Un modello murino di silicosi stabilito dall'inalazione ripetuta di polvere di silice cristallina

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per stabilire un modello murino di silicosi attraverso l'esposizione ripetuta a sospensioni di silice tramite una flebo nasale. Questo modello può imitare in modo efficiente, conveniente e flessibile il processo patologico della silicosi umana con elevata ripetibilità ed economia.

Abstract

La silicosi può essere causata dall'esposizione alla polvere di silice cristallina (CSD) respiratoria in un ambiente industriale. La fisiopatologia, lo screening e il trattamento della silicosi nell'uomo sono stati ampiamente studiati utilizzando il modello murino di silicosi. Facendo inalare ripetutamente CSD nei polmoni, i topi possono imitare i sintomi clinici della silicosi umana. Questa metodologia è pratica ed efficiente in termini di tempo e resa e non provoca lesioni meccaniche alle prime vie respiratorie dovute all'intervento chirurgico. Inoltre, questo modello può imitare con successo il processo di trasformazione acuta/cronica della silicosi. Le principali procedure sono state le seguenti. La polvere CSD sterilizzata da 1-5 μm è stata completamente macinata, sospesa in soluzione fisiologica e dispersa in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 30 minuti. I topi sottoposti ad anestesia indotta da isoflurano sono passati da una respirazione rapida superficiale ad un'aspirazione profonda e lenta per circa 2 secondi. Il topo è stato posizionato nel palmo di una mano e la punta del pollice ha toccato delicatamente il bordo del labbro della mascella del topo per raddrizzare le vie aeree. Dopo ogni espirazione, i topi hanno respirato la sospensione di silice goccia a goccia attraverso una narice, completando il processo entro 4-8 secondi. Dopo che la respirazione dei topi si è stabilizzata, il loro petto è stato accarezzato e accarezzato per evitare che il CSD inalato venisse espulso con la tosse. I topi sono stati poi riportati nella gabbia. In conclusione, questo modello è in grado di quantificare la CSD lungo il tipico passaggio fisiologico di minuscole particelle nel polmone, dal tratto respiratorio superiore ai bronchioli terminali e agli alveoli. Può anche replicare l'esposizione ricorrente dei dipendenti a causa del lavoro. Il modello può essere eseguito da una sola persona e non necessita di attrezzature costose. Simula in modo conveniente ed efficace le caratteristiche patologiche della silicosi umana con un'elevata ripetibilità.

Introduzione

I lavoratori sono inevitabilmente esposti a polvere di silice cristallina irregolare (CSD), che può essere inalata ed è più tossica in numerosi contesti occupazionali, tra cui l'estrazione mineraria, la ceramica, il vetro, la lavorazione del quarzo e il calcestruzzo ^1,2. Una condizione cronica di inalazione di polvere nota come silicosi provoca fibrosi polmonare progressiva³. Secondo i dati epidemiologici, l'incidenza della silicosi è diminuita a livello globale negli ultimi decenni, ma negli ultimi anni è aumentata e colpisce i più giovani ^4,5,6. Il meccanismo alla base della silicosi rappresenta una sfida significativa per la ricerca scientifica a causa della sua insidiosa insorgenza e del prolungato periodo di incubazione. Non si sa ancora come si sviluppi la silicosi. Inoltre, nessun farmaco attuale può arrestare la progressione della silicosi e invertire la fibrosi polmonare.

Gli attuali modelli murini per la silicosi prevedono l'ingestione tracheale di una sospensione mista di CSD. Ad esempio, la somministrazione di CSD nei polmoni adottando il trauma della trachea cervicale dopo l'anestesia non è conforme all'esposizione umana ripetuta alla polvere colorante⁷. L'impatto dell'esposizione alla polvere ambientale sulle persone può essere studiato esponendole a CSD sotto forma di aerosol, che riflette in modo più accurato le concentrazioni ambientali di questa sostanza tossica⁸. Tuttavia, la CSD ambientale non può essere semplicemente inalata direttamente nei polmoni a causa della struttura fisiologica unica del naso del topo⁹. Inoltre, l'attrezzatura associata a questa tecnologia è costosa, il che ha indotto i ricercatori a rivalutare il modello¹⁰ della silicosi murina. Inalando la sospensione di CSD attraverso una flebo nasale cinque volte in 2 settimane, è stato possibile costruire un modello dinamico di silicosi. Questo modello è coerente e sicuro pur essendo facile da usare. È importante notare che questo studio consente l'inalazione ripetuta di CSD nei topi. Il modello di silicosi murina creato attraverso questa procedura dovrebbe essere più vantaggioso per i requisiti di ricerca.

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Protocollo

Tutte le procedure hanno seguito le linee guida della Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (pubblicazione NIH n. 8023, rivista nel 1978) e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la Scuola di Medicina dell'Università di Scienza e Tecnologia di Anhui.

1. Gestione e alimentazione dei topi

1. Assegnare 20 topi maschi C57BL/6 sani ai gruppi sperimentali o di veicoli in un rapporto 1:1. Acclimatare i topi al nuovo ambiente per 1 settimana.
2. Fornire un tempo di luce costante di 12 ore al giorno. Utilizzare un interruttore di controllo del tempo per una tempistica precisa.

2. Preparazione della sospensione del CSD

1. Almeno 1 giorno prima delle gocciolamenti nasali, macinare la silice in un mortaio di agata per 0,5 ore.
2. Osserva le dimensioni e la forma delle particelle di cristallo. Scatta fotografie rappresentative utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM).
   1. Utilizzare del nastro conduttivo per legare le particelle e preparare il campione per il SEM. Usa un asciugacapelli per soffiare via delicatamente le particelle di silicio che non sono saldamente legate.
   2. Evacuare la camera del campione, accendere l'alta pressione e acquisire l'immagine.
      NOTA: La distanza di lavoro (WD) tra l'obiettivo e il campione è di 5,9 mm, la tensione di accelerazione è di 2,0 kV e l'ingrandimento (Mag) è di 100.000x, utilizzando il rilevatore SignalA. Le particelle sono disperse con cristallizzazione irregolare e circa l'80% ha un diametro di 1-5 μm (Figura 1A).
3. Preparare una sospensione sterile di CSD da 20 mg/ml. Diluire il CSD con soluzione fisiologica sterile e miscelarlo con un agitatore a ultrasuoni (40 kHz, 80 W) a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti.
4. Mescolare e mescolare accuratamente la sospensione CSD su un miscelatore a vortice per 10 secondi prima di somministrare le flebo nasali.

3. Somministrazione di flebo nasali al topo

1. Anestetizzare rapidamente un topo con isoflurano al 2% alla dose di 3,6 ml/h in una macchina per anestesia (Figura 1B, pannello di sinistra).
   NOTA: L'anestesia deve essere eseguita in una cappa aspirante per evitare l'inalazione dell'anestetico da parte del tecnico. Assicurarsi che l'adeguata profondità dell'anestesia osservando il passaggio da una respirazione rapida e irregolare a uno stato lento e costante nei topi.
2. Gocciolare 50 μL del CSD per via nasale entro 4-8 s (Figura 1B, a destra).
   1. Per il gocciolamento nasale, posizionare la testa del topo sull'articolazione metacarpo-falangea del ricercatore con la punta del dito indice.
   2. Tenere il mouse in posizione prona, con quattro dita leggermente flesse e la punta del pollice che tocca leggermente il labbro inferiore del mouse per raddrizzare le vie aeree. Evitare di toccare la faringe per provocare il riflesso del vomito.
   3. Aspirare 50 μl di liquido utilizzando una pipetta da 200 μl. Far cadere il liquido nella cavità nasale del topo in tre o quattro dosi divise a seconda della frequenza respiratoria del topo. Ogni instillazione deve consistere in 15-20 μl di liquido. Somministrare le flebo una volta ogni 3 giorni, 5 volte entro 12 giorni. Trattare il mouse di controllo con una quantità uguale di soluzione fisiologica.
3. Massaggiare delicatamente la zona cardiaca del mouse 5x-10x per 5 s.
   1. Tieni il corpo del mouse con il palmo, pizzica la pelle sulla parte posteriore del collo con il pollice e l'indice e fissa gli arti posteriori del mouse con le altre dita. Quindi, premere delicatamente l'area del battito cardiaco del mouse con il dito indice dell'altra mano 5-10 volte in un periodo di 5 secondi.
4. Quando la respirazione del topo si è stabilizzata, mettilo in una gabbia di recupero con un termoforo e osserva fino a quando non si riprende dall'anestesia, quindi riporta il topo nella sua gabbia di casa. Sacrifica il topo a 31 giorni.

4. Raccolta dei tessuti polmonari e preparazione di una sezione di paraffina

1. Iniettare 0,18 mL di idrato di cloralio al 10% per via intraperitoneale, assicurandosi che i topi non rispondano alla stimolazione delle dita dei piedi o della coda (eseguita utilizzando la pinza dentata). Quindi, procedi al passaggio successivo.
2. Fissare gli arti del topo su una scheda di prova in schiuma e spruzzare con alcol al 75% per inumidire la pelliccia. Rimuovere la maggior parte delle costole toraciche sulla linea mediana della clavicola e aprire la cavità toracica dei topi per esporre il cuore e i polmoni.
3. Aprire immediatamente l'atrio destro con forbici chirurgiche oftalmiche e iniettare lentamente 20 ml di tampone fosfato (PBS) dalla punta del cuore al battito atriale sinistro con la massima ampiezza per consentire il flusso di sangue intero. Successivamente, rimuovere il lobo inferiore del polmone destro e conservarlo a -80 °C per l'analisi del western blotting.
4. Continuare a perfondere 10 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% nello stesso sito dopo l'iniezione di PBS. Raccogliere il polmone rimanente e conservare il campione in 30 mL di PFA al 4% per l'analisi patologica.
5. Dopo 72 ore di fissaggio, incorporare i campioni in paraffina.
   1. Disidratare i tessuti attraverso una serie graduata di diluizioni di etanolo (EtOH) in acqua deionizzata (60%, 70%, 80%, 90%, 100%) per 1 ora ciascuna a RT. Pulire il campione in due lavaggi di xilene per 1 ora ciascuno.
   2. Infiltrare i campioni con la cera di paraffina sciolta riscaldando a 50 °C per 2 ore. Ripeti questo processo in un altro cilindro. Raffreddare gli stampi in cera con i fazzoletti per 1 ora per indurire.
   3. Dopo che la cera si è indurita e il tessuto è stato incorporato, utilizzare una sezionatrice di paraffina per affettare il tessuto a 5 μm. Le precise fasi di sezionamento e montaggio della slitta sono state descritte in precedenza¹¹.
      NOTA: Una sufficiente perfusione tissutale è indicata dallo sviluppo di contrazioni muscolari e torsioni della coda a forma di "S" o flessione dopo aver ricevuto 10 ml di PFA al 4%.

5. Esecuzione della colorazione con ematossilina ed eosina (HE)

1. Riscaldare i tessuti inclusi in paraffina su una piastra calda (60 °C) per più di 4 ore per consentire l'adesione ai vetrini e una migliore deparaffinazione.
2. Decerare e idratare le sezioni di paraffina. Immergere i vetrini con i campioni in xilene 2 volte per 30 minuti ogni volta. Quindi, immergili in etanolo anidro, quindi alcol al 95%, 85%, 75% e acqua deionizzata rispettivamente per 5 minuti.
3. Eseguire la colorazione con ematossilina ed eosina. Colorare i tessuti in un secchio per la colorazione dell'ematossilina per 10 minuti. Sciacquarli con acqua corrente delicata per 5 min. Quindi, immergere i vetrini nel secchio per la colorazione dell'eosina per 10 secondi.
4. Disidratare i campioni in etanolo anidro al 75%, 85%, 95% ed etanolo anidro per 5 minuti ciascuno. Pulire le sezioni di tessuto immergendole nello xilene per 5 minuti. Sigillare la sezione con circa 60 μL di gocce di resina neutre. Posizionare la slitta del coperchio sulla sezione e abbassarla con cautela per evitare bolle d'aria.

6. Esecuzione della colorazione di Masson

1. Decerare e idratare i campioni di paraffina, come indicato al punto 5.2. Quindi, colorare i nuclei cellulari con ematossilina di Weigert al 50% per 10 minuti. Immergere il tessuto in liquefazione acida di etanolo per 10 secondi e sciacquare delicatamente i vetrini di tessuto con acqua corrente per l'azzurramento dei nuclei.
   NOTA: Preparare la soluzione colorante all'ematossilina di Weigert immediatamente prima dell'uso.
2. Colorare i campioni con gocce di soluzione colorante rossa Lichun (40 μL per ogni vetrino di tessuto) per 7 minuti e lavarli con una soluzione di lavoro acida debole (acido cloridrico al 30%) per 1 minuto per rimuovere il colorante rosso Lichun non legato.
3. Immergerli in alcol al 95% per 20 secondi e disidratarli 2 volte con etanolo anidro per 1-3 secondi ciascuno. Successivamente, pulire i tessuti con xilene e sigillarli con 60 μL di gocce di resina neutra, come indicato al punto 5.4.

7. Esecuzione della colorazione rosso Sirius

1. Decerare e idratare le sezioni di paraffina come indicato al punto 5.2.
2. Infiltrare le sezioni per 1 ora con la soluzione colorante rosso Sirius.
3. Colorare i nuclei cellulari dei campioni per 8-10 minuti con la soluzione colorante di ematossilina Mayer. Sciacquateli delicatamente con acqua corrente per 10 min. Quindi, disidratare e pulire i vetrini di tessuto. Sigillarli come indicato al punto 5.4.

8. Esecuzione dell'immunoistochimica

1. Decerare e idratare i campioni di paraffina come descritto al punto 5.2.
2. Infiltrare i campioni con una soluzione di recupero dell'antigene EDTA da 3 mg/mL di circa 30 mL. Far bollire per 20-30 min. Lavare i tessuti con acqua deionizzata, quindi incubarli in una soluzione tamponata con fosfato contenente lo 0,5% di Tween-20 (PBST) per 5 minuti.
3. Immergere i campioni per 15 minuti con una soluzione di perossido di idrogeno allo 0,3% per inattivare la perossidasi endogena nei campioni. Lavali 3 volte con PBST per 5 minuti ogni volta.
   NOTA: La soluzione di perossido di idrogeno allo 0,3% deve essere resa fresca in un ambiente a prova di luce.
4. Permeabilizzare la membrana dei campioni per 15 minuti con una soluzione di Triton-100 allo 0,3%. Quindi, bloccare con 30-40 μL di albumina sierica bovina al 5% (BSA) per 1 ora.
5. Rimuovere la soluzione bloccante. Aggiungere gli anticorpi primari diluiti NF-κB (diluizione 1:200) e CD68 (diluizione 1:1.000) e incubare i campioni per una notte a 2-8 °C in un vetrino da microscopio IHC wet box per prevenire l'evaporazione e la luce.
6. Il giorno successivo, trasferiscili a RT per 1 ora. Quindi, lavali con PBST 3 volte per 5 minuti ciascuno.
7. Incubare i campioni per 1 ora in anticorpi secondari marcati con perossidasi di rafano di coniglio anti-topo (rapporto di diluizione 1:500) a RT e lavarli con PBST 3x per 5 minuti ciascuno.
   NOTA: Sia gli anticorpi primari che quelli secondari sono stati diluiti con BSA al 5%.
8. Incubare i campioni con il substrato di 3,3'-diaminobenzidina (DAB) corrispondente all'anticorpo marcato con enzima per 5-20 minuti. Interrompere la reazione con acqua deionizzata quando viene raggiunta l'intensità ottimale della colorazione.
   NOTA: La soluzione DAB deve essere preparata al momento e protetta dalla luce. La reazione di sviluppo del colore deve essere osservata in tempo reale al microscopio per determinare quando interrompere la colorazione. I campioni positivi mostrano un'intensa colorazione, mentre i campioni negativi non sviluppano colore.
9. Controcolorare i campioni per 30 secondi con ematossilina Weigert. Quindi, sciacquare i fazzoletti sotto l'acqua corrente per 1 minuto. Quindi, disidratare, pulire e sigillare i vetrini di tessuto, come indicato al punto 5.4.

9. Esecuzione dell'analisi del western blotting

1. Lisare i tessuti polmonari per estrarre le proteine. Aggiungere 200 μL di soluzione di lavoro RIPA a 20 mg di tessuto polmonare.
2. Omogeneizzare il tessuto su ghiaccio per 5 minuti utilizzando un macinino elettrico portatile e incubare per 1 ora su ghiaccio agitando delicatamente. Successivamente, centrifugare l'omogenato a 4 °C per 15 minuti a 14.800 x g.
3. Raccogliere il surnatante e determinare la concentrazione proteica con il kit del saggio delle proteine BCA. Preparare la soluzione di conservazione delle proteine con RIPA a 6 μg/μL di proteina. Aggiungere 20 μL di tampone di carico 5x agli 80 μL del lisato proteico. Interrompere la struttura proteica secondaria riscaldando le provette della microcentrifuga contenenti proteine in un bagno metallico (100 °C) per 20 minuti.
4. Dopo il raffreddamento, aliquotare 100 μL della soluzione di conservazione delle proteine in ciascuna provetta e conservare i campioni in un frigorifero a -80 °C. Diluire la concentrazione proteica a 2-3 μg/μL con 1x tampone di carico prima dell'elettroforesi.
   NOTA: Il processo di estrazione delle proteine deve essere eseguito su ghiaccio. Per la soluzione di lavoro RIPA, aggiungere 1 μL di 100 mM di fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) a 99 μL di RIPA per inibire la degradazione delle proteine fosforilate.  Preparare 1x tampone di caricamento diluendo 5x tampone di caricamento con RIPA in un rapporto di 1:4.
5. Aggiungere 20 μg di campioni a ciascun pozzetto e far scorrere il gel. Per gel concentrati al 5%, utilizzare 80 V per 20 minuti per elettroforare le proteine dallo stesso punto di partenza. Per i gel isolati al 10%, far funzionare a 100 V per 1 ora per consentire di separare il più possibile le proteine di diversi pesi molecolari.
6. Pre-attivare la membrana in PVDF con metanolo per 20 s. Trasferire le proteine sulla membrana in PVDF utilizzando il metodo di trasferimento a umido con corrente di 400 mA per 1-2 ore.
   NOTA: Assicurarsi che il serbatoio di elettroforesi e il serbatoio di elettrotrasferimento siano orizzontali. Raffreddare l'intero serbatoio con ghiaccio, poiché il processo di trasferimento della membrana genera molto calore.
7. Lavare la membrana con la soluzione TBST per 5 minuti ogni volta, 5 volte. Quindi, bloccare con il 5% di BSA o il 5% di latte scremato per 1 ora. Diluire gli anticorpi primari NF-κB (1:1.000) e β-actina (1:1.000) con BSA al 5%. Immergere le strisce nella soluzione anticorpale e agitare delicatamente le strisce per una notte a 2-8 °C.
8. Lavare le strisce con PBST. Successivamente, diluire l'anticorpo secondario coniugato perossidasi di rafano (HRP) anti-coniglio (1:10.000) e incubarli nell'anticorpo secondario diluito per 1 ora a RT con agitazione delicata.
9. Preparare uno sviluppatore a chemiluminescenza potenziata (ECL), lasciarlo cadere sulla striscia e incubare per 3 minuti.
10. Esporre la striscia a un gel imager per 20 secondi. Misurare il valore di grigio della striscia per valutare il livello proteico tramite il software di sistema. Utilizzare la β-actina come controllo interno.

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Risultati

La potenziale patogenesi della silicosi nei topi è stata studiata utilizzando il metodo proposto. Abbiamo scoperto che il peso corporeo dei topi nel gruppo sperimentale è diminuito significativamente rispetto al gruppo di controllo e che il peso corporeo si è ripreso lentamente dopo la cessazione dell'esposizione. A causa della dose ottimizzata utilizzata qui, non è stata osservata mortalità nei topi esposti alla silice in questo esperimento. La tabella di marcia tecnica del gocciolamento nasale ripetuto al CSD è m...

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Discussione

I modelli murini di silicosi sono fondamentali per lo studio della patogenesi e del trattamento della silicosi. Questo protocollo descrive un metodo per preparare un modello di silicosi nei topi attraverso l'esposizione nasale ripetuta. Questa metodica permette di studiare le caratteristiche patologiche della silicosi indotta da diversi tempi di esposizione. I topi sono stati anestetizzati su un ventilatore e la loro frequenza respiratoria è stata monitorata. La frequenza respiratoria iniziale breve e veloce è gradualm...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL tube	Biosharp	BS-05-M
10% formalin neutral fixative	Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.	NA
Adobe Illustrator	Adobe	NA
Alcohol disinfectant	Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.	NA
CD68	Abcam	ab125212
Citrate antigen retrieval solution	biosharp life science	BL619A
DAB chromogenic kit	NJJCBio	W026-1-1
Dimethyl benzene	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
Enhanced BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology	P0009
Hematoxylin and Eosin (H&E)	Beyotime Biotechnology	C0105S
HRP substrate	Millipore Corporation	P90720
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	Sa00001-2
Iceacetic acid	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
ImageJ	NIH	NA
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22
Masson's Trichrome stain kit	Solarbio	G1340
Methanol	Macklin	NA
Microtubes	Millipore	AXYMCT150CS
NF-κB p65	Cell Signaling Technology	8242S
Oscillatory thermostatic metal bath	Abson	NA
Paraffin embedding machine	Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.	PBM-A
Paraffin Slicer	Jinhua Kratai Instruments Co.	NA
Phosphate buffer (PBS)	Biosharp	BL601A
Physiological saline	The First People's Hospital of Huainan City	NA
Pipettes	Eppendorf	NA
PMSF	Beyotime Biotechnological	ST505
Polarized light microscope	Olympus	BX51
Precision balance	Acculab	ALC-110.4
Prism7.0	GraphPad	Version 7.0
PVDF membranes	Millipore	3010040001
RIPA lysis buffer	Beyotime Biotechnology	P0013B
RODI IOT intelligent multifunctional water purification system	RSJ	RODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker	Scilogex	NA
SDS-PAGE gel preparation kit	Beyotime Biotechnology	P0012A
Silicon dioxid	Sigma	#BCBV6865
Sirius red staining	Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.	181012
Small animal anesthesia machine	Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.	ZL-04A
Universal Pipette Tips (0.1–10 µL)	KIRGEN	KG1011
Universal Pipette Tips (100–1000 µL)	KIRGEN	KG1313
Universal Pipette Tips (1–200 µL)	KIRGEN	KG1212
Vortex mixer	VWR	NA
ZEISS GeminiSEM 500	Zeiss Germany	SEM 500
β-actin	Bioss	bs-0061R