نموذج فأر السحار السيليسي الذي تم إنشاؤه عن طريق الاستنشاق المتكرر لغبار السيليكا البلوري

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة لإنشاء نموذج فأر من السحار السيليكي من خلال التعرض المتكرر لمعلقات السيليكا عن طريق التنقيط الأنفي. يمكن لهذا النموذج أن يحاكي بكفاءة وسهولة ومرونة العملية المرضية لداء السيليكات البشري مع قابلية عالية للتكرار والاقتصاد.

Abstract

يمكن أن يحدث السحار السيليسي بسبب التعرض لغبار السيليكا البلوري التنفسي (CSD) في بيئة صناعية. تمت دراسة الفيزيولوجيا المرضية والفحص والعلاج من السحار السيليسي في البشر على نطاق واسع باستخدام نموذج السحار السيليسي للفئران. من خلال جعل الفئران تستنشق CSD بشكل متكرر في رئتيها ، يمكن للفئران تقليد الأعراض السريرية لداء السيليكات البشري. هذه المنهجية عملية وفعالة من حيث الوقت والإخراج ولا تسبب إصابة ميكانيكية للجهاز التنفسي العلوي بسبب الجراحة. علاوة على ذلك ، يمكن لهذا النموذج أن يحاكي بنجاح عملية التحول الحاد / المزمن للسحار السيليسي. وكانت الإجراءات الرئيسية على النحو التالي. تم طحن مسحوق CSD المعقم 1-5 ميكرومتر بالكامل ، وتعليقه في محلول ملحي ، وتشتيت في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة. تحولت الفئران تحت التخدير الناجم عن الأيزوفلوران من التنفس السريع الضحل إلى الشفط العميق البطيء لمدة 2 ثانية تقريبا. تم وضع الماوس في راحة اليد ، ولمس طرف الإبهام بلطف حافة شفة فك الماوس لتقويم مجرى الهواء. بعد كل زفير ، تنفست الفئران في تعليق السيليكا قطرة قطرة من خلال فتحة أنف واحدة ، وتكمل العملية في غضون 4-8 ثوان. بعد أن استقر تنفس الفئران ، تم ضرب صدرها ومداعبتها لمنع استنشاق CSD من السعال. ثم أعيدت الفئران إلى القفص. في الختام ، يمكن لهذا النموذج تحديد CSD على طول الممر الفسيولوجي النموذجي للجزيئات الصغيرة إلى الرئة ، من الجهاز التنفسي العلوي إلى القصيبات الطرفية والحويصلات الهوائية. يمكنه أيضا تكرار التعرض المتكرر للموظفين بسبب العمل. يمكن تنفيذ النموذج من قبل شخص واحد ولا يحتاج إلى معدات باهظة الثمن. إنه يحاكي بشكل ملائم وفعال ميزات مرض السيليكات البشري مع قابلية عالية للتكرار.

Introduction

يتعرض العمال حتما لغبار السيليكا البلوري غير المنتظم (CSD) ، والذي يمكن استنشاقه وهو أكثر سمية في العديد من السياقات المهنية ، بما في ذلك التعدين والفخار والزجاج ومعالجة الكوارتز والخرسانة ^1,2. تسبب حالة استنشاق الغبار المزمنة المعروفة باسم السحار السيليسي تليف الرئة التدريجي³. وفقا للبيانات الوبائية ، انخفض معدل الإصابة بداء السيليكاتيس على مستوى العالم خلال العقود القليلة الماضية ، ولكن في السنوات الأخيرة ، كان يتزايد ويؤثر على الشباب⁴،^5،6. تمثل الآلية الأساسية لداء السيليكاتس تحديا كبيرا للبحث العلمي بسبب بدايته الخبيثة وفترة الحضانة الطويلة. لا يزال من غير المعروف كيف يتطور السحار السيليسي. علاوة على ذلك ، لا توجد أدوية حالية يمكن أن توقف تطور السحار السيليسي والتليف الرئوي العكسي.

تتضمن نماذج الفئران الحالية للسحار السيليسي ابتلاع القصبة الهوائية لتعليق مختلط من CSD. على سبيل المثال ، إعطاء CSD في الرئتين عن طريق اعتماد صدمة القصبة الهوائية العنقية بعد التخدير لا يتوافق مع التعرض البشري المتكرر لصبغ^{الغبار 7}. يمكن دراسة تأثير التعرض للغبار المحيط على الأفراد من خلال تعريضهم ل CSD في شكل الهباء الجوي ، والذي يعكس بدقة أكبر التركيزات البيئية لهذه المادة^{السامة 8}. ومع ذلك ، لا يمكن ببساطة استنشاق CSD البيئي مباشرة في الرئتين بسبب التركيب الفسيولوجي الفريد لأنف الفأر⁹. علاوة على ذلك ، فإن المعدات المرتبطة بهذه التكنولوجيا باهظة الثمن ، مما دفع الباحثين إلى إعادة تقييم نموذج السحار^{السيليسي للفأر 10}. عن طريق استنشاق تعليق CSD من خلال بالتنقيط الأنفي خمس مرات في غضون 2 أسابيع ، كان من الممكن بناء نموذج ديناميكي من السحار السيليسي. هذا النموذج متسق وآمن مع سهولة الاستخدام. من المهم ملاحظة أن هذه الدراسة تسمح بالاستنشاق المتكرر ل CSD في الفئران. من المتوقع أن يكون نموذج السحار السيليسي للفأر الذي تم إنشاؤه من خلال هذا الإجراء أكثر فائدة لمتطلبات البحث.

Protocol

اتبعت جميع الإجراءات المبادئ التوجيهية لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (منشور المعاهد الوطنية للصحة رقم 8023 ، المنقح عام 1978) وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها في كلية الطب بجامعة آنهوي للعلوم والتكنولوجيا.

1. إدارة وتغذية الفئران

1. قم بتعيين 20 فأرا ذكرا C57BL / 6 سليما للمجموعات التجريبية أو المركبات بنسبة 1: 1. تأقلم الفئران مع البيئة الجديدة لمدة 1 أسبوع.
2. توفير وقت إضاءة ثابت يبلغ 12 ساعة في اليوم. استخدم مفتاح التحكم في الوقت للحصول على توقيت دقيق.

2. إعداد تعليق CSD

1. على الأقل 1 يوم قبل قطرات الأنف ، وطحن السيليكا في هاون العقيق لمدة 0.5 ساعة.
2. مراقبة حجم وشكل جزيئات الكريستال. التقط صورا تمثيلية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM).
   1. استخدم شريطا موصلا لربط الجسيمات لتحضير العينة ل SEM. استخدم مجفف الشعر للتخلص برفق من جزيئات السيليكون غير المرتبطة بإحكام.
   2. قم بإخلاء غرفة العينة ، وقم بتشغيل الضغط العالي ، والتقط الصورة.
      ملاحظة: مسافة العمل (WD) بين العدسة والعينة 5.9 مم ، والجهد المتسارع 2.0 كيلو فولت ، والتكبير (Mag) 100000 ضعف ، باستخدام كاشف SignalA. يتم تشتيت الجسيمات مع تبلور غير منتظم ، وحوالي 80 ٪ يبلغ قطرها 1-5 ميكرومتر (الشكل 1 أ).
3. اصنع معلقا معقم CSD عيار 20 مجم / مل. تمييع CSD باستخدام محلول ملحي معقم ومزجه مع شاكر بالموجات فوق الصوتية (40 كيلو هرتز ، 80 واط) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة.
4. حرك واخلط معلق CSD جيدا على خلاط دوامة لمدة 10 ثوان قبل إعطاء قطرات الأنف.

3. إعطاء قطرات الأنف للفأر

1. تخدير فأر بسرعة باستخدام 2٪ إيزوفلوران بجرعة 3.6 مل / ساعة في جهاز التخدير (الشكل 1 ب ، اللوحة اليسرى).
   ملاحظة: يجب إجراء التخدير في غطاء دخان لتجنب استنشاق المخدر من قبل الفني. التأكد من عمق التخدير الكافي من خلال ملاحظة التغير من التنفس السريع وغير المنتظم إلى حالة بطيئة وثابتة في الفئران.
2. بالتنقيط 50 ميكرولتر من CSD عن طريق الأنف في غضون 4-8 ثوان (الشكل 1 ب ، يمين).
   1. بالنسبة للتنقيط الأنفي ، ضع رأس الماوس على مفصل مشط القدم للباحث بطرف السبابة.
   2. حافظ على الماوس في وضع الانبطاح ، مع ثني أربعة أصابع قليلا ولمس طرف الإبهام برفق الشفة السفلية للماوس لتقويم مجرى الهواء. تجنب لمس البلعوم لاستنباط منعكس الكمامة.
   3. نضح 50 ميكرولتر من السائل باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. أسقط السائل في تجويف أنف الفأر في ثلاث إلى أربع جرعات مقسمة حسب معدل تنفس الفأر. يجب أن يتكون كل تقطير من 15 إلى 20 ميكرولتر سائل. إدارة بالتنقيط مرة واحدة كل 3 أيام ، 5x في غضون 12 يوما. علاج الماوس السيطرة مع كمية متساوية من المياه المالحة.
3. تدليك بلطف منطقة القلب من الماوس 5x-10x لمدة 5 ثوان.
   1. امسك جسم الفأر براحة اليد ، واضغط على الجلد على الجزء الخلفي من الرقبة بالإبهام والسبابة ، وثبت الأطراف الخلفية للفأر بالأصابع الأخرى. ثم اضغط برفق على منطقة نبضات قلب الماوس بإصبع السبابة من اليد الأخرى 5-10 مرات في فترة 5 ثوان.
4. عندما يستقر تنفس الفأر ، ضعه في قفص استرداد مع وسادة تدفئة وراقبه حتى يتعافى من التخدير ، ثم أعد الماوس إلى قفصه المنزلي. التضحية بالماوس في 31 يوما.

4. جمع أنسجة الرئة وإعداد قسم البارافين

1. حقن 0.18 مل من 10٪ هيدرات الكلورال داخل الصفاق ، مما يضمن عدم استجابة الفئران لتحفيز إصبع القدم أو الذيل (يتم إجراؤه باستخدام ملقط مسنن). ثم انتقل إلى الخطوة التالية.
2. ثبت أطراف الماوس على لوحة اختبار الرغوة ورشها بالكحول بنسبة 75٪ لترطيب الفراء. قم بإزالة معظم الأضلاع الصدرية عند خط الوسط من الترقوة وافتح التجويف الصدري للفئران لكشف القلب والرئتين.
3. قم بفتح الأذين الأيمن على الفور باستخدام مقص جراحي للعيون وحقن 20 مل من محلول الفوسفات (PBS) ببطء من طرف القلب عند نبضات الأذين الأيسر بأكبر سعة للسماح بتدفق الدم كله. بعد ذلك ، قم بإزالة الفص السفلي من الرئة اليمنى وتخزينه عند -80 درجة مئوية لتحليل النشاف الغربي.
4. استمر في تعطير 10 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في نفس الموقع بعد حقن PBS. جمع الرئة المتبقية والحفاظ على العينة في 30 مل من 4 ٪ PFA للتحليل المرضي.
5. بعد 72 ساعة من التثبيت ، قم بتضمين العينات في البارافين.
   1. قم بتجفيف الأنسجة من خلال سلسلة متدرجة من تخفيفات الإيثانول (EtOH) في الماء منزوع الأيونات (60٪ ، 70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 100٪) لمدة 1 ساعة لكل منهما في RT. امسح العينة في غسلتين من الزيلين لمدة 1 ساعة لكل منهما.
   2. تسلل العينات بشمع البارافين المذاب عن طريق التسخين إلى 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. كرر هذه العملية في اسطوانة أخرى. تبريد قوالب الشمع مع الأنسجة لمدة 1 ساعة لتصلب.
   3. بعد أن يتصلب الشمع ويتم دمج الأنسجة ، استخدم آلة تقسيم البارافين لتقطيع الأنسجة عند 5 ميكرومتر. تم وصف خطوات التقسيم وتركيب الشرائح الدقيقة سابقا¹¹.
      ملاحظة: يشار إلى نضح الأنسجة الكافي عن طريق تطوير ارتعاش العضلات والتواء الذيل إلى شكل "S" أو انثناء بعد تلقي 10 مل من 4٪ PFA.

5. أداء تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (HE)

1. سخني المناديل الورقية المغروسة بالبارافين على طبق ساخن (60 درجة مئوية) لأكثر من 4 ساعات للسماح بالالتصاق بالشرائح وتحسين إزالة البارافين.
2. إزالة الشمع وترطيب أقسام البارافين. انقع الشرائح مع عينات في الزيلين 2x لمدة 30 دقيقة في كل مرة. بعد ذلك ، قم بغمسها في الإيثانول اللامائي ، ثم 95٪ و 85٪ و 75٪ كحول وماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق على التوالي.
3. أداء تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين. تلطيخ الأنسجة في دلو تلطيخ الهيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق. اشطفها بالماء الجاري بلطف لمدة 5 دقائق. ثم ، اغمس الشرائح في دلو تلطيخ eosin لمدة 10 ثوان.
4. جفف العينات في 75٪ ، 85٪ ، 95٪ ، والإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق لكل منهما. نظف أقسام الأنسجة عن طريق غمرها في الزيلين لمدة 5 دقائق. أغلق القسم بحوالي 60 ميكرولتر من قطرات الراتنج المحايدة. ضع شريحة الغطاء فوق القسم وقم بخفضه بعناية لتجنب فقاعات الهواء.

6. أداء تلطيخ ماسون

1. إزالة الشمع وترطيب عينات البارافين ، كما هو مذكور في الخطوة 5.2. ثم ، وصمة عار نوى الخلية مع 50 ٪ من الهيماتوكسيلين Weigert لمدة 10 دقائق. نقع الأنسجة في تسييل الإيثانول الحمضي لمدة 10 ثوان وشطف شرائح الأنسجة بلطف بالماء الجاري لتبييض النوى.
   ملاحظة: قم بإعداد محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين من Weigert مباشرة قبل الاستخدام.
2. قم بتلطيخ العينات بقطرات من محلول تلطيخ Lichun الأحمر (40 ميكرولتر لكل شريحة أنسجة) لمدة 7 دقائق واغسلها بمحلول عمل حمضي ضعيف (30٪ حمض الهيدروكلوريك) لمدة 1 دقيقة لإزالة صبغة Lichun الحمراء غير المنضمة.
3. اغمسها في 95٪ كحول لمدة 20 ثانية وقم بتجفيفها 2x بالإيثانول اللامائي لمدة 1-3 ثوان لكل منهما. بعد ذلك ، قم بمسح الأنسجة بالزيلين وختمها ب 60 ميكرولتر من قطرات الراتنج المحايدة ، كما هو مذكور في الخطوة 5.4.

7. أداء تلطيخ سيريوس الأحمر

1. إزالة الشمع وترطيب أقسام البارافين كما هو مذكور في الخطوة 5.2.
2. تسلل الأقسام لمدة 1 ساعة باستخدام محلول تلطيخ أحمر سيريوس.
3. تلطيخ نوى الخلية من العينات لمدة 8-10 دقائق مع محلول تلطيخ ماير الهيماتوكسيلين. اشطفها بلطف بالماء الجاري لمدة 10 دقائق. ثم قم بتجفيف ومسح شرائح الأنسجة. قم بإغلاقها كما هو مذكور في الخطوة 5.4.

8. أداء الكيمياء المناعية

1. قم بإزالة الشمع وترطيب عينات البارافين كما هو موضح في الخطوة 5.2.
2. تسلل العينات بمحلول استرجاع مستضد EDTA 3 مجم / مل يبلغ حوالي 30 مل. تغلي لمدة 20-30 دقيقة. اغسل الأنسجة بالماء منزوع الأيونات ، ثم احتضانها في محلول مخزن بالفوسفات يحتوي على 0.5٪ Tween-20 (PBST) لمدة 5 دقائق.
3. نقع العينات لمدة 15 دقيقة مع محلول بيروكسيد الهيدروجين 0.3 ٪ لتعطيل بيروكسيديز الذاتية في العينات. اغسلها 3 مرات باستخدام PBST لمدة 5 دقائق في كل مرة.
   ملاحظة: يجب أن يكون محلول بيروكسيد الهيدروجين 0.3٪ طازجا في بيئة مقاومة للضوء.
4. تتخلل غشاء العينات لمدة 15 دقيقة بمحلول 0.3٪ Triton-100. ثم ، كتلة مع 30-40 ميكرولتر من 5 ٪ ألبومين مصل البقر (BSA) لمدة 1 ساعة.
5. قم بإزالة حل الحظر. أضف الأجسام المضادة الأولية المخففة NF-κB (التخفيف 1: 200) و CD68 (التخفيف 1: 1000) واحتضان العينات طوال الليل عند 2-8 درجة مئوية في صندوق مبلل IHC منزلق مجهري لمنع التبخر والضوء.
6. في اليوم التالي ، قم بنقلها إلى RT لمدة 1 ساعة. ثم اغسلها باستخدام PBST 3x لمدة 5 دقائق لكل منها.
7. احتضان العينات لمدة 1 ساعة في الأجسام المضادة الثانوية التي تحمل علامة بيروكسيديز الفجل المضاد للأرانب (نسبة التخفيف 1: 500) في RT واغسلها باستخدام PBST 3x لمدة 5 دقائق لكل منها.
   ملاحظة: تم تخفيف كل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية بنسبة 5٪ BSA.
8. احتضان العينات باستخدام الركيزة 3،3'-Diaminobenzidine (DAB) المقابلة للجسم المضاد المسمى بالإنزيم لمدة 5-20 دقيقة. أوقف التفاعل بالماء منزوع الأيونات عند الوصول إلى كثافة التلوين المثلى.
   ملاحظة: يجب تحضير محلول DAB حديثا وحمايته من الضوء. يجب ملاحظة تفاعل تطور اللون في الوقت الفعلي تحت المجهر لتحديد وقت التوقف عن التلطيخ. تظهر العينات الإيجابية تلطيخا شديدا ، في حين أن العينات السلبية لا تطور اللون.
9. قم بتلطيخ العينات لمدة 30 ثانية باستخدام Weigert hematoxylin. بعد ذلك ، شطف الأنسجة تحت الماء الجاري لمدة 1 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتجفيف شرائح الأنسجة ومسحها وختمها ، كما هو مذكور في الخطوة 5.4.

9. إجراء تحليل النشاف الغربي

1. تحلل أنسجة الرئة لاستخراج البروتينات. أضف 200 ميكرولتر من محلول عمل RIPA إلى 20 مجم من أنسجة الرئة.
2. تجانس الأنسجة على الجليد لمدة 5 دقائق باستخدام مطحنة كهربائية محمولة واحتضانها لمدة 1 ساعة على الجليد مع هز لطيف. بعد ذلك ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالتجانس عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة عند 14800 × جم.
3. اجمع المادة الطافية وحدد تركيز البروتين باستخدام مجموعة مقايسة البروتين BCA. اصنع محلول تخزين البروتين باستخدام RIPA عند 6 ميكروغرام / ميكرولتر بروتين. أضف 20 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت 5x إلى 80 ميكرولتر من محلول البروتين. تعطيل بنية البروتين الثانوية عن طريق تسخين أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المحتوية على البروتين في حمام معدني (100 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة.
4. بعد التبريد ، قم بقسمة 100 ميكرولتر من محلول تخزين البروتين في كل أنبوب وتخزين العينات في ثلاجة -80 درجة مئوية. تمييع تركيز البروتين إلى 2-3 ميكروغرام / ميكرولتر مع 1x تحميل العازلة قبل الكهربائي.
   ملاحظة: يجب إجراء عملية استخراج البروتين على الجليد. بالنسبة لمحلول عمل RIPA ، أضف 1 ميكرولتر من 100 mM فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) إلى 99 ميكرولتر من RIPA لمنع تدهور البروتين المفسفر.  قم بإعداد مخزن مؤقت للتحميل 1x عن طريق تخفيف المخزن المؤقت للتحميل 5x باستخدام RIPA بنسبة 1: 4.
5. أضف 20 ميكروغرام من العينات إلى كل بئر وقم بتشغيل الجل. بالنسبة للمواد الهلامية المركزة بنسبة 5٪ ، استخدم 80 فولت لمدة 20 دقيقة للحصول على البروتينات الكهربائية من نفس نقطة البداية. بالنسبة للمواد الهلامية المعزولة بنسبة 10٪ ، قم بتشغيلها عند 100 فولت لمدة 1 ساعة للسماح بفصل البروتينات ذات الأوزان الجزيئية المختلفة قدر الإمكان.
6. قم بتنشيط غشاء PVDF مسبقا بالميثانول لمدة 20 ثانية. نقل البروتينات إلى غشاء PVDF باستخدام طريقة النقل الرطب مع تيار 400 مللي أمبير لمدة 1-2 ساعة.
   ملاحظة: تأكد من أن خزان الكهربائي وخزان النقل الكهربائي أفقيان. قم بتبريد الخزان بالكامل بالثلج ، حيث تولد عملية نقل الغشاء الكثير من الحرارة.
7. اغسل الغشاء بمحلول TBST لمدة 5 دقائق في كل مرة ، 5x. ثم ، يحجب مع 5 ٪ BSA أو 5 ٪ الحليب الخالي من الدسم لمدة 1 ساعة. تمييع الأجسام المضادة الأولية NF-κB (1: 1,000) و β-actin (1: 1,000) مع 5٪ BSA. اغمر الشرائط في محلول الأجسام المضادة وهز الشرائط برفق طوال الليل عند 2-8 درجة مئوية.
8. اغسل الشرائط باستخدام PBST. بعد ذلك ، قم بتخفيف بيروكسيديز الفجل (HRP) - الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب (1: 10000) واحتضانها في الجسم المضاد الثانوي المخفف لمدة ساعة واحدة في RT مع اهتزاز لطيف.
9. قم بإعداد مطور تلألؤ كيميائي محسن (ECL) ، وقم بإسقاطه على الشريط ، واحتضانه لمدة 3 دقائق.
10. فضح الشريط لتصوير هلام لمدة 20 ثانية. قم بقياس القيمة الرمادية للشريط لتقييم مستوى البروتين بواسطة برنامج النظام. استخدم β-أكتين كعنصر تحكم داخلي.

النتائج

تم التحقيق في التسبب المحتمل للسحار السيليسي في الفئران باستخدام الطريقة المقترحة. وجدنا أن وزن جسم الفئران في المجموعة التجريبية انخفض بشكل ملحوظ بالنسبة للمجموعة الضابطة وأن وزن الجسم تعافى ببطء بعد التوقف عن التعرض. بسبب الجرعة المثلى المستخدمة هنا ، لم يلاحظ أي وفيات في الفئران المع?...

Discussion

تعتبر نماذج فأر السحار ضرورية لدراسة التسبب في مرض السيليكا. يصف هذا البروتوكول طريقة لإعداد نموذج من السحار السيليسي في الفئران من خلال التعرض المتكرر للأنف. تسمح هذه الطريقة بدراسة الخصائص المرضية للسحار السيليسي الناجم عن أوقات التعرض المختلفة. تم تخدير الفئران على جهاز التنفس الصناع...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL tube	Biosharp	BS-05-M
10% formalin neutral fixative	Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.	NA
Adobe Illustrator	Adobe	NA
Alcohol disinfectant	Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.	NA
CD68	Abcam	ab125212
Citrate antigen retrieval solution	biosharp life science	BL619A
DAB chromogenic kit	NJJCBio	W026-1-1
Dimethyl benzene	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
Enhanced BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology	P0009
Hematoxylin and Eosin (H&E)	Beyotime Biotechnology	C0105S
HRP substrate	Millipore Corporation	P90720
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	Sa00001-2
Iceacetic acid	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
ImageJ	NIH	NA
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22
Masson's Trichrome stain kit	Solarbio	G1340
Methanol	Macklin	NA
Microtubes	Millipore	AXYMCT150CS
NF-κB p65	Cell Signaling Technology	8242S
Oscillatory thermostatic metal bath	Abson	NA
Paraffin embedding machine	Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.	PBM-A
Paraffin Slicer	Jinhua Kratai Instruments Co.	NA
Phosphate buffer (PBS)	Biosharp	BL601A
Physiological saline	The First People's Hospital of Huainan City	NA
Pipettes	Eppendorf	NA
PMSF	Beyotime Biotechnological	ST505
Polarized light microscope	Olympus	BX51
Precision balance	Acculab	ALC-110.4
Prism7.0	GraphPad	Version 7.0
PVDF membranes	Millipore	3010040001
RIPA lysis buffer	Beyotime Biotechnology	P0013B
RODI IOT intelligent multifunctional water purification system	RSJ	RODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker	Scilogex	NA
SDS-PAGE gel preparation kit	Beyotime Biotechnology	P0012A
Silicon dioxid	Sigma	#BCBV6865
Sirius red staining	Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.	181012
Small animal anesthesia machine	Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.	ZL-04A
Universal Pipette Tips (0.1–10 µL)	KIRGEN	KG1011
Universal Pipette Tips (100–1000 µL)	KIRGEN	KG1313
Universal Pipette Tips (1–200 µL)	KIRGEN	KG1212
Vortex mixer	VWR	NA
ZEISS GeminiSEM 500	Zeiss Germany	SEM 500
β-actin	Bioss	bs-0061R