결정질 실리카 분진을 반복적으로 흡입하여 확립된 규폐증 마우스 모델

요약

이 프로토콜은 비강 점적을 통해 실리카 현탁액에 반복적으로 노출되어 규폐증의 마우스 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 높은 반복성과 경제성으로 인간 규폐증의 병리학적 과정을 효율적이고 편리하며 유연하게 모방할 수 있습니다.

초록

규폐증은 산업 환경에서 호흡기 결정질 실리카 분진(CSD)에 노출되어 발생할 수 있습니다. 인간의 규폐증의 병태생리학, 스크리닝 및 치료는 모두 마우스 규폐증 모델을 사용하여 광범위하게 연구되었습니다. 쥐가 CSD를 폐로 반복적으로 흡입하게 함으로써 쥐는 인간 규폐증의 임상 증상을 모방할 수 있습니다. 이 방법론은 시간과 출력 측면에서 실용적이고 효율적이며 수술로 인해 상부 호흡기에 기계적 손상을 일으키지 않습니다. 또한, 이 모델은 규폐증의 급성/만성 변형 과정을 성공적으로 모방할 수 있습니다. 주요 절차는 다음과 같습니다. 멸균된 1-5μm CSD 분말을 완전히 분쇄하고, 식염수에 현탁시키고, 초음파 수조에 30분 동안 분산시켰다. 이소플루란 유도 마취 하에 있는 마우스는 약 2초 동안 얕은 빠른 호흡에서 깊고 느린 흡인으로 전환했습니다. 쥐를 손바닥에 놓고 엄지손가락 끝이 쥐 턱의 입술 가장자리에 부드럽게 닿아 기도를 곧게 펴도록 했습니다. 숨을 내쉴 때마다 생쥐는 한쪽 콧구멍을 통해 실리카 현탁액을 한 방울씩 들이마시고 4-8초 이내에 이 과정을 완료했습니다. 생쥐의 호흡이 안정된 후, 흡입된 CSD가 기침을 하지 않도록 가슴을 쓰다듬고 애무했습니다. 그런 다음 쥐를 케이지로 되돌려 보냈습니다. 결론적으로, 이 모델은 상부 호흡기에서 말단 세기관지 및 폐포에 이르기까지 폐로 들어가는 작은 입자의 전형적인 생리학적 통로를 따라 CSD를 정량화할 수 있습니다. 또한 업무로 인한 직원의 반복적인 노출을 복제할 수 있습니다. 이 모델은 한 사람이 수행할 수 있으며 고가의 장비가 필요하지 않습니다. 높은 반복성으로 인간 규폐증의 질병 특징을 편리하고 효과적으로 시뮬레이션합니다.

서문

작업자는 필연적으로 불규칙한 결정질 실리카 분진(CSD)에 노출되며, 이는 흡입될 수 있으며 광업, 도자기, 유리, 석영 가공 및 콘크리트를 포함한 다양한 직업 환경에서 더 독성이 있습니다 ^1,2. 규폐증으로 알려진 만성 분진 흡입 질환은 진행성 폐 섬유증을 유발한다³. 역학 자료에 따르면, 규폐증의 발병률은 지난 수십 년 동안 전 세계적으로 감소해 왔지만, 최근 몇 년 동안 증가하여 젊은 사람들에게 영향을 미치고 있다 ^4,5,6. 규폐증의 근본적인 메커니즘은 잠복기 시작과 장기간의 잠복기로 인해 과학 연구에 중요한 도전을 제시합니다. 규폐증이 어떻게 발생하는지는 아직 알려져 있지 않습니다. 더욱이, 현재의 어떤 약물도 규폐증의 진행을 막고 폐섬유증을 역전시킬 수 없습니다.

규폐증에 대한 현재 마우스 모델은 CSD의 혼합 현탁액의 기관 섭취를 포함합니다. 예를 들어, 마취 후 자궁경부 기관 외상을 채택하여 폐에 CSD를 투여하는 것은 염료 분진에 대한 반복적인 인체 노출을 준수하지 않는다⁷. 주변 먼지에 대한 노출이 개인에게 미치는 영향은 이 독성 물질의 환경 농도를 보다 정확하게 반영하는 에어로졸 형태의 CSD에 노출시켜 연구할 수 있습니다⁸. 그러나 환경적 CSD는 생쥐 코의 독특한 생리학적 구조로 인해 단순히 폐로 직접 흡입될 수 없다⁹. 더욱이, 이 기술과 관련된 장비는 고가이기 때문에 연구자들은 쥐 규폐증 모델¹⁰을 재평가하게 되었습니다. 2주 이내에 비강을 통해 CSD 현탁액을 5회 흡입함으로써 규폐증의 동적 모델을 구축할 수 있었습니다. 이 모델은 사용하기 쉬우면서도 일관되고 안전합니다. 이 연구는 생쥐에서 CSD의 반복적인 흡입을 허용한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 절차를 통해 생성된 마우스 규폐증 모델은 연구 요구 사항에 더 도움이 될 것으로 예상됩니다.

프로토콜

모든 절차는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(NIH Publication No. 8023, 1978년 개정)의 지침을 따랐으며 안후이 과학기술대학 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 쥐 관리 및 먹이 주기

1. 건강한 C57BL/6 수컷 마우스 20마리를 1:1 비율로 실험 그룹 또는 비히클 그룹에 할당합니다. 생쥐를 1주일 동안 새로운 환경에 적응시킵니다.
2. 하루 12시간의 일정한 조명 시간을 제공합니다. 정확한 타이밍을 위해 시간 제어 스위치를 사용하십시오.

2. CSD 서스펜션 준비

1. 비강이 떨어지기 최소 1 일 전에 마노 모르타르에서 실리카를 0.5 시간 동안 갈아줍니다.
2. 결정 입자의 크기와 모양을 관찰하십시오. 주사전자현미경(SEM)을 사용하여 대표 사진을 찍습니다.
   1. 전도성 테이프를 사용하여 입자를 묶어 SEM용 샘플을 준비합니다. 헤어 드라이어를 사용하여 단단히 결합되지 않은 실리콘 입자를 부드럽게 불어냅니다.
   2. 샘플 챔버를 비우고 고압을 켜고 이미지를 캡처합니다.
      참고: 렌즈와 샘플 사이의 작동 거리(WD)는 5.9mm, 가속 전압은 2.0kV, 배율(Mag)은 100,000x입니다. 입자는 불규칙한 결정화로 분산되며 약 80%의 직경은 1-5μm입니다(그림 1A).
3. 20mg/mL 멸균 CSD 현탁액을 만듭니다. 멸균 식염수를 사용하여 CSD를 희석하고 실온(RT)에서 초음파 셰이커(40kHz, 80W)와 30분 동안 혼합합니다.
4. 비강 물방울을 투여하기 전에 소용돌이 믹서에서 CSD 서스펜션을 10초 동안 완전히 저어주고 혼합합니다.

3. 마우스에 비강 점적 투여

1. 마취 기계에서 3.6mL/h의 용량으로 2% 이소플루란으로 마우스를 빠르게 마취합니다(그림 1B, 왼쪽 패널).
   알림: 마취는 기술자가 마취제를 흡입하지 않도록 흄 후드에서 수행해야 합니다. 마우스에서 빠르고 불규칙한 호흡에서 느리고 안정된 상태로의 변화를 관찰하여 적절한 마취 깊이를 확인하십시오.
2. 4-8초 이내에 CSD의 50μL를 비강으로 떨어뜨립니다(그림 1B, 오른쪽).
   1. 콧방울의 경우 집게 손가락 끝으로 연구원의 중수골 관절에 쥐의 머리를 놓습니다.
   2. 네 손가락을 약간 구부리고 엄지손가락 끝이 마우스의 아랫입술에 가볍게 닿아 기도를 곧게 펴면서 마우스를 엎드린 자세로 유지합니다. 개그 반사를 유도하기 위해 인두를 만지지 마십시오.
   3. 200μl 피펫을 사용하여 50μl의 액체를 흡입합니다. 쥐의 호흡수에 따라 3-4 분할 용량으로 액체를 쥐의 비강에 떨어 뜨립니다. 각 점안액은 15-20 μl의 액체로 구성되어야 합니다. 3일에 한 번, 12일 이내에 5번 투여하십시오. 대조군 마우스에 동일한 양의 식염수를 투여하십시오.
3. 마우스의 심장 부위를 5x-10x 5초 동안 부드럽게 마사지합니다.
   1. 손바닥으로 쥐의 몸을 잡고 엄지와 검지로 목 뒤쪽 피부를 꼬집고 다른 손가락으로 쥐의 뒷다리를 고정합니다. 그런 다음 다른 손의 검지로 마우스의 심장 박동 부위를 5초 동안 10-5회 부드럽게 누릅니다.
4. 쥐의 호흡이 안정되면 온열 패드가 있는 회복 케이지에 넣고 마취에서 회복될 때까지 관찰한 다음 쥐를 홈 케이지로 되돌립니다. 31일에 쥐를 희생하십시오.

4. 폐 조직 채취 및 파라핀 절개 준비

1. 0.18mL의 10% 클로랄 하이드레이트를 복강 내에 주입하여 쥐가 발가락이나 꼬리 자극(톱니 겸자를 사용하여 수행)에 반응하지 않도록 합니다. 그런 다음 다음 단계로 진행합니다.
2. 폼 테스트 보드에 쥐 팔다리를 고정하고 75% 알코올을 뿌려 털을 적십니다. 쇄골 정중선에 있는 흉부 갈비뼈 대부분을 제거하고 쥐의 흉강을 열어 심장과 폐를 노출시킵니다.
3. 즉시 안과 수술용 가위로 우심방을 절개하고 좌심방 박동에서 심장 끝에서 인산염 완충액(PBS) 20mL를 가장 큰 진폭으로 천천히 주입하여 전혈이 흐를 수 있도록 합니다. 그런 다음 우측 폐의 하엽을 제거하고 -80°C에서 보관하여 웨스턴 블로팅 분석을 수행합니다.
4. PBS 주입 후 동일한 부위에 4% 파라포름알데히드(PFA) 10mL를 계속 관류합니다. 남은 폐를 채취하고 병리학적 분석을 위해 샘플을 4% PFA 30mL에 보존합니다.
5. 72시간 고정 후 표본을 파라핀에 묻습니다.
   1. RT에서 각각 1시간 동안 탈이온수(60%, 70%, 80%, 90%, 100%)에 등급이 매겨진 일련의 에탄올(EtOH) 희석액을 통해 조직을 탈수합니다. 각각 1시간 동안 두 번의 크실렌 세척으로 샘플을 제거합니다.
   2. 녹인 파라핀 왁스를 50°C에서 2시간 동안 가열하여 샘플에 침투시킵니다. 다른 실린더에서 이 과정을 반복합니다. 왁스 몰드를 티슈로 1시간 동안 식혀 굳힙니다.
   3. 왁스가 굳고 조직이 박힌 후 파라핀 절편 기계를 사용하여 조직을 5μm로 자릅니다. 정확한 단면 및 슬라이드 장착 단계는 이전에^{설명했습니다 11}.
      참고: 10mL의 4% PFA를 투여받은 후 근육 경련 및 꼬리가 "S"자 모양으로 비틀리거나 굴곡이 발생하여 충분한 조직 관류가 나타납니다.

5. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색 수행

1. 파라핀이 함유된 조직을 열판(60°C)에서 4시간 이상 가열하여 슬라이드에 접착하고 분리를 개선합니다.
2. 파라핀 섹션을 왁스로 제거하고 수화하십시오. 샘플이 있는 슬라이드를 매번 크실렌에 2번 30분 동안 담그십시오. 다음으로 무수 에탄올, 95%, 85%, 75% 알코올 및 탈이온수에 각각 5분 동안 담그십시오.
3. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행합니다. 헤마톡실린 염색 양동이에 조직을 10분 동안 염색합니다. 흐르는 물로 5분 동안 부드럽게 헹굽니다. 그런 다음 슬라이드를 에오신 염색 버킷에 10초 동안 담그십시오.
4. 샘플을 75%, 85%, 95% 및 무수 에탄올로 각각 5분 동안 탈수합니다. 조직 부분을 크실렌에 5분 동안 담가 청소합니다. 약 60μL의 중성 수지 방울로 섹션을 밀봉합니다. 커버 슬라이드를 섹션 위에 놓고 기포가 발생하지 않도록 조심스럽게 내립니다.

6. Masson 염색 수행

1. 5.2단계에서 언급한 대로 파라핀 샘플을 왁스로 제거하고 수화합니다. 그런 다음 50% Weigert의 헤마톡실린으로 세포핵을 10분 동안 염색합니다. 조직을 산성 에탄올 액화에 10초 동안 담그고 핵 청색을 위해 흐르는 물로 조직 슬라이드를 부드럽게 헹굽니다.
   알림: Weigert의 헤마톡실린 염색 용액은 사용 직전에 준비하십시오.
2. Lichun red 염색 용액(각 조직 슬라이드당 40μL) 방울로 샘플을 7분 동안 염색하고 약산성 작업 용액(30% 염산)으로 1분 동안 세척하여 결합되지 않은 Lichun red 염료를 제거합니다.
3. 95 % 알코올에 20 초 동안 담그고 무수 에탄올로 각각 1-3 초 동안 2 번 탈수합니다. 그런 다음 크실렌으로 조직을 청소하고 5.4단계에서 언급한 대로 60μL의 중성 수지 방울로 밀봉합니다.

7. 시리우스 레드 염색 수행

1. 5.2단계에서 언급한 대로 파라핀 섹션을 왁스 및 수화합니다.
2. Sirius 적색 염색액으로 1시간 동안 섹션을 침투시킵니다.
3. 샘플의 세포핵을 Mayer 헤마톡실린 염색액으로 8-10분 동안 염색합니다. 흐르는 물로 10분 동안 부드럽게 헹굽니다. 그런 다음 탈수를 제거하고 조직 슬라이드를 청소합니다. 5.4단계에서 언급한 대로 봉인합니다.

8. 면역조직화학 수행

1. 단계 5.2에 기술된 대로 파라핀 샘플을 왁스를 제거하고 수화합니다.
2. 약 30mL의 3mg/mL EDTA 항원 회수 용액으로 검체를 침투시킵니다. 20-30분 동안 끓입니다. 조직을 탈이온수로 세척한 다음 0.5% Tween-20(PBST)을 함유한 인산염 완충 용액에서 5분 동안 배양합니다.
3. 0.3% 과산화수소 용액으로 샘플을 15분 동안 담그어 샘플의 내인성 과산화효소를 비활성화합니다. 매번 5분 동안 PBST로 3번 세척합니다.
   알림: 0.3% 과산화수소 용액은 차광 환경에서 신선하게 만들어야 합니다.
4. 0.3% Triton-100 용액으로 15분 동안 시편의 막을 투과시킵니다. 그런 다음 30-40 μL의 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 1 시간 동안 차단하십시오.
5. 차단 용액을 제거합니다. 희석된 1차 항체 NF-κB(희석 1:200) 및 CD68(희석 1:1,000)을 추가하고 증발과 빛을 방지하기 위해 현미경 슬라이드 IHC 습식 상자에서 2-8°C에서 밤새 검체를 배양합니다.
6. 다음날 1시간 동안 RT로 옮깁니다. 그런 다음 PBST로 각각 5분 동안 3번 세척합니다.
7. 샘플을 RT에서 토끼 항 마우스 양 고추 냉이 과산화 효소 표지 된 2 차 항체 (희석 비율 1 : 500)에서 1 시간 동안 배양하고 PBST로 각각 5 분 동안 3 번 세척합니다.
   참고: 1차 및 2차 항체 모두 5% BSA로 희석되었습니다.
8. 효소 표지 항체에 해당하는 3,3'-Diaminobenzidine(DAB) 기질로 샘플을 5-20분 동안 배양합니다. 최적의 염색 강도에 도달하면 탈이온수로 반응을 중지하십시오.
   알림: DAB 용액은 신선하게 준비하고 빛으로부터 보호해야 합니다. 색상 발색 반응은 염색을 중지할 시기를 결정하기 위해 현미경으로 실시간으로 관찰해야 합니다. 양성 표본은 강렬한 염색을 나타내는 반면 음성 표본은 색이 발생하지 않습니다.
9. Weigert hematoxylin으로 30초 동안 샘플을 대조염색합니다. 그런 다음 흐르는 물에 1분 동안 티슈를 헹굽니다. 그런 다음 5.4단계에서 언급한 대로 조직 슬라이드를 탈수하고 청소하고 밀봉합니다.

9. 웨스턴 블로팅 분석 수행

1. 폐 조직을 용해하여 단백질을 추출합니다. 200μL의 RIPA 작동 용액을 폐 조직 20mg에 추가합니다.
2. 휴대용 전기 그라인더를 사용하여 얼음 위에서 5분 동안 조직을 균질화하고 부드럽게 흔들면서 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 균질액을 4°C에서 14,800 x g에서 15분 동안 원심분리합니다.
3. 상층액을 채취하고 BCA 단백질 분석 키트로 단백질 농도를 측정합니다. 6μg/μL 단백질에서 RIPA로 단백질 저장 용액을 만듭니다. 단백질 용해물 80μL에 20μL의 5x 로딩 버퍼를 추가합니다. 단백질 함유 마이크로 원심분리기 튜브를 금속 수조(100°C)에서 20분 동안 가열하여 2차 단백질 구조를 파괴합니다.
4. 냉각 후 단백질 저장 용액 100μL를 각 튜브에 분주하고 샘플을 -80°C 냉장고에 보관합니다. 전기영동 전에 단백질 농도를 1x 로딩 버퍼를 사용하여 2–3μg/μL로 희석합니다.
   알림: 단백질 추출 과정은 얼음 위에서 수행해야 합니다. RIPA 작업 용액의 경우 100mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF) 1μL를 RIPA 99μL에 첨가하여 인산화된 단백질 분해를 억제합니다.  5x 로딩 버퍼를 RIPA로 1:4 비율로 희석하여 1x 로딩 버퍼를 준비합니다.
5. 각 웰에 20μg의 샘플을 추가하고 겔을 실행합니다. 5% 농축 겔의 경우 20분 동안 80V를 사용하여 동일한 시작점에서 단백질을 전기영동합니다. 10% 분리된 겔의 경우 100V에서 1시간 동안 실행하여 분자량이 다른 단백질을 최대한 분리할 수 있습니다.
6. PVDF 멤브레인을 메탄올로 20초 동안 사전 활성화합니다. 1-2시간 동안 400mA 전류로 습식 전달 방법을 사용하여 단백질을 PVDF 멤브레인으로 전달합니다.
   알림: 전기영동 탱크와 전기전사 탱크가 수평인지 확인하십시오. 멤브레인 이송 과정에서 많은 열이 발생하므로 전체 탱크를 얼음으로 식히십시오.
7. 멤브레인을 TBST 용액으로 매번 5분 동안 5회 세척합니다. 그런 다음 5% BSA 또는 5% 탈지유로 1시간 동안 차단하십시오. 1차 항체 NF-κB(1:1,000)와 β-액틴(1:1,000)을 5% BSA로 희석합니다. 스트립을 항체 용액에 담그고 2-8 °C에서 밤새 부드럽게 흔듭니다.
8. PBST로 스트립을 세척하십시오. 다음으로, 양 고추냉이 과산화효소(HRP)-접합 염소 항토끼 2차 항체(1:10,000)를 희석하고, 희석된 2차 항체에서 RT에서 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 배양합니다.
9. ECL(enhanced chemiluminescence) 현상액을 준비하여 스트립에 떨어뜨리고 3분 동안 배양합니다.
10. 스트립을 젤 이미저에 20초 동안 노출시킵니다. 스트립의 회색 값을 측정하여 시스템 소프트웨어로 단백질 수준을 평가합니다. β-actin을 내부 제어로 사용합니다.

결과

마우스에서 규폐증의 잠재적 발병 기전은 제안된 방법을 사용하여 조사되었습니다. 실험군에 속한 쥐의 체중은 대조군에 비해 유의하게 감소했으며, 노출을 중단한 후 체중이 서서히 회복되는 것을 확인했다. 여기에 사용된 최적화된 용량으로 인해 이 실험에서 실리카에 노출된 마우스에서 사망률이 관찰되지 않았습니다. CSD에 대한 반복적인 비강 점적의 기술 로드맵은 (그림 1

토론

규폐증 마우스 모델은 규폐증의 발병 기전과 치료를 연구하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 반복적인 비강 노출을 통해 마우스에서 규폐증 모델을 제조하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 다양한 노출 시간에 의해 유도되는 규폐증의 병리학적 특성을 연구할 수 있습니다. 생쥐를 인공호흡기에 마취시키고 호흡수를 모니터링했다. 초기의 짧고 빠른 호흡 속도는 시간이 지남에 따?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL tube	Biosharp	BS-05-M
10% formalin neutral fixative	Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.	NA
Adobe Illustrator	Adobe	NA
Alcohol disinfectant	Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.	NA
CD68	Abcam	ab125212
Citrate antigen retrieval solution	biosharp life science	BL619A
DAB chromogenic kit	NJJCBio	W026-1-1
Dimethyl benzene	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
Enhanced BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology	P0009
Hematoxylin and Eosin (H&E)	Beyotime Biotechnology	C0105S
HRP substrate	Millipore Corporation	P90720
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	Sa00001-2
Iceacetic acid	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
ImageJ	NIH	NA
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22
Masson's Trichrome stain kit	Solarbio	G1340
Methanol	Macklin	NA
Microtubes	Millipore	AXYMCT150CS
NF-κB p65	Cell Signaling Technology	8242S
Oscillatory thermostatic metal bath	Abson	NA
Paraffin embedding machine	Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.	PBM-A
Paraffin Slicer	Jinhua Kratai Instruments Co.	NA
Phosphate buffer (PBS)	Biosharp	BL601A
Physiological saline	The First People's Hospital of Huainan City	NA
Pipettes	Eppendorf	NA
PMSF	Beyotime Biotechnological	ST505
Polarized light microscope	Olympus	BX51
Precision balance	Acculab	ALC-110.4
Prism7.0	GraphPad	Version 7.0
PVDF membranes	Millipore	3010040001
RIPA lysis buffer	Beyotime Biotechnology	P0013B
RODI IOT intelligent multifunctional water purification system	RSJ	RODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker	Scilogex	NA
SDS-PAGE gel preparation kit	Beyotime Biotechnology	P0012A
Silicon dioxid	Sigma	#BCBV6865
Sirius red staining	Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.	181012
Small animal anesthesia machine	Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.	ZL-04A
Universal Pipette Tips (0.1–10 µL)	KIRGEN	KG1011
Universal Pipette Tips (100–1000 µL)	KIRGEN	KG1313
Universal Pipette Tips (1–200 µL)	KIRGEN	KG1212
Vortex mixer	VWR	NA
ZEISS GeminiSEM 500	Zeiss Germany	SEM 500
β-actin	Bioss	bs-0061R