centrifuge tube	Celltreat, MA ,USA	229423
Coffee filters	BUNN, IL, USA	20104.0006	BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct
Desiccator	Thermo Scientific	5311-0250	Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD
Deuterium oxide	Sigma, MA, USA	151882
Dialysis membrane (12-14 kDa)	Spectrum Laboratories, NJ, USA	08-667E
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x)	Sigma, MA, USA	56064C-10L	dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture
Erlenmeyer flask	Corning, NY, USA	4980	Corning PYREX
Ethanol	VWR, PA, USA	89125-188	Koptec 200 proof
External thread cryogenic vials (cryovials)	Corning, NY, USA	430659
Freeze dryer	Labconco, MO, USA	71042000	Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)
Gelatin powder	Sigma, MA, USA	G1890-5100G	Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom
Glass microscope slides	VWR, PA, USA	82027-788
Hotplate	FOUR E'S SCIENTIFIC	MI0102003	5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F
Kimwipes	Fischer scientific, MA, USA	06-666
KMPR 1000 negative photoresist series	Kayaku Advanced Materials, MA, USA	121619	KMPR1025 and KMP1035 are included
LAPONITE XLG	BYK USA Inc., CT, USA	2344265
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Sigma, MA, USA	900889-1G	>95%
Luer-Lok connector	BD, NJ, USA	BD 302995
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner	SÜSS MicroTeck, German		Nanofabrication device
Methacylate anhydride	Sigma, MA, USA	276685-100ML	contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94%
Milli-Q water	Millipore Corporation, MA, USA	ZRQSVR5WW	electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System
Novec 7500 engineering fluid	3M, MN, USA		3M ID 7100003723
Oven	VWR, PA, USA	VWR-1410	1410 Vacuum Oven
Parafilm	Fischer scientific, MA, USA	HS234526C
Pasteur pipette	VWR, PA, USA	14673-010
Petri dish	VWR, PA, USA	25384-092	polystyrene
Pico-Surf	Sphere Fluidics, UK	C022	(5% (w/w) in Novec 7500)
Pipette	VWR, PA, USA	89079-970
Pipette tips	VWR, PA, USA	87006-060
Plasma cleaner chamber	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-001-HP
Polydimethylsiloxane	Dow Corning, MI, USA	2065623	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit
Positive displacement pipette	Microman E M100E, Gilson, OH, USA	M100E
Silicon wafers	UniversityWafer, MA, USA	452/1196	4-inch mechanical grade
Spatula	VWR, PA, USA	231-0104	Disposable
SU-8	Kayaku Advanced Materials, MA, USA
Syringe pump	Harvard Apparatus, MA, USA	70-2001	PHD 2000
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Millipore Sigma, MA, USA	448931-10G	97%
Tygon tubings	Saint-globain, PA, USA	AAD04103
UV light	QUANS		Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W
Vacuum filtration unit	VWR, PA, USA	10040-460	0.20 µm
Vortex	Fischer scientific, USA	14-955-151	Mini Vortex Mixer