מודל עכבר סיליקוזיס שנקבע על ידי שאיפה חוזרת ונשנית של אבק סיליקה גבישי

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לביסוס מודל עכברי של סיליקוזיס באמצעות חשיפה חוזרת ונשנית לתרחיפים של סיליקה באמצעות טפטוף אף. מודל זה יכול לחקות ביעילות, בנוחות ובגמישות את התהליך הפתולוגי של סיליקוזיס אנושי עם חזרתיות וחיסכון גבוהים.

Abstract

סיליקוזיס יכול להיגרם על ידי חשיפה לאבק סיליקה גבישי נשימתי (CSD) בסביבה תעשייתית. הפתופיזיולוגיה, הסינון והטיפול בסיליקוזיס בבני אדם נחקרו כולם בהרחבה באמצעות מודל הסיליקוזיס של העכבר. על-ידי גרימת עכברים לשאוף CSD שוב ושוב לריאותיהם, העכברים יכולים לחקות את הסימפטומים הקליניים של סיליקוזיס אנושי. מתודולוגיה זו מעשית ויעילה מבחינת זמן ותפוקה, ואינה גורמת לפגיעה מכנית בדרכי הנשימה העליונות עקב ניתוח. יתר על כן, מודל זה יכול לחקות בהצלחה תהליך טרנספורמציה חריפה/כרונית של סיליקוזיס. הנהלים העיקריים היו כדלקמן. אבקת CSD מעוקרת של 1-5 מיקרומטר נטחנה במלואה, מרחפת במי מלח ופוזרה באמבט מים על-קולי למשך 30 דקות. עכברים תחת הרדמה הנגרמת על ידי איזופלורן עברו מנשימה רדודה ומהירה לשאיפה עמוקה ואיטית במשך כ -2 שניות. העכבר הונח בכף יד, וקצה האגודל נגע בעדינות בקצה השפה של לסת העכבר כדי ליישר את נתיב האוויר. לאחר כל נשיפה, העכברים נשמו את תרחיף הסיליקה טיפה אחר טיפה דרך נחיר אחד, והשלימו את התהליך תוך 4-8 שניות. לאחר שנשימתם של העכברים התייצבה, ליטפו וליטפו את החזה שלהם כדי למנוע את שיעול ה-CSD בשאיפה. לאחר מכן הוחזרו העכברים לכלוב. לסיכום, מודל זה יכול לכמת CSD לאורך המעבר הפיזיולוגי הטיפוסי של חלקיקים זעירים לתוך הריאה, מדרכי הנשימה העליונות אל הסימפונות הסופניים ונאדיות. זה יכול גם לשכפל את החשיפה החוזרת ונשנית של עובדים עקב עבודה. המודל יכול להתבצע על ידי אדם אחד ואינו זקוק לציוד יקר. זה בנוחות וביעילות מדמה את תכונות המחלה של סיליקוזיס אנושי עם חזרתיות גבוהה.

Introduction

עובדים נחשפים באופן בלתי נמנע לאבק סיליקה גבישי לא סדיר (CSD), שניתן לשאוף והוא רעיל יותר בהקשרים תעסוקתיים רבים, כולל כרייה, כלי חרס, זכוכית, עיבוד קוורץ ובטון ^1,2. מצב שאיפת אבק כרוני המכונה סיליקוזיס גורם לפיברוזיס ריאתי מתקדם³. על פי נתונים אפידמיולוגיים, שכיחות הסיליקוזיס נמצאת בירידה עולמית בעשורים האחרונים, אך בשנים האחרונות היא עולה ומשפיעה על צעירים ^4,5,6. המנגנון הבסיסי של סיליקוזיס מהווה אתגר משמעותי למחקר המדעי בשל תחילתו החתרנית ותקופת הדגירה הממושכת. עדיין לא ידוע כיצד מתפתחת סיליקוזיס. יתר על כן, אין תרופות הנוכחיות יכול לעצור את התקדמות סיליקוזיס ופיברוזיס ריאתי הפוך.

המודלים הנוכחיים של עכבר עבור סיליקוזיס כוללים בליעה קנה הנשימה של השעיה מעורבת של CSD. לדוגמה, מתן CSD לריאות על ידי אימוץ טראומת קנה הנשימה הצווארית לאחר הרדמה אינו תואם חשיפה אנושית חוזרת ונשנית לאבק צבע⁷. ההשפעה של חשיפה לאבק סביבתי על אנשים ניתן ללמוד על ידי חשיפתם CSD בצורה של אירוסולים, אשר משקף בצורה מדויקת יותר את הריכוזים הסביבתיים של חומר רעיל זה⁸. עם זאת, CSD סביבתי לא יכול פשוט להיות שואף ישירות לתוך הריאות בשל המבנה הפיזיולוגי הייחודי של אף העכבר⁹. יתר על כן, הציוד הקשור לטכנולוגיה זו הוא יקר, מה שגרם לחוקרים להעריך מחדש את מודל סיליקוזיס^{עכבר 10}. על ידי שאיפת תרחיף CSD דרך טפטוף אף חמש פעמים בתוך שבועיים, ניתן היה לבנות מודל דינמי של סיליקוזיס. דגם זה עקבי ובטוח ובו בזמן קל לשימוש. חשוב לציין כי מחקר זה מאפשר שאיפה חוזרת ונשנית של CSD בעכברים. מודל הסיליקוזיס של העכבר שנוצר באמצעות הליך זה צפוי להיות מועיל יותר לדרישות המחקר.

Protocol

כל הנהלים פעלו בהתאם להנחיות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (פרסום NIH מס' 8023, תוקן בשנת 1978) ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת אנחווי למדע וטכנולוגיה.

1. ניהול והאכלת עכברים

1. הקצו 20 עכברים זכרים בריאים מסוג C57BL/6 לקבוצות הניסוי או הרכב ביחס של 1:1. התאקלמו את העכברים לסביבה החדשה למשך שבוע.
2. ספק זמן אור קבוע של 12 שעות ביום. השתמש במתג בקרת זמן לתזמון מדויק.

2. הכנת השעיית CSD

1. לפחות יום אחד לפני טפטוף האף, לטחון את הסיליקה במכתש אגת במשך 0.5 שעות.
2. שימו לב לגודל ולצורה של חלקיקי הגביש. צלם תמונות מייצגות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM).
   1. השתמש בסרט מוליך כדי לקשור את החלקיקים כדי להכין את הדגימה ל- SEM. השתמש במייבש שיער כדי להעיף בעדינות את חלקיקי הסיליקון שאינם מחוברים היטב.
   2. פנה את תא הדגימה, הפעל את הלחץ הגבוה וצלם את התמונה.
      הערה: מרחק העבודה (WD) בין העדשה לדגימה הוא 5.9 מ"מ, מתח התאוצה הוא 2.0 קילו-וולט וההגדלה (מאג) היא 100,000x, באמצעות גלאי SignalA. החלקיקים מפוזרים בהתגבשות לא סדירה, וכ-80% מהם הם בקוטר של 1-5 מיקרומטר (איור 1A).
3. הפוך תרחיף CSD סטרילי של 20 מ"ג / מ"ל. לדלל את CSD באמצעות מלוחים סטריליים ולערבב אותו עם שייקר קולי (40 קילוהרץ, 80 W) בטמפרטורת החדר (RT) במשך 30 דקות.
4. מערבבים ומערבבים היטב את מתלה ה-CSD על מערבל מערבולת במשך 10 שניות לפני מתן טפטופי האף.

3. מתן טפטופים לאף לעכבר

1. הרדימו במהירות עכבר עם איזופלורן 2% במינון של 3.6 מ"ל/שעה במכשיר הרדמה (איור 1B, פאנל שמאלי).
   הערה: ההרדמה צריכה להתבצע במכסה אדים כדי למנוע שאיפת חומר ההרדמה על ידי הטכנאי. ודא כי עומק ההרדמה הולם על ידי התבוננות בשינוי מנשימה מהירה ולא סדירה למצב איטי ויציב בעכברים.
2. טפטוף 50 μL של CSD באף בתוך 4-8 שניות (איור 1B, מימין).
   1. לטפטוף האף, הניחו את ראש העכבר על המפרק המטא-קרפופלנגאלי של החוקר עם קצה האצבע המורה.
   2. שמור את העכבר במצב נוטה, עם ארבע אצבעות מכופפות מעט וקצה האגודל נוגע קלות בשפה התחתונה של העכבר כדי ליישר את נתיב האוויר. הימנע מלגעת בלוע כדי לעורר את רפלקס ההקאה.
   3. לשאוף 50 μl של נוזל באמצעות פיפטה 200 μl. זרוק את הנוזל לתוך חלל האף של העכבר בשלוש עד ארבע מנות מחולקות בהתאם לקצב הנשימה של העכבר. כל החדרה צריכה להכיל 15 עד 20 μl נוזל. יש לתת את הטפטוף אחת ל-3 ימים, 5 פעמים תוך 12 יום. טפל בעכבר הבקרה עם כמות שווה של מלוחים.
3. עסו בעדינות את אזור הלב של העכבר 5x-10x במשך 5 שניות.
   1. החזק את גוף העכבר עם כף היד, צבוט את העור בחלק האחורי של הצוואר עם האגודל והאצבע המורה, וקבע את הגפיים האחוריות של העכבר עם האצבעות האחרות. לאחר מכן, לחץ בעדינות על אזור פעימות הלב של העכבר עם האצבע המורה של היד השנייה 5-10 פעמים בתקופה של 5 שניות.
4. כאשר נשימתו של העכבר התייצבה, הניחו אותו בכלוב התאוששות עם כרית חימום והתבוננו עד שהוא מתאושש מההרדמה, ואז החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו. להקריב את העכבר בגיל 31 יום.

4. איסוף רקמות הריאה והכנת קטע פרפין

1. הזריקו 0.18 מ"ל של 10% כלורל הידרט תוך צפקי, כדי להבטיח שהעכברים לא יגיבו לגירוי הבוהן או הזנב (מבוצע באמצעות מלקחיים עם שיניים). לאחר מכן, המשך לשלב הבא.
2. תקן את גפי העכבר על לוח בדיקת קצף וססס עם 75% אלכוהול כדי להרטיב את הפרווה. הסר את רוב צלעות החזה בקו האמצע של עצם הבריח ופתח את חלל בית החזה של העכברים כדי לחשוף את הלב והריאות.
3. פתח מיד את האטריום הימני עם מספריים כירורגיים אופתלמיים והזריק לאט 20 מ"ל של חיץ פוספט (PBS) מקצה הלב בפעימת הפרוזדורים השמאלית עם המשרעת הגדולה ביותר כדי לאפשר לכל הדם לזרום. לאחר מכן, להסיר את האונה התחתונה של הריאה הימנית ולאחסן אותו ב -80 ° C עבור ניתוח כתמים מערביים.
4. המשך לערבב 10 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) באותו אתר לאחר הזרקת PBS. לאסוף את הריאה הנותרת ולשמר את הדגימה ב 30 מ"ל של 4% PFA לניתוח פתולוגי.
5. לאחר 72 שעות של קיבוע, להטמיע דגימות בפרפין.
   1. יש לייבש את הרקמות באמצעות סדרה מדורגת של דילולי אתנול (EtOH) במים שעברו דה-יוניזציה (60%, 70%, 80%, 90%, 100%) למשך שעה אחת כל אחת ב-RT. נקה את הדגימה בשתי שטיפות של קסילן למשך שעה אחת כל אחת.
   2. יש להחדיר את הדגימות עם שעוות הפרפין המומסת על ידי חימום ל-50 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. חזור על תהליך זה בצילינדר אחר. מצננים את תבניות השעווה עם רקמות למשך שעה אחת כדי להתקשות.
   3. לאחר שהשעווה התקשתה והרקמה הוטמעה, השתמש במכונת חיתוך פרפין כדי לחתוך את הרקמה ב -5 מיקרומטר. שלבי החתך והרכבת השקופיות המדויקים תוארו בעבר¹¹.
      הערה: זילוח רקמות מספיק מצוין על ידי פיתוח עוויתות שרירים ופיתול זנב לצורת "S" או כיפוף לאחר קבלת 10 מ"ל של 4% PFA.

5. ביצוע צביעת המטוקסילין ואוזין (HE)

1. חממו את הרקמות המשובצות בפרפין על פלטה חמה (60°C) במשך יותר מ-4 שעות כדי לאפשר היצמדות למגלשות ושיפור הפרפרפרציה.
2. קטעי פרפין Dewax ו hydrate. השרו את המגלשות בדוגמאות בקסילן 2x למשך 30 דקות בכל פעם. לאחר מכן, לטבול אותם אתנול נטול מים, ולאחר מכן 95%, 85%, 75% אלכוהול, ומים deionized במשך 5 דקות, בהתאמה.
3. בצע hematoxylin ו eosin צביעה. מכתימים את הרקמות בדלי מכתים המטוקסילין למשך 10 דקות. שטפו אותם במים זורמים בעדינות במשך 5 דקות. לאחר מכן, טבלו את המגלשות בדלי מכתים eosin במשך 10 שניות.
4. יש לייבש את הדגימות ב-75%, 85%, 95% ואתנול נטול מים למשך 5 דקות כל אחת. נקה את חלקי הרקמה על ידי טבילתם בקסילן למשך 5 דקות. אטמו את החלק בכ-60 מיקרוליטר טיפות שרף ניטרליות. הניחו את מגלשת הכיסוי מעל החלק והורידו אותו בזהירות כדי למנוע בועות אוויר.

6. ביצוע צביעת מסון

1. Dewax ולחות את דגימות פרפין, כפי שהוזכר בשלב 5.2. לאחר מכן, להכתים את גרעיני התא עם 50% hematoxylin של Weigert במשך 10 דקות. השרו את הרקמה בנוזל אתנול חומצי למשך 10 שניות ושטפו את החלקות הרקמה בעדינות במים זורמים להדבקת גרעינים.
   הערה: יש להכין את תמיסת צביעת המטוקסילין של Weigert מיד לפני השימוש.
2. הכתימו את הדגימות בטיפות של תמיסת צביעה אדומה של ליצ'ון (40 מיקרוליטר לכל שקופית רקמה) למשך 7 דקות ושטפו אותן בתמיסת עבודה של חומצה חלשה (30% חומצה הידרוכלורית) למשך דקה אחת כדי להסיר את הצבע האדום של ליצ'ון שאינו קשור.
3. טבלו אותם ב-95% אלכוהול למשך 20 שניות וייבשו אותם פי 2 עם אתנול נטול מים למשך 1-3 שניות כל אחד. לאחר מכן, לנקות את הרקמות עם xylene ולאטום אותם עם 60 μL של טיפות שרף ניטרלי, כאמור בשלב 5.4.

7. ביצוע צביעה אדומה של סיריוס

1. קטעי פרפין Dewax ו-Hydrate כפי שהוזכר בשלב 5.2.
2. הסתננו לחלקים למשך שעה אחת עם תמיסת צביעה אדומה של סיריוס.
3. מכתימים את גרעיני התא של הדגימות למשך 8-10 דקות עם תמיסת צביעת המטוקסילין של מאייר. שטפו אותם בעדינות עם מים זורמים במשך 10 דקות. לאחר מכן, יש לייבש ולנקות את שקופיות הרקמה. חתמו אותם כפי שהוזכר בשלב 5.4.

8. ביצוע אימונוהיסטוכימיה

1. Dewax ולחות את דגימות פרפין כמתואר בשלב 5.2.
2. יש להחדיר את הדגימות לתמיסת אחזור אנטיגן EDTA במינון 3 מ"ג/מ"ל של כ-30 מ"ל. מרתיחים במשך 20-30 דקות. שטפו את הרקמות במים נטולי יונים, ולאחר מכן דגרו עליהן בתמיסה חוצצת פוספט המכילה 0.5% Tween-20 (PBST) למשך 5 דקות.
3. השרו את הדגימות למשך 15 דקות בתמיסת מי חמצן 0.3% כדי להשבית את הפרוקסידז האנדוגני בדגימות. שטפו אותם 3 פעמים עם PBST במשך 5 דקות בכל פעם.
   הערה: תמיסת 0.3% מי חמצן חייבת להיות טרייה בסביבה חסינת אור.
4. חדרו את קרום הדגימות למשך 15 דקות עם תמיסת טריטון-100 0.3%. לאחר מכן, לחסום עם 30-40 μL של אלבומין 5% בסרום בקר (BSA) למשך 1 שעות.
5. הסר את פתרון החסימה. הוסיפו נוגדנים ראשוניים מדוללים NF-κB (דילול 1:200) ו-CD68 (דילול 1:1,000) ודגרו על הדגימות למשך הלילה בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס בקופסה רטובה של מיקרוסקופ כדי למנוע אידוי ואור.
6. למחרת, העבר אותם ל- RT למשך שעה אחת. לאחר מכן, שטפו אותם עם PBST 3x למשך 5 דקות כל אחד.
7. דגרו על הדגימות במשך שעה אחת בנוגדנים משניים נגד עכבר נגד חזרת פרוקסידז (יחס דילול 1:500) ב-RT ושטפו אותם עם PBST 3x למשך 5 דקות כל אחת.
   הערה: נוגדנים ראשוניים ומשניים דוללו ב-5% BSA.
8. דגרו דגימות עם מצע 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) המתאים לנוגדן המסומן באנזים למשך 5-20 דקות. עצור את התגובה עם מים שעברו דה-יוניזציה כאשר מגיעים לעוצמת הצביעה האופטימלית.
   הערה: פתרון DAB צריך להיות מוכן טרי ומוגן מפני אור. יש לצפות בתגובת התפתחות הצבע בזמן אמת תחת המיקרוסקופ כדי לקבוע מתי להפסיק להכתים. דגימות חיוביות מציגות כתמים עזים, בעוד שדגימות שליליות אינן מפתחות צבע.
9. כתם נגדי את הדגימות במשך 30 שניות עם Weigert hematoxylin. לאחר מכן, לשטוף את הרקמות תחת מים זורמים במשך 1 דקה. לאחר מכן, יש לייבש, לנקות ולאטום את שקופיות הרקמה, כפי שהוזכר בשלב 5.4.

9. ביצוע ניתוח כתם מערבי

1. ליז את רקמות הריאה כדי לחלץ חלבונים. הוסף 200 μL של תמיסת עבודה RIPA ל 20 מ"ג של רקמת הריאה.
2. הומוגניזציה של הרקמה על קרח במשך 5 דקות באמצעות מטחנה חשמלית ידנית ודגרה במשך שעה על קרח עם ניעור עדין. לאחר מכן, צנטריפוגה הומוגנט ב 4 ° C במשך 15 דקות ב 14,800 x גרם.
3. אספו את הסופרנאטנט וקבעו את ריכוז החלבון בעזרת ערכת בדיקת החלבון BCA. הפוך את תמיסת אחסון החלבון עם RIPA לחלבון של 6 מיקרוגרם/מיקרוליטר. הוסף 20 μL של מאגר העמסה פי 5 ל- 80 μL של החלבון ליזט. לשבש את מבנה החלבון המשני על ידי חימום צינורות מיקרוצנטריפוגות המכילות חלבון באמבט מתכת (100 מעלות צלזיוס) למשך 20 דקות.
4. לאחר הקירור, aliquot 100 μL של תמיסת אחסון חלבון לתוך כל צינור ולאחסן את הדגימות במקרר -80 °C. לדלל את ריכוז החלבון ל 2-3 מיקרוגרם / μL עם חיץ העמסה 1x לפני אלקטרופורזה.
   הערה: תהליך מיצוי החלבון צריך להתבצע על קרח. עבור פתרון העבודה RIPA, הוסף 1 μL של 100 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ל 99 μL של RIPA כדי לעכב פירוק חלבון phosphorylated.  הכן מאגר טעינה 1x על ידי דילול מאגר העמסה 5x עם RIPA ביחס של 1:4.
5. מוסיפים 20 מק"ג דגימות לכל באר ומפעילים את הג'ל. עבור 5% ג'לים מרוכזים, השתמש 80 V במשך 20 דקות כדי לקבל אלקטרופורזה למטה מאותה נקודת התחלה. עבור 10% ג'לים מבודדים, לרוץ ב 100 V במשך 1 שעה כדי לאפשר חלבונים של משקלים מולקולריים שונים להיות מופרדים ככל האפשר.
6. הפעל מראש את קרום PVDF עם מתנול למשך 20 שניות. מעבירים את החלבונים לקרום PVDF בשיטת העברה רטובה עם זרם 400 mA למשך 1-2 שעות.
   הערה: ודא שמיכל האלקטרופורזה ומיכל האלקטרוטרנספר אופקיים. מצננים את המיכל כולו בקרח, מכיוון שתהליך העברת הממברנה מייצר חום רב.
7. שטפו את הממברנה בתמיסת TBST במשך 5 דקות בכל פעם, 5x. לאחר מכן, לחסום עם 5% BSA או 5% חלב רזה במשך 1 שעות. לדלל את הנוגדנים העיקריים NF-κB (1:1,000) ו β-אקטין (1:1,000) עם 5% BSA. יש לטבול את הרצועות בתמיסת הנוגדנים ולנער את הרצועות בעדינות למשך הלילה בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
8. שטפו את הרצועות עם PBST. לאחר מכן, יש לדלל נוגדן משני מצומד נגד ארנב של חזרת (HRP) נגד ארנב (1:10,000) ולדגור אותם בנוגדן המשני המדולל למשך שעה אחת ב-RT עם רעידות עדינות.
9. הכינו מפתח כימילומינסנציה משופר (ECL), זרקו אותו על הרצועה ודגרו במשך 3 דקות.
10. יש לחשוף את הרצועה למכונת הדמיה ג'ל למשך 20 שניות. מדוד את הערך האפור של הרצועה כדי להעריך את רמת החלבון באמצעות תוכנת מערכת. השתמש β-אקטין כבקרה פנימית.

תוצאות

הפתוגנזה הפוטנציאלית של סיליקוזיס בעכברים נחקרה בשיטה המוצעת. מצאנו כי משקל הגוף של העכברים בקבוצת הניסוי ירד משמעותית ביחס לקבוצת הביקורת, וכי משקל הגוף התאושש לאט לאחר הפסקת החשיפה. בשל המינון האופטימלי המשמש כאן, לא נצפתה תמותה בעכברים שנחשפו לסיליקה בניסוי זה. מפת הדרכים הטכנית של טפ?...

Discussion

מודלים של עכברי סיליקוזיס חיוניים לחקר הפתוגנזה והטיפול בסיליקוזיס. פרוטוקול זה מתאר שיטה להכנת מודל של סיליקוזיס בעכברים באמצעות חשיפה חוזרת לאף. שיטה זו מאפשרת לחקור את המאפיינים הפתולוגיים של סיליקוזיס המושרה על ידי זמני חשיפה שונים. עכברים הורדמו והונשמו וקצב נשימתם נוטר. קצב הנשימה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL tube	Biosharp	BS-05-M
10% formalin neutral fixative	Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.	NA
Adobe Illustrator	Adobe	NA
Alcohol disinfectant	Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.	NA
CD68	Abcam	ab125212
Citrate antigen retrieval solution	biosharp life science	BL619A
DAB chromogenic kit	NJJCBio	W026-1-1
Dimethyl benzene	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
Enhanced BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology	P0009
Hematoxylin and Eosin (H&E)	Beyotime Biotechnology	C0105S
HRP substrate	Millipore Corporation	P90720
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	Sa00001-2
Iceacetic acid	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
ImageJ	NIH	NA
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22
Masson's Trichrome stain kit	Solarbio	G1340
Methanol	Macklin	NA
Microtubes	Millipore	AXYMCT150CS
NF-κB p65	Cell Signaling Technology	8242S
Oscillatory thermostatic metal bath	Abson	NA
Paraffin embedding machine	Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.	PBM-A
Paraffin Slicer	Jinhua Kratai Instruments Co.	NA
Phosphate buffer (PBS)	Biosharp	BL601A
Physiological saline	The First People's Hospital of Huainan City	NA
Pipettes	Eppendorf	NA
PMSF	Beyotime Biotechnological	ST505
Polarized light microscope	Olympus	BX51
Precision balance	Acculab	ALC-110.4
Prism7.0	GraphPad	Version 7.0
PVDF membranes	Millipore	3010040001
RIPA lysis buffer	Beyotime Biotechnology	P0013B
RODI IOT intelligent multifunctional water purification system	RSJ	RODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker	Scilogex	NA
SDS-PAGE gel preparation kit	Beyotime Biotechnology	P0012A
Silicon dioxid	Sigma	#BCBV6865
Sirius red staining	Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.	181012
Small animal anesthesia machine	Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.	ZL-04A
Universal Pipette Tips (0.1–10 µL)	KIRGEN	KG1011
Universal Pipette Tips (100–1000 µL)	KIRGEN	KG1313
Universal Pipette Tips (1–200 µL)	KIRGEN	KG1212
Vortex mixer	VWR	NA
ZEISS GeminiSEM 500	Zeiss Germany	SEM 500
β-actin	Bioss	bs-0061R