Un modelo de ratón de silicosis establecido por inhalación repetida de polvo de sílice cristalina

Resumen

Este protocolo describe un método para establecer un modelo de ratón de silicosis a través de la exposición repetida a suspensiones de sílice a través de un goteo nasal. Este modelo puede imitar de manera eficiente, conveniente y flexible el proceso patológico de la silicosis humana con alta repetibilidad y economía.

Resumen

La silicosis puede ser causada por la exposición al polvo de sílice cristalina respiratoria (CSD) en un entorno industrial. La fisiopatología, el cribado y el tratamiento de la silicosis en humanos se han estudiado ampliamente utilizando el modelo de silicosis de ratón. Al hacer que los ratones inhalen repetidamente CSD en sus pulmones, los ratones pueden imitar los síntomas clínicos de la silicosis humana. Esta metodología es práctica y eficiente en términos de tiempo y rendimiento y no causa lesiones mecánicas en el tracto respiratorio superior debido a la cirugía. Además, este modelo puede imitar con éxito el proceso de transformación aguda/crónica de la silicosis. Los principales procedimientos fueron los siguientes. El polvo esterilizado de 1-5 μm de CSD se molió por completo, se suspendió en solución salina y se dispersó en un baño de agua ultrasónico durante 30 minutos. Los ratones bajo anestesia inducida por isoflurano cambiaron de una respiración rápida y superficial a una aspiración profunda y lenta durante aproximadamente 2 s. El ratón se colocó en la palma de una mano y la punta del pulgar tocó suavemente el borde del labio de la mandíbula del ratón para enderezar las vías respiratorias. Después de cada exhalación, los ratones inhalaron la suspensión de sílice gota a gota a través de una fosa nasal, completando el proceso en 4-8 segundos. Después de que la respiración de los ratones se estabilizó, se les acarició el pecho y se les acarició para evitar que el CSD inhalado fuera expulsado al toser. A continuación, los ratones fueron devueltos a la jaula. En conclusión, este modelo puede cuantificar la CSD a lo largo del paso fisiológico típico de partículas diminutas hacia el pulmón, desde el tracto respiratorio superior hasta los bronquiolos terminales y los alvéolos. También puede replicar la exposición recurrente de los empleados debido al trabajo. El modelo puede ser realizado por una sola persona y no necesita equipos costosos. Simula de manera conveniente y efectiva las características de la enfermedad de la silicosis humana con alta repetibilidad.

Introducción

Los trabajadores están inevitablemente expuestos al polvo irregular de sílice cristalina (CSD), que puede inhalarse y es más tóxico en numerosos contextos ocupacionales, como la minería, la cerámica, el vidrio, el procesamiento de cuarzo y el hormigón ^1,2. Una afección crónica por inhalación de polvo conocida como silicosis causa^{fibrosis pulmonar} progresiva. De acuerdo con los datos epidemiológicos, la incidencia de la silicosis ha ido disminuyendo a nivel mundial en las últimas décadas, pero en los últimos años ha ido en aumento y afectando a personas más jóvenes ^4,5,6. El mecanismo subyacente de la silicosis presenta un desafío significativo para la investigación científica debido a su inicio insidioso y su prolongado período de incubación. Todavía se desconoce cómo se desarrolla la silicosis. Además, ningún medicamento actual puede detener la progresión de la silicosis y revertir la fibrosis pulmonar.

Los modelos actuales de ratón para la silicosis implican la ingestión traqueal de una suspensión mixta de CSD. Por ejemplo, la administración de CSD en los pulmones mediante la adopción del traumatismo de la tráquea cervical después de la anestesia no cumple con la exposición humana repetida al polvo de tinte⁷. El impacto de la exposición al polvo ambiental en las personas puede estudiarse exponiéndolas a la CSD en forma de aerosoles, lo que refleja con mayor precisión las concentraciones ambientales de esta sustancia tóxica⁸. Sin embargo, la CSD ambiental no puede inhalarse simplemente directamente en los pulmones debido a la estructura fisiológica única de la nariz del ratón⁹. Además, los equipos asociados a esta tecnología son caros, lo que ha llevado a los investigadores a reevaluar el modelo¹⁰ de silicosis de ratón. Al inhalar la suspensión de CSD a través de un goteo nasal cinco veces en 2 semanas, fue posible construir un modelo dinámico de silicosis. Este modelo es consistente y seguro a la vez que fácil de usar. Es importante tener en cuenta que este estudio permite la inhalación repetida de CSD en ratones. Se espera que el modelo de silicosis de ratón creado a través de este procedimiento sea más beneficioso para los requisitos de investigación.

Protocolo

Todos los procedimientos siguieron las directrices de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (Publicación de los NIH Nº 8023, revisada en 1978) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Anhui.

1. Manejo y alimentación de ratones

1. Asigne 20 ratones machos C57BL/6 sanos a los grupos experimentales o de vehículos en una proporción de 1:1. Aclimatar a los ratones al nuevo entorno durante 1 semana.
2. Proporcionar un tiempo de luz constante de 12 h al día. Utilice un interruptor de control de tiempo para una sincronización precisa.

2. Preparación de la suspensión del DCV

1. Al menos 1 día antes del goteo nasal, moler la sílice en un mortero de ágata durante 0,5 h.
2. Observa el tamaño y la forma de las partículas de cristal. Tome fotografías representativas con microscopía electrónica de barrido (SEM).
   1. Use cinta conductora para unir las partículas y preparar la muestra para SEM. Use un secador de pelo para soplar suavemente las partículas de silicona que no están firmemente adheridas.
   2. Evacúe la cámara de muestras, encienda la alta presión y capture la imagen.
      NOTA: La distancia de trabajo (WD) entre la lente y la muestra es de 5,9 mm, el voltaje de aceleración es de 2,0 kV y el aumento (Mag) es de 100.000x, utilizando el detector SignalA. Las partículas se dispersan con cristalización irregular y aproximadamente el 80% tienen un diámetro de 1-5 μm (Figura 1A).
3. Prepare una suspensión estéril de 20 mg/ml de CSD. Diluir el CSD con solución salina estéril y mezclarlo con un agitador ultrasónico (40 kHz, 80 W) a temperatura ambiente (RT) durante 30 min.
4. Revuelva y mezcle bien la suspensión de CSD en un mezclador de vórtice durante 10 s antes de administrar los goteos nasales.

3. Administración de goteos nasales al ratón

1. Anestesiar rápidamente a un ratón con isoflurano al 2% a una dosis de 3,6 mL/h en una máquina de anestesia (Figura 1B, panel izquierdo).
   NOTA: La anestesia debe realizarse en una campana extractora para evitar la inhalación del anestésico por parte del técnico. Asegúrese de que la profundidad adecuada de la anestesia observe el cambio de una respiración rápida e irregular a un estado lento y estable en los ratones.
2. Gotee 50 μL de la CSD por vía nasal en 4-8 s (Figura 1B, derecha).
   1. Para el goteo nasal, coloque la cabeza del ratón en la articulación metacarpofalángica del investigador con la punta del dedo índice.
   2. Mantenga el ratón en posición prona, con cuatro dedos ligeramente flexionados y la punta del pulgar tocando ligeramente el labio inferior del ratón para enderezar las vías respiratorias. Evite tocar la faringe para provocar el reflejo nauseoso.
   3. Aspirar 50 μl de líquido con una pipeta de 200 μl. Deje caer el líquido en la cavidad nasal del ratón en tres o cuatro dosis divididas dependiendo de la frecuencia respiratoria del ratón. Cada instilación debe constar de 15 a 20 μl de líquido. Administre los goteos una vez cada 3 días, 5 veces en 12 días. Trate el ratón de control con una cantidad igual de solución salina.
3. Masajee suavemente el área del corazón del mouse 5x-10x durante 5 s.
   1. Sostenga el cuerpo del ratón con la palma de la mano, pellizque la piel de la parte posterior del cuello con el pulgar y el índice y fije las extremidades traseras del ratón con los otros dedos. Luego, presione suavemente el área de latidos del corazón del mouse con el dedo índice de la otra mano de 5 a 10 veces en un período de 5 segundos.
4. Cuando la respiración del ratón se haya estabilizado, colóquelo en una jaula de recuperación con una almohadilla térmica y observe hasta que se recupere de la anestesia, luego devuelva el ratón a su jaula de origen. Sacrificar el ratón a los 31 días.

4. Recolección de los tejidos pulmonares y preparación de una sección de parafina

1. Inyectar 0,18 mL de hidrato de cloral al 10% por vía intraperitoneal, asegurándose de que los ratones no respondan a la estimulación de los dedos de los pies o de la cola (realizada con las pinzas dentadas). A continuación, continúe con el siguiente paso.
2. Fija las extremidades del ratón en una tabla de prueba de espuma y rocía con alcohol al 75% para humedecer el pelaje. Extirpar la mayor parte de las costillas torácicas en la línea media de la clavícula y abrir la cavidad torácica de los ratones para exponer el corazón y los pulmones.
3. Abra inmediatamente la aurícula derecha con unas tijeras quirúrgicas oftálmicas e inyecte lentamente 20 ml de tampón fosfato (PBS) desde la punta del corazón en el latido auricular izquierdo con la mayor amplitud para permitir que fluya toda la sangre. A continuación, retire el lóbulo inferior del pulmón derecho y guárdelo a -80 °C para el análisis de Western blot.
4. Siga perfundiendo 10 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% en el mismo sitio después de la inyección de PBS. Recoger el pulmón restante y conservar la muestra en 30 ml de PFA al 4% para su análisis anatomopatológico.
5. Después de 72 h de fijación, incrustar las muestras en parafina.
   1. Deshidratar los tejidos a través de una serie graduada de diluciones de etanol (EtOH) en agua desionizada (60%, 70%, 80%, 90%, 100%) durante 1 h cada una a RT. Limpiar la muestra en dos lavados de xileno durante 1 h cada uno.
   2. Infiltrar las muestras con la cera de parafina derretida calentando a 50 °C durante 2 h. Repita este proceso en otro cilindro. Enfríe los moldes de cera con pañuelos de papel durante 1 h para que se endurezcan.
   3. Después de que la cera se haya endurecido y el tejido se haya incrustado, use una máquina seccionadora de parafina para cortar el tejido a 5 μm. Los pasos precisos de corte y montaje de la corredera se describieron anteriormente¹¹.
      NOTA: Se indica una perfusión tisular suficiente mediante el desarrollo de espasmos musculares y torsión de la cola en forma de "S" o flexión después de recibir 10 ml de PFA al 4%.

5. Realización de tinción con hematoxilina y eosina (HE)

1. Calentar los tejidos embebidos en parafina en una placa calefactora (60 °C) durante más de 4 h para permitir la adhesión a los portaobjetos y mejorar la desparafina.
2. Desparafinar e hidratar las secciones de parafina. Remoje los portaobjetos con muestras en xileno 2 veces durante 30 minutos cada vez. A continuación, sumérjalos en etanol anhidro, luego alcohol al 95%, 85%, 75% y agua desionizada durante 5 minutos, respectivamente.
3. Realizar tinción de hematoxilina y eosina. Tiñe los tejidos en un cubo de tinción de hematoxilina durante 10 min. Enjuágalos con agua corriente suave durante 5 min. A continuación, sumerja los portaobjetos en el cubo de tinción de eosina durante 10 s.
4. Deshidratar las muestras en etanol anhidro al 75%, 85%, 95% y durante 5 min cada una. Limpie las secciones de tejido sumergiéndolas en xileno durante 5 min. Selle la sección con aproximadamente 60 μL de gotas de resina neutra. Coloque la corredera de la cubierta sobre la sección y bájela con cuidado para evitar burbujas de aire.

6. Realización de la tinción de Masson

1. Desparafinar e hidratar las muestras de parafina, como se menciona en el paso 5.2. A continuación, tiñe los núcleos celulares con hematoxilina de Weigert al 50% durante 10 min. Remoje el tejido en licuefacción de etanol ácido durante 10 s y enjuague suavemente los portaobjetos de tejido con agua corriente para azular los núcleos.
   NOTA: Prepare la solución de tinción de hematoxilina de Weigert inmediatamente antes de usarla.
2. Tiñir las muestras con gotas de solución de tinción de rojo de liquun (40 μL por cada portaobjetos de tejido) durante 7 min y lavarlas con una solución de trabajo de ácido débil (ácido clorhídrico al 30%) durante 1 min para eliminar el tinte rojo de lichun suelto.
3. Sumérjalos en alcohol al 95% durante 20 s y deshidrételos 2 veces con etanol anhidro durante 1-3 s cada uno. Después de eso, limpie los tejidos con xileno y séllelos con 60 μL de gotas de resina neutra, como se mencionó en el paso 5.4.

7. Realización de la tinción de rojo Sirius

1. Desparafinar e hidratar las secciones de parafina como se menciona en el paso 5.2.
2. Infiltrar las secciones durante 1 h con la solución de tinción Sirius red.
3. Tiñir los núcleos celulares de las muestras durante 8-10 min con solución de tinción de hematoxilina Mayer. Enjuágalos suavemente con agua corriente durante 10 min. Luego, deshidrata y limpia los portaobjetos de tejido. Séllalos como se menciona en el paso 5.4.

8. Realización de inmunohistoquímica

1. Desparafinar e hidratar las muestras de parafina como se describe en el paso 5.2.
2. Infiltrar las muestras con una solución de recuperación de antígeno EDTA de 3 mg/ml de aproximadamente 30 ml. Hervir durante 20-30 min. Lavar los tejidos con agua desionizada y luego incubarlos en una solución tamponada con fosfato que contenga 0,5% de Tween-20 (PBST) durante 5 min.
3. Remojar las muestras durante 15 minutos con una solución de peróxido de hidrógeno al 0,3% para inactivar la peroxidasa endógena en las muestras. Lávelos 3 veces con PBST durante 5 minutos cada vez.
   NOTA: La solución de peróxido de hidrógeno al 0,3% debe hacerse fresca en un ambiente a prueba de luz.
4. Permeabilizar la membrana de las muestras durante 15 min con solución de Triton-100 al 0,3%. A continuación, bloquear con 30-40 μL de albúmina sérica bovina (BSA) al 5% durante 1 h.
5. Retire la solución de bloqueo. Añadir anticuerpos primarios diluidos NF-κB (dilución 1:200) y CD68 (dilución 1:1.000) e incubar las muestras durante la noche a 2-8 °C en una caja húmeda IHC de portaobjetos de microscopio para evitar la evaporación y la luz.
6. Al día siguiente, transfiéralos a RT durante 1 h. Luego, lávelos con PBST 3x durante 5 minutos cada uno.
7. Incubar las muestras durante 1 h en anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa antirratón de conejo (relación de dilución 1:500) a RT y lavarlas con PBST 3x durante 5 min cada una.
   NOTA: Tanto los anticuerpos primarios como los secundarios se diluyeron con BSA al 5%.
8. Incubar las muestras con el sustrato 3,3'-diaminobenzidina (DAB) correspondiente al anticuerpo marcado con la enzima durante 5-20 min. Detenga la reacción con agua desionizada cuando se alcance la intensidad óptima de tinción.
   NOTA: La solución DAB debe prepararse fresca y protegerse de la luz. La reacción de desarrollo del color debe observarse en tiempo real bajo el microscopio para determinar cuándo detener la tinción. Los especímenes positivos exhiben una tinción intensa, mientras que los especímenes negativos no desarrollan color.
9. Contratinción de las muestras durante 30 s con hematoxilina Weigert. A continuación, enjuague los pañuelos con agua corriente durante 1 minuto. Luego, deshidrate, limpie y selle los portaobjetos de tejido, como se mencionó en el paso 5.4.

9. Realización del análisis de Western blot

1. Lisar los tejidos pulmonares para extraer proteínas. Añadir 200 μL de solución de trabajo RIPA a 20 mg de tejido pulmonar.
2. Homogeneizar el tejido en hielo durante 5 min con un molinillo eléctrico de mano e incubar durante 1 h en hielo agitando suavemente. A continuación, centrifugar el homogeneizado a 4 °C durante 15 min a 14.800 x g.
3. Recoja el sobrenadante y determine la concentración de proteínas con el kit de ensayo de proteínas BCA. Prepare la solución de almacenamiento de proteínas con RIPA a 6 μg/μL de proteína. Añadir 20 μL de tampón de carga 5x a los 80 μL del lisado de proteína. Alterar la estructura de la proteína secundaria calentando los tubos de microcentrífuga que contienen proteínas en un baño de metal (100 °C) durante 20 min.
4. Después del enfriamiento, alícuota 100 μL de la solución de almacenamiento de proteínas en cada tubo y almacenar las muestras en un refrigerador a -80 °C. Diluir la concentración de proteína a 2-3 μg/μL con tampón de carga 1x antes de la electroforesis.
   NOTA: El proceso de extracción de proteínas debe realizarse en hielo. Para la solución de trabajo RIPA, añadir 1 μL de 100 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) a 99 μL de RIPA para inhibir la degradación de proteínas fosforiladas.  Prepare 1x tampón de carga diluyendo 5x tampón de carga con RIPA en una proporción de 1:4.
5. Agregue 20 μg de muestras a cada pocillo y ejecute el gel. Para geles concentrados al 5%, use 80 V durante 20 minutos para electroforezar las proteínas desde el mismo punto de partida. Para geles aislados al 10%, correr a 100 V durante 1 h para permitir que las proteínas de diferentes pesos moleculares se separen tanto como sea posible.
6. Activar previamente la membrana de PVDF con metanol durante 20 s. Transfiera las proteínas a la membrana de PVDF utilizando el método de transferencia húmeda con una corriente de 400 mA durante 1-2 h.
   NOTA: Asegúrese de que el tanque de electroforesis y el tanque de electrotransferencia estén horizontales. Enfríe todo el tanque con hielo, ya que el proceso de transferencia por membrana genera mucho calor.
7. Lave la membrana con una solución TBST durante 5 minutos cada vez, 5 veces. A continuación, bloquee con un 5% de BSA o un 5% de leche desnatada durante 1 h. Diluir los anticuerpos primarios NF-κB (1:1.000) y β-actina (1:1.000) con BSA al 5%. Sumerja las tiras en la solución de anticuerpos y agite las tiras suavemente durante la noche a 2-8 °C.
8. Lave las tiras con PBST. A continuación, diluir el anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (1:10.000) e incubarlos en el anticuerpo secundario diluido durante 1 h a RT con una suave agitación.
9. Prepare un revelador de quimioluminiscencia mejorada (ECL), colóquelo en la tira e incube durante 3 minutos.
10. Exponga la tira a un generador de imágenes en gel durante 20 s. Mida el valor de gris de la tira para evaluar el nivel de proteína mediante el software del sistema. Utilice la β-actina como control interno.

Resultados

La patogénesis potencial de la silicosis en ratones se investigó utilizando el método propuesto. Encontramos que el peso corporal de los ratones en el grupo experimental disminuyó significativamente en relación con el grupo de control y que el peso corporal se recuperó lentamente después del cese de la exposición. Debido a la dosis optimizada utilizada aquí, no se observó mortalidad en ratones expuestos a sílice en este experimento. La hoja de ruta técnica del goteo nasal repetido a la DCV se muestra en la (<...

Discusión

Los modelos de ratón de silicosis son cruciales para estudiar la patogénesis y el tratamiento de la silicosis. Este protocolo describe un método para preparar un modelo de silicosis en ratones a través de la exposición nasal repetida. Este método permite el estudio de las características patológicas de la silicosis inducida por diferentes tiempos de exposición. Los ratones fueron anestesiados con un respirador y se monitorizó su frecuencia respiratoria. La frecuencia respiratoria inicial corta y rápida disminu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL tube	Biosharp	BS-05-M
10% formalin neutral fixative	Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.	NA
Adobe Illustrator	Adobe	NA
Alcohol disinfectant	Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.	NA
CD68	Abcam	ab125212
Citrate antigen retrieval solution	biosharp life science	BL619A
DAB chromogenic kit	NJJCBio	W026-1-1
Dimethyl benzene	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
Enhanced BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology	P0009
Hematoxylin and Eosin (H&E)	Beyotime Biotechnology	C0105S
HRP substrate	Millipore Corporation	P90720
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	Sa00001-2
Iceacetic acid	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
ImageJ	NIH	NA
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22
Masson's Trichrome stain kit	Solarbio	G1340
Methanol	Macklin	NA
Microtubes	Millipore	AXYMCT150CS
NF-κB p65	Cell Signaling Technology	8242S
Oscillatory thermostatic metal bath	Abson	NA
Paraffin embedding machine	Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.	PBM-A
Paraffin Slicer	Jinhua Kratai Instruments Co.	NA
Phosphate buffer (PBS)	Biosharp	BL601A
Physiological saline	The First People's Hospital of Huainan City	NA
Pipettes	Eppendorf	NA
PMSF	Beyotime Biotechnological	ST505
Polarized light microscope	Olympus	BX51
Precision balance	Acculab	ALC-110.4
Prism7.0	GraphPad	Version 7.0
PVDF membranes	Millipore	3010040001
RIPA lysis buffer	Beyotime Biotechnology	P0013B
RODI IOT intelligent multifunctional water purification system	RSJ	RODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker	Scilogex	NA
SDS-PAGE gel preparation kit	Beyotime Biotechnology	P0012A
Silicon dioxid	Sigma	#BCBV6865
Sirius red staining	Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.	181012
Small animal anesthesia machine	Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.	ZL-04A
Universal Pipette Tips (0.1–10 µL)	KIRGEN	KG1011
Universal Pipette Tips (100–1000 µL)	KIRGEN	KG1313
Universal Pipette Tips (1–200 µL)	KIRGEN	KG1212
Vortex mixer	VWR	NA
ZEISS GeminiSEM 500	Zeiss Germany	SEM 500
β-actin	Bioss	bs-0061R