Ein Silikose-Mausmodell, das durch wiederholtes Einatmen von kristallinem Quarzstaub hergestellt wurde

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Etablierung eines Mausmodells der Silikose durch wiederholte Exposition gegenüber Kieselsäuresuspensionen über einen Nasentropf. Dieses Modell kann den pathologischen Prozess der menschlichen Silikose effizient, bequem und flexibel mit hoher Wiederholbarkeit und Wirtschaftlichkeit nachahmen.

Zusammenfassung

Silikose kann durch die Exposition gegenüber respiratorischem kristallinem Quarzstaub (CSD) in einer industriellen Umgebung verursacht werden. Die Pathophysiologie, das Screening und die Behandlung von Silikose beim Menschen wurden alle ausführlich mit dem Maus-Silikose-Modell untersucht. Indem sie Mäuse wiederholt dazu bringen, CSD in ihre Lunge einzuatmen, können die Mäuse die klinischen Symptome der menschlichen Silikose nachahmen. Diese Methode ist praktisch und effizient in Bezug auf Zeit und Leistung und verursacht keine mechanischen Verletzungen der oberen Atemwege durch Operationen. Darüber hinaus kann dieses Modell den akuten/chronischen Transformationsprozess der Silikose erfolgreich nachahmen. Die wichtigsten Verfahren waren folgende: Das sterilisierte 1-5 μm CSD-Pulver wurde vollständig gemahlen, in Kochsalzlösung suspendiert und 30 min lang in einem Ultraschall-Wasserbad dispergiert. Mäuse unter Isofluran-induzierter Anästhesie wechselten für ca. 2 s von einer flachen, schnellen Atmung zu einer tiefen, langsamen Aspiration. Die Maus wurde in eine Handfläche gelegt, und die Daumenspitze berührte sanft den Lippenrand des Kiefers der Maus, um die Atemwege zu begradigen. Nach jedem Ausatmen atmeten die Mäuse die Kieselsäuresuspension tropfenweise durch ein Nasenloch ein und schlossen den Vorgang innerhalb von 4-8 s ab. Nachdem sich die Atmung der Mäuse stabilisiert hatte, wurde ihre Brust gestreichelt und gestreichelt, um zu verhindern, dass der eingeatmete CSD ausgehustet wird. Die Mäuse wurden dann in den Käfig zurückgebracht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Modell CSD entlang der typischen physiologischen Passage winziger Partikel in die Lunge von den oberen Atemwegen zu den terminalen Bronchiolen und Alveolen quantifizieren kann. Es kann auch die wiederkehrende Exposition von Mitarbeitern aufgrund der Arbeit replizieren. Das Modell kann von einer Person durchgeführt werden und benötigt keine teure Ausrüstung. Es simuliert bequem und effektiv die Krankheitsmerkmale der menschlichen Silikose mit hoher Wiederholbarkeit.

Einleitung

Arbeiter sind unweigerlich unregelmäßigem kristallinem Quarzstaub (CSD) ausgesetzt, der eingeatmet werden kann und in zahlreichen beruflichen Kontexten giftiger ist, darunter Bergbau, Töpferei, Glas, Quarzverarbeitung und Beton ^1,2. Eine chronische Staubinhalation, die als Silikose bekannt ist, verursacht eine fortschreitende Lungenfibrose³. Epidemiologischen Daten zufolge ist die Inzidenz von Silikose in den letzten Jahrzehnten weltweit zurückgegangen, aber in den letzten Jahren hat sie zugenommen und betrifft jüngere Menschen ^4,5,6. Der zugrundeliegende Mechanismus der Silikose stellt aufgrund ihres schleichenden Beginns und der langen Inkubationszeit eine große Herausforderung für die wissenschaftliche Forschung dar. Es ist noch nicht bekannt, wie sich die Silikose entwickelt. Darüber hinaus gibt es derzeit keine Medikamente, die das Fortschreiten der Silikose und der umgekehrten Lungenfibrose aufhalten können.

Die aktuellen Mausmodelle für Silikose beinhalten die tracheale Einnahme einer gemischten CSD-Suspension. Zum Beispiel entspricht die Verabreichung von CSD in die Lunge durch Übernahme des zervikalen Luftröhrentraumas nach der Anästhesie nicht der wiederholten Exposition des Menschen gegenüber Farbstoffstaub⁷. Die Auswirkungen der Exposition gegenüber Umgebungsstaub auf den Menschen können untersucht werden, indem sie CSD in Form von Aerosolen ausgesetzt werden, die die Umweltkonzentrationen dieser giftigen Substanz genauer widerspiegeln⁸. Aufgrund der einzigartigen physiologischen Struktur der Mausnase kann CSD jedoch nicht einfach direkt in die Lunge eingeatmet werden⁹. Darüber hinaus ist die mit dieser Technologie verbundene Ausrüstung teuer, was die Forscher dazu veranlasst hat, das Maus-Silikose-Modell¹⁰ neu zu bewerten. Durch fünfmaliges Einatmen der CSD-Suspension durch einen Nasentropf innerhalb von 2 Wochen war es möglich, ein dynamisches Modell der Silikose zu erstellen. Dieses Modell ist konsistent und sicher und gleichzeitig einfach zu bedienen. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Studie eine wiederholte Inhalation von CSD bei Mäusen ermöglicht. Es wird erwartet, dass das durch dieses Verfahren erstellte Maus-Silikose-Modell für Forschungsanforderungen vorteilhafter ist.

Protokoll

Alle Verfahren folgten den Richtlinien des National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH-Veröffentlichung Nr. 8023, überarbeitet 1978) und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Medizinischen Fakultät der Anhui University of Science and Technology genehmigt.

1. Mäuse managen und füttern

1. Ordnen Sie 20 gesunde männliche C57BL/6-Mäuse in einem Verhältnis von 1:1 der Versuchs- oder Vehikelgruppe zu. Akklimatisieren Sie die Mäuse 1 Woche lang an die neue Umgebung.
2. Sorgen Sie für eine konstante Lichtzeit von 12 h pro Tag. Verwenden Sie einen Zeitschalter für präzises Timing.

2. Vorbereitung der CSD-Aussetzung

1. Mindestens 1 Tag vor dem Nasentropfen die Kieselsäure 0,5 h lang in einem Achatmörser mahlen.
2. Beobachten Sie die Größe und Form der Kristallpartikel. Machen Sie repräsentative Fotos mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM).
   1. Verwenden Sie leitfähiges Klebeband, um die Partikel zu binden, um die Probe für das REM vorzubereiten. Verwenden Sie einen Föhn, um die Silikonpartikel, die nicht fest gebunden sind, vorsichtig wegzublasen.
   2. Evakuieren Sie die Probenkammer, schalten Sie den Hochdruck ein und nehmen Sie das Bild auf.
      HINWEIS: Der Arbeitsabstand (WD) zwischen dem Objektiv und der Probe beträgt 5,9 mm, die Beschleunigungsspannung beträgt 2,0 kV und die Vergrößerung (Mag) beträgt 100.000x bei Verwendung des SignalA-Detektors. Die Partikel werden mit unregelmäßiger Kristallisation dispergiert und haben zu etwa 80 % einen Durchmesser von 1-5 μm (Abbildung 1A).
3. Stellen Sie eine 20 mg/ml sterile CSD-Suspension her. Verdünnen Sie den CSD mit steriler Kochsalzlösung und mischen Sie ihn mit einem Ultraschallschüttler (40 kHz, 80 W) bei Raumtemperatur (RT) für 30 min.
4. Rühren und mischen Sie die CSD-Suspension 10 s lang gründlich auf einem Vortex-Mischer, bevor Sie die Nasentropfen verabreichen.

3. Verabreichung von Nasentropfen an Mäuse

1. Schnelles Anästhesieren einer Maus mit 2 % Isofluran in einer Dosis von 3,6 ml/h in einem Anästhesiegerät (Abbildung 1B, linkes Bild).
   HINWEIS: Die Anästhesie sollte in einem Abzug durchgeführt werden, um ein Einatmen des Anästhetikums durch den Techniker zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die angemessene Tiefe der Anästhesie erreicht wird, indem Sie den Wechsel von schneller und unregelmäßiger Atmung zu einem langsamen und stetigen Zustand bei den Mäusen beobachten.
2. Tropfen Sie 50 μl des CSD nasal innerhalb von 4-8 s (Abbildung 1B, rechts).
   1. Für den Nasentropf legen Sie den Kopf der Maus mit der Spitze des Zeigefingers auf das Metakarpophalangealgelenk des Forschers.
   2. Halten Sie die Maus in Bauchlage, wobei vier Finger leicht gebeugt sind und die Daumenspitze leicht die Unterlippe der Maus berührt, um die Atemwege zu begradigen. Vermeiden Sie es, den Rachen zu berühren, um den Würgereflex auszulösen.
   3. 50 μl Flüssigkeit mit einer 200 μl Pipette absaugen. Träufeln Sie die Flüssigkeit in drei bis vier geteilten Dosen in die Nasenhöhle der Maus, abhängig von der Atemfrequenz der Maus. Jede Instillation sollte aus 15 bis 20 μl Flüssigkeit bestehen. Verabreichen Sie die Infusionen einmal alle 3 Tage, 5x innerhalb von 12 Tagen. Behandeln Sie die Steuermaus mit der gleichen Menge Kochsalzlösung.
3. Massieren Sie den Herzbereich der Maus 5x-10x 5 s lang sanft ein.
   1. Halten Sie den Körper der Maus mit der Handfläche fest, kneifen Sie mit Daumen und Zeigefinger in die Haut im Nacken und fixieren Sie mit den anderen Fingern die Hinterbeine der Maus. Drücken Sie dann mit dem Zeigefinger der anderen Hand 5-10 Mal in einem Zeitraum von 5 s sanft auf den Herzschlagbereich der Maus.
4. Wenn sich die Atmung der Maus stabilisiert hat, setzen Sie sie in einen Erholungskäfig mit einem Heizkissen und beobachten Sie, bis sie sich von der Narkose erholt, und bringen Sie die Maus dann in ihren Heimatkäfig zurück. Opfern Sie die Maus nach 31 Tagen.

4. Entnahme des Lungengewebes und Anfertigung eines Paraffinschnitts

1. Injizieren Sie 0,18 ml 10%iges Chloralhydrat intraperitoneal und stellen Sie sicher, dass die Mäuse nicht auf die Zehen- oder Schwanzstimulation (mit der Zahnzange) reagieren. Fahren Sie dann mit dem nächsten Schritt fort.
2. Befestigen Sie die Gliedmaßen der Maus auf einem Schaumstoff-Testbrett und besprühen Sie das Fell mit 75%igem Alkohol. Entfernen Sie den größten Teil der Brustrippen an der Mittellinie des Schlüsselbeins und öffnen Sie die Brusthöhle der Mäuse, um Herz und Lunge freizulegen.
3. Schneiden Sie sofort den rechten Vorhof mit einer ophthalmologischen chirurgischen Schere auf und injizieren Sie langsam 20 ml Phosphatpuffer (PBS) aus der Herzspitze am linken Vorhofschlag mit der größten Amplitude, damit das ganze Blut fließen kann. Als nächstes entfernen Sie den unteren Lungenlappen der rechten Lunge und lagern ihn bei -80 °C für die Western-Blotting-Analyse.
4. Nach der PBS-Injektion 10 ml 4%iges Paraformaldehyd (PFA) an derselben Stelle perfundieren. Entnehmen Sie die verbleibende Lunge und bewahren Sie die Probe in 30 ml 4% PFA für die pathologische Analyse auf.
5. Nach 72 h Fixierung werden die Proben in Paraffin eingebettet.
   1. Dehydrieren Sie das Gewebe durch eine abgestufte Reihe von Ethanol (EtOH)-Verdünnungen in deionisiertem Wasser (60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %) für jeweils 1 Stunde bei RT. Reinigen Sie die Probe in zwei Wäschen von Xylol für jeweils 1 Stunde.
   2. Infiltrieren Sie die Proben mit dem geschmolzenen Paraffinwachs, indem Sie es 2 h lang auf 50 °C erhitzen. Wiederholen Sie diesen Vorgang in einem anderen Zylinder. Kühlen Sie die Wachsformen mit Tüchern 1 h lang zum Aushärten ab.
   3. Nachdem das Wachs ausgehärtet und das Gewebe eingebettet wurde, wird das Gewebe mit einer Paraffinschneidemaschine bei 5 μm geschnitten. Die genauen Schritte zum Schneiden und Montieren des Schlittens wurden bereits^{beschrieben 11}.
      HINWEIS: Eine ausreichende Gewebedurchblutung wird angezeigt, wenn sich nach Erhalt von 10 ml 4% PFA Muskelzuckungen und Schwanzdrehungen in eine "S"-Form oder Beugung entwickeln.

5. Durchführung der Hämatoxylin- und Eosinfärbung (HE)

1. Erhitzen Sie das in Paraffin eingebettete Gewebe auf einer heißen Platte (60 °C) für mehr als 4 Stunden, um eine Haftung auf den Objektträgern und eine verbesserte Entparaffinierung zu ermöglichen.
2. Paraffinabschnitte entwachsen und hydratisieren. Tränken Sie die Objektträger mit Proben in Xylol 2x für jeweils 30 min. Als nächstes tauchen Sie sie 5 Minuten lang in wasserfreies Ethanol, dann in 95 %, 85 %, 75 % Alkohol und deionisiertes Wasser.
3. Führen Sie eine Hämatoxylin- und Eosinfärbung durch. Färben Sie das Gewebe 10 Minuten lang in einem Hämatoxylin-Färbeeimer. Spülen Sie sie 5 Minuten lang mit leicht fließendem Wasser ab. Tauchen Sie die Objektträger dann für 10 s in den Eosin-Färbeeimer.
4. Dehydrieren Sie die Proben in 75 %, 85 %, 95 % und wasserfreiem Ethanol für jeweils 5 Minuten. Reinigen Sie die Gewebeschnitte, indem Sie sie 5 Minuten lang in Xylol tauchen. Versiegeln Sie den Abschnitt mit ca. 60 μl Neutralharztropfen. Legen Sie den Abdeckschieber über den Abschnitt und senken Sie ihn vorsichtig ab, um Luftblasen zu vermeiden.

6. Durchführung der Masson-Färbung

1. Entwachsen und hydratisieren Sie die Paraffinproben, wie in Schritt 5.2 beschrieben. Anschließend färben Sie die Zellkerne 10 Minuten lang mit 50%igem Weigert-Hämatoxylin. Weichen Sie das Gewebe 10 s lang in saurer Ethanolverflüssigung ein und spülen Sie die Gewebeobjektträger vorsichtig mit fließendem Wasser ab, um die Kerne zu bläuen.
   HINWEIS: Bereiten Sie die Hämatoxylin-Färbelösung von Weigert unmittelbar vor der Anwendung vor.
2. Die Proben werden 7 Minuten lang mit Tropfen Lichunrot-Färbelösung (40 μl für jeden Objektträger) gefärbt und 1 Minute lang mit einer schwach sauren Arbeitslösung (30%ige Salzsäure) gewaschen, um den ungebundenen Lichunrot-Farbstoff zu entfernen.
3. Tauchen Sie sie für 20 s in 95%igen Alkohol und dehydrieren Sie sie 2x mit wasserfreiem Ethanol für jeweils 1-3 s. Danach reinigen Sie das Gewebe mit Xylol und versiegeln Sie es mit 60 μl neutralen Harztropfen, wie in Schritt 5.4 beschrieben.

7. Durchführung der Sirius-Rot-Färbung

1. Entwachsen und hydratisieren Sie Paraffinabschnitte wie in Schritt 5.2 beschrieben.
2. Infiltrieren Sie die Schnitte für 1 Stunde mit Sirius-Rot-Färbelösung.
3. Färben Sie die Zellkerne der Proben für 8-10 min mit Mayer-Hämatoxylin-Färbelösung. Spülen Sie sie 10 Minuten lang vorsichtig mit fließendem Wasser ab. Dehydrieren und reinigen Sie dann die Gewebeobjektträger. Versiegeln Sie sie wie in Schritt 5.4 beschrieben.

8. Durchführung der Immunhistochemie

1. Entwachsen und hydratisieren Sie die Paraffinproben wie in Schritt 5.2 beschrieben.
2. Infiltrieren Sie die Proben mit einer 3 mg/ml EDTA-Antigen-Entnahmelösung von etwa 30 ml. 20-30 Min. kochen lassen. Waschen Sie das Gewebe mit deionisiertem Wasser und inkubieren Sie es dann 5 Minuten lang in phosphatgepufferter Lösung mit 0,5 % Tween-20 (PBST).
3. Tränken Sie die Proben 15 Minuten lang mit 0,3%iger Wasserstoffperoxidlösung, um die endogene Peroxidase in den Proben zu inaktivieren. Waschen Sie sie 3x mit PBST für jeweils 5 min.
   HINWEIS: Die 0,3%ige Wasserstoffperoxidlösung muss in einer lichtdichten Umgebung frisch zubereitet werden.
4. Permeabilisieren Sie die Membran der Proben für 15 Minuten mit 0,3%iger Triton-100-Lösung. Anschließend mit 30-40 μl 5%igem Rinderserumalbumin (BSA) für 1 h blockieren.
5. Entfernen Sie die blockierende Lösung. Die verdünnten Primärantikörper NF-κB (Verdünnung 1:200) und CD68 (Verdünnung 1:1.000) werden zugegeben und die Proben über Nacht bei 2-8 °C in einer IHC-Nassbox für Objektträger inkubiert, um Verdunstung und Licht zu vermeiden.
6. Übertragen Sie sie am nächsten Tag für 1 Stunde auf RT. Waschen Sie sie dann 3x mit PBST für jeweils 5 min.
7. Die Proben werden für 1 h in Kaninchen-Anti-Maus-Meerrettich-Peroxidase-markierten Sekundärantikörpern (Verdünnungsverhältnis 1:500) bei RT inkubiert und 3x für jeweils 5 min mit PBST gewaschen.
   HINWEIS: Sowohl die primären als auch die sekundären Antikörper wurden mit 5% BSA verdünnt.
8. Die Proben werden mit dem 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Substrat, das dem enzymmarkierten Antikörper entspricht, für 5-20 Minuten inkubiert. Stoppen Sie die Reaktion mit deionisiertem Wasser, wenn die optimale Färbeintensität erreicht ist.
   HINWEIS: Die DAB-Lösung muss frisch zubereitet und vor Licht geschützt werden. Die Farbentwicklungsreaktion sollte in Echtzeit unter dem Mikroskop beobachtet werden, um festzustellen, wann die Färbung gestoppt werden muss. Positive Proben weisen eine intensive Färbung auf, während negative Proben keine Farbe entwickeln.
9. Die Proben 30 s lang mit Weigert-Hämatoxylin gegenfärben. Spülen Sie das Gewebe anschließend 1 Minute lang unter fließendem Wasser ab. Entwässern, reinigen und versiegeln Sie dann die Objektträger, wie in Schritt 5.4 beschrieben.

9. Durchführung der Western-Blotting-Analyse

1. Lysieren Sie das Lungengewebe, um Proteine zu extrahieren. 200 μl RIPA-Arbeitslösung zu 20 mg Lungengewebe geben.
2. Homogenisieren Sie das Gewebe auf Eis für 5 Minuten mit einem elektrischen Handgrinder und inkubieren Sie es 1 Stunde lang auf Eis mit leichtem Schütteln. Anschließend wird das Homogenat bei 4 °C für 15 min bei 14.800 x g zentrifugiert.
3. Sammeln Sie den Überstand und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem BCA-Protein-Assay-Kit. Stellen Sie die Proteinspeicherlösung mit RIPA bei 6 μg/μl Protein her. Zu den 80 μl des Proteinlysats werden 20 μl 5-facher Ladepuffer hinzugefügt. Die sekundäre Proteinstruktur wird durch Erhitzen der proteinhaltigen Mikrozentrifugenröhrchen in einem Metallbad (100 °C) für 20 min aufgebrochen.
4. Nach dem Abkühlen werden 100 μl der Proteinspeicherlösung in jedes Röhrchen aliquotiert und die Proben in einem -80 °C heißen Kühlschrank gelagert. Verdünnen Sie die Proteinkonzentration vor der Elektrophorese auf 2–3 μg/μl mit 1x Ladepuffer.
   HINWEIS: Der Proteinextraktionsprozess sollte auf Eis durchgeführt werden. Für die RIPA-Arbeitslösung 1 μl 100 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) zu 99 μl RIPA hinzufügen, um den Abbau phosphorylierter Proteine zu hemmen.  Bereiten Sie 1x Ladepuffer vor, indem Sie 5x Ladepuffer mit RIPA im Verhältnis 1:4 verdünnen.
5. Geben Sie 20 μg Proben in jede Vertiefung und lassen Sie das Gel laufen. Verwenden Sie für konzentrierte Gele mit 5 % 80 V für 20 Minuten, um die Proteine vom gleichen Ausgangspunkt aus elektrophoresieren zu lassen. Bei 10%igen isolierten Gelen 1 h lang bei 100 V laufen, damit die Proteine unterschiedlichen Molekulargewichts so weit wie möglich getrennt werden können.
6. Die PVDF-Membran mit Methanol für 20 s voraktivieren. Die Proteine werden im Nasstransferverfahren mit 400 mA Strom für 1-2 h auf die PVDF-Membran übertragen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Elektrophoresetank und der Elektrotransfertank waagerecht sind. Kühlen Sie den gesamten Tank mit Eis, da der Membrantransferprozess viel Wärme erzeugt.
7. Waschen Sie die Membran 5x jeweils 5 Minuten lang mit TBST-Lösung. Anschließend mit 5 % BSA oder 5 % Magermilch 1 h lang blocken. Verdünnen Sie die Primärantikörper NF-κB (1:1.000) und β-Aktin (1:1.000) mit 5% BSA. Tauchen Sie die Streifen in die Antikörperlösung und schütteln Sie die Streifen vorsichtig über Nacht bei 2-8 °C.
8. Waschen Sie die Streifen mit PBST. Als nächstes wird der Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:10.000) verdünnt und im verdünnten Sekundärantikörper 1 h bei RT unter leichtem Schütteln inkubiert.
9. Bereiten Sie einen ECL-Entwickler (Enhanced Chemiluminescence) vor, geben Sie ihn auf den Streifen und inkubieren Sie ihn 3 Minuten lang.
10. Belichten Sie den Streifen 20 s lang einem Gel-Imager. Messen Sie den Grauwert des Streifens, um den Proteingehalt mit der Systemsoftware zu beurteilen. Verwenden Sie β-Aktin als interne Kontrolle.

Ergebnisse

Die potentielle Pathogenese der Silikose in Mäusen wurde mit der vorgeschlagenen Methode untersucht. Wir fanden heraus, dass das Körpergewicht der Mäuse in der Versuchsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant abnahm und dass sich das Körpergewicht nach Beendigung der Exposition langsam erholte. Aufgrund der hier verwendeten optimierten Dosis wurde in diesem Experiment keine Mortalität bei Kieselsäure-exponierten Mäusen beobachtet. Die technische Roadmap von wiederholtem Nasentropf zu CSD ist in (

Diskussion

Silikose-Mausmodelle sind entscheidend für die Erforschung der Pathogenese und Behandlung der Silikose. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Modells der Silikose bei Mäusen durch wiederholte nasale Exposition. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der pathologischen Merkmale der Silikose, die durch unterschiedliche Expositionszeiten induziert wird. Die Mäuse wurden an einem Beatmungsgerät betäubt und ihre Atemfrequenz wurde überwacht. Die anfängliche kurze, schnelle Atemfrequenz ver...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL tube	Biosharp	BS-05-M
10% formalin neutral fixative	Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.	NA
Adobe Illustrator	Adobe	NA
Alcohol disinfectant	Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.	NA
CD68	Abcam	ab125212
Citrate antigen retrieval solution	biosharp life science	BL619A
DAB chromogenic kit	NJJCBio	W026-1-1
Dimethyl benzene	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
Enhanced BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology	P0009
Hematoxylin and Eosin (H&E)	Beyotime Biotechnology	C0105S
HRP substrate	Millipore Corporation	P90720
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	Sa00001-2
Iceacetic acid	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
ImageJ	NIH	NA
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22
Masson's Trichrome stain kit	Solarbio	G1340
Methanol	Macklin	NA
Microtubes	Millipore	AXYMCT150CS
NF-κB p65	Cell Signaling Technology	8242S
Oscillatory thermostatic metal bath	Abson	NA
Paraffin embedding machine	Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.	PBM-A
Paraffin Slicer	Jinhua Kratai Instruments Co.	NA
Phosphate buffer (PBS)	Biosharp	BL601A
Physiological saline	The First People's Hospital of Huainan City	NA
Pipettes	Eppendorf	NA
PMSF	Beyotime Biotechnological	ST505
Polarized light microscope	Olympus	BX51
Precision balance	Acculab	ALC-110.4
Prism7.0	GraphPad	Version 7.0
PVDF membranes	Millipore	3010040001
RIPA lysis buffer	Beyotime Biotechnology	P0013B
RODI IOT intelligent multifunctional water purification system	RSJ	RODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker	Scilogex	NA
SDS-PAGE gel preparation kit	Beyotime Biotechnology	P0012A
Silicon dioxid	Sigma	#BCBV6865
Sirius red staining	Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.	181012
Small animal anesthesia machine	Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.	ZL-04A
Universal Pipette Tips (0.1–10 µL)	KIRGEN	KG1011
Universal Pipette Tips (100–1000 µL)	KIRGEN	KG1313
Universal Pipette Tips (1–200 µL)	KIRGEN	KG1212
Vortex mixer	VWR	NA
ZEISS GeminiSEM 500	Zeiss Germany	SEM 500
β-actin	Bioss	bs-0061R