Un modèle murin de silicose établi par inhalation répétée de poussière de silice cristalline

Résumé

Ce protocole décrit une méthode permettant d’établir un modèle murin de silicose par exposition répétée à des suspensions de silice par écoulement nasal. Ce modèle peut imiter de manière efficace, pratique et flexible le processus pathologique de la silicose humaine avec une répétabilité et une économie élevées.

Résumé

La silicose peut être causée par l’exposition à des poussières de silice cristalline respiratoire (CSD) dans un environnement industriel. La physiopathologie, le dépistage et le traitement de la silicose chez l’homme ont tous été largement étudiés à l’aide du modèle de silicose chez la souris. En faisant inhaler à plusieurs reprises de la CSD dans les poumons des souris, les souris peuvent imiter les symptômes cliniques de la silicose humaine. Cette méthodologie est pratique et efficace en termes de temps et de rendement et ne provoque pas de lésions mécaniques des voies respiratoires supérieures dues à une intervention chirurgicale. De plus, ce modèle peut imiter avec succès le processus de transformation aiguë/chronique de la silicose. Les principales procédures ont été les suivantes. La poudre de CSD stérilisée de 1 à 5 μm a été entièrement broyée, suspendue dans une solution saline et dispersée dans un bain-marie à ultrasons pendant 30 minutes. Les souris sous anesthésie induite par l’isoflurane sont passées d’une respiration rapide et superficielle à une aspiration profonde et lente pendant environ 2 s. La souris a été placée dans la paume d’une main, et le bout du pouce a doucement touché le bord de la lèvre de la mâchoire de la souris pour redresser les voies respiratoires. Après chaque expiration, les souris ont respiré la suspension de silice goutte à goutte par une narine, complétant le processus en 4 à 8 secondes. Une fois que la respiration des souris s’est stabilisée, leur poitrine a été caressée et caressée pour empêcher le CSD inhalé d’être craché. Les souris ont ensuite été renvoyées dans la cage. En conclusion, ce modèle permet de quantifier la CSD le long du passage physiologique typique de minuscules particules dans le poumon, des voies respiratoires supérieures aux bronchioles terminales et aux alvéoles. Il peut également reproduire l’exposition récurrente des employés en raison du travail. Le modèle peut être réalisé par une seule personne et ne nécessite pas d’équipement coûteux. Il simule de manière pratique et efficace les caractéristiques de la maladie de la silicose humaine avec une grande répétabilité.

Introduction

Les travailleurs sont inévitablement exposés à des poussières de silice cristalline irrégulières, qui peuvent être inhalées et sont plus toxiques dans de nombreux contextes professionnels, notamment dans les mines, la poterie, le verre, le traitement du quartz et le béton ^1,2. Une affection chronique d’inhalation de poussière connue sous le nom de silicose provoque une fibrose pulmonaire progressive³. Selon les données épidémiologiques, l’incidence de la silicose a diminué à l’échelle mondiale au cours des dernières décennies, mais ces dernières années, elle a augmenté et touche les personnes plus jeunes ^4,5,6. Le mécanisme sous-jacent de la silicose représente un défi important pour la recherche scientifique en raison de son apparition insidieuse et de sa période d’incubation prolongée. On ne sait toujours pas comment la silicose se développe. De plus, aucun médicament actuel ne peut arrêter la progression de la silicose et inverser la fibrose pulmonaire.

Les modèles murins actuels pour la silicose impliquent l’ingestion trachéale d’une suspension mixte de CSD. Par exemple, l’administration de CSD dans les poumons en adoptant le traumatisme de la trachée cervicale après anesthésie n’est pas conforme à l’exposition humaine répétée à la poussière de colorant⁷. L’impact de l’exposition aux poussières ambiantes sur les individus peut être étudié en les exposant à des CSD sous forme d’aérosols, ce qui reflète plus précisément les concentrations environnementales de cette substance toxique⁸. Cependant, la CSD environnementale ne peut pas simplement être inhalée directement dans les poumons en raison de la structure physiologique unique du nez de la souris⁹. De plus, l’équipement associé à cette technologie est coûteux, ce qui a amené les chercheurs à réévaluer le modèle de silicose^{de souris 10}. En inhalant une suspension de CSD par goutte à goutte nasale cinq fois en 2 semaines, il a été possible de construire un modèle dynamique de la silicose. Ce modèle est cohérent et sûr tout en étant facile à utiliser. Il est important de noter que cette étude permet l’inhalation répétée de CSD chez la souris. On s’attend à ce que le modèle de silicose de souris créé par cette procédure soit plus avantageux pour les besoins de la recherche.

Protocole

Toutes les procédures ont suivi les directives du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (publication du NIH n° 8023, révisée en 1978) et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine de l’Université des sciences et technologies de l’Anhui.

1. Gérer et nourrir les souris

1. Assignez 20 souris mâles C57BL/6 en bonne santé aux groupes expérimentaux ou véhicules dans un rapport de 1 :1. Acclimater les souris au nouvel environnement pendant 1 semaine.
2. Fournir un temps d’éclairage constant de 12 h par jour. Utilisez un interrupteur de contrôle de l’heure pour un chronométrage précis.

2. Préparation de la suspension de la CDD

1. Au moins 1 jour avant l’écoulement nasal, broyez la silice dans un mortier d’agate pendant 0,5 h.
2. Observez la taille et la forme des particules de cristal. Prenez des photos représentatives à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB).
   1. Utilisez du ruban adhésif conducteur pour lier les particules afin de préparer l’échantillon pour le MEB. Utilisez un sèche-cheveux pour souffler doucement les particules de silicium qui ne sont pas fermement liées.
   2. Évacuez la chambre d’échantillonnage, allumez la haute pression et capturez l’image.
      REMARQUE : La distance de travail (WD) entre la lentille et l’échantillon est de 5,9 mm, la tension d’accélération est de 2,0 kV et le grossissement (Mag) est de 100 000x, à l’aide du détecteur SignalA. Les particules sont dispersées avec une cristallisation irrégulière et environ 80 % ont un diamètre de 1 à 5 μm (Figure 1A).
3. Préparez une suspension de CSD stérile à 20 mg/mL. Diluez la CSD à l’aide d’une solution saline stérile et mélangez-la avec un agitateur à ultrasons (40 kHz, 80 W) à température ambiante (RT) pendant 30 min.
4. Remuez et mélangez soigneusement la suspension CSD sur un mélangeur vortex pendant 10 s avant d’administrer les gouttes nasales.

3. Administrer des gouttes nasales à la souris

1. Anesthésier rapidement une souris avec de l’isoflurane à 2 % à une dose de 3,6 mL/h dans un appareil d’anesthésie (Figure 1B, panneau de gauche).
   REMARQUE : L’anesthésie doit être effectuée dans une hotte pour éviter l’inhalation de l’anesthésique par le technicien. Assurez-vous que la profondeur adéquate de l’anesthésie en observant le passage d’une respiration rapide et irrégulière à un état lent et stable chez les souris.
2. Verser 50 μL de CSD par voie nasale dans un délai de 4 à 8 s (figure 1B, à droite).
   1. Pour l’écoulement nasal, placez la tête de la souris sur l’articulation métacarpo-phalangienne du chercheur avec le bout de l’index.
   2. Gardez la souris en position couchée, avec quatre doigts légèrement fléchis et le bout du pouce touchant légèrement la lèvre inférieure de la souris pour redresser les voies respiratoires. Évitez de toucher le pharynx pour provoquer le réflexe nauséeux.
   3. Aspirer 50 μl de liquide à l’aide d’une pipette de 200 μl. Déposez le liquide dans la cavité nasale de la souris en trois à quatre doses fractionnées en fonction de la fréquence respiratoire de la souris. Chaque instillation doit être constituée de 15 à 20 μl de liquide. Administrez les gouttes une fois tous les 3 jours, 5 fois dans les 12 jours. Traitez la souris témoin avec une quantité égale de solution saline.
3. Massez doucement la zone du cœur de la souris 5 à 10 fois pendant 5 s.
   1. Tenez le corps de la souris avec la paume, pincez la peau de la nuque avec le pouce et l’index et fixez les membres postérieurs de la souris avec les autres doigts. Ensuite, appuyez doucement sur la zone de battement du cœur de la souris avec l’index de l’autre main 5 à 10 fois sur une période de 5 s.
4. Lorsque la respiration de la souris s’est stabilisée, placez-la dans une cage de récupération avec un coussin chauffant et observez-la jusqu’à ce qu’elle se remette de l’anesthésie, puis remettez-la dans sa cage d’origine. Sacrifiez la souris à 31 jours.

4. Collecte des tissus pulmonaires et préparation d’une section de paraffine

1. Injecter 0,18 mL d’hydrate de chloral à 10 % par voie intrapéritonéale, en veillant à ce que les souris ne répondent pas à la stimulation des orteils ou de la queue (effectuée à l’aide de la pince dentée). Ensuite, passez à l’étape suivante.
2. Fixez les membres de la souris sur une planche de test en mousse et vaporisez de l’alcool à 75% pour humidifier la fourrure. Retirez la plupart des côtes thoraciques sur la ligne médiane de la clavicule et ouvrez la cavité thoracique des souris pour exposer le cœur et les poumons.
3. Ouvrir immédiatement l’oreillette droite à l’aide de ciseaux chirurgicaux ophtalmiques et injecter lentement 20 mL de tampon phosphate (PBS) à partir de l’extrémité du cœur au niveau du battement auriculaire gauche avec la plus grande amplitude pour permettre au sang total de circuler. Ensuite, retirez le lobe inférieur du poumon droit et conservez-le à -80 °C pour l’analyse Western Blot.
4. Continuez à perfuser 10 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % au même endroit après l’injection de PBS. Prélever le poumon restant et conserver l’échantillon dans 30 mL de PFA à 4 % pour analyse pathologique.
5. Après 72 h de fixation, enfoncer les échantillons dans de la paraffine.
   1. Déshydrater les tissus par une série graduée de dilutions d’éthanol (EtOH) dans de l’eau déminéralisée (60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %) pendant 1 h chacune à RT. Nettoyer l’échantillon en deux lavages de xylène pendant 1 h chacun.
   2. Infiltrer les échantillons avec la cire de paraffine fondue en chauffant à 50 °C pendant 2 h. Répétez ce processus dans un autre cylindre. Refroidir les moules en cire avec des moules en papier pendant 1 h pour qu’ils durcissent.
   3. Une fois que la cire a durci et que le tissu a été incrusté, utilisez une machine à sectionner la paraffine pour trancher le tissu à 5 μm. Les étapes précises de la coupe et du montage de la glissière ont été décrites précédemment¹¹.
      REMARQUE : Une perfusion tissulaire suffisante est indiquée par le développement de contractions musculaires et d’une torsion de la queue en forme de « S » ou de flexion après avoir reçu 10 mL de PFA à 4 %.

5. Effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE)

1. Chauffer les tissus enrobés de paraffine sur une plaque chauffante (60 °C) pendant plus de 4 h pour permettre l’adhérence aux lames et une meilleure déparaffination.
2. Dépatisser et hydrater les sections de paraffine. Faites tremper les lames avec des échantillons de xylène 2x pendant 30 min à chaque fois. Ensuite, plongez-les dans de l’éthanol anhydre, puis de l’alcool à 95 %, 85 %, 75 % et de l’eau déminéralisée pendant 5 minutes, respectivement.
3. Effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Teindre les tissus dans un seau de coloration à l’hématoxyline pendant 10 min. Rincez-les à l’eau courante pendant 5 min. Ensuite, trempez les lames dans le seau de coloration à l’éosine pendant 10 s.
4. Déshydrater les échantillons dans de l’éthanol à 75 %, 85 %, 95 % et anhydre pendant 5 min chacun. Nettoyez les sections de tissu en les immergeant dans du xylène pendant 5 min. Sceller la section avec environ 60 μL de gouttes de résine neutre. Placez la glissière de couvercle sur la section et abaissez-la soigneusement pour éviter les bulles d’air.

6. Effectuer la coloration Masson

1. Dépatisser et hydrater les échantillons de paraffine, comme mentionné à l’étape 5.2. Ensuite, colorez les noyaux cellulaires avec 50% d’hématoxyline de Weigert pendant 10 min. Trempez le tissu dans une liquéfaction acide à l’éthanol pendant 10 s et rincez doucement les lames de tissu à l’eau courante pour le bleuissement des noyaux.
   REMARQUE : Préparez la solution de coloration à l’hématoxyline de Weigert immédiatement avant utilisation.
2. Colorer les échantillons avec des gouttes de solution colorante rouge Lichun (40 μL pour chaque lame de tissu) pendant 7 min et les laver avec une solution de travail acide faible (acide chlorhydrique à 30 %) pendant 1 min pour éliminer le colorant rouge Lichun non lié.
3. Trempez-les dans de l’alcool à 95 % pendant 20 s et déshydratez-les 2 fois avec de l’éthanol anhydre pendant 1 à 3 s chacun. Après cela, nettoyez les tissus avec du xylène et scellez-les avec 60 μL de gouttes de résine neutre, comme mentionné à l’étape 5.4.

7. Effectuer la coloration rouge Sirius

1. Dépatisser et hydrater les sections de paraffine comme mentionné à l’étape 5.2.
2. Infiltrer les sections pendant 1 h avec la solution de coloration rouge Sirius.
3. Colorer les noyaux cellulaires des échantillons pendant 8 à 10 minutes avec la solution de coloration à l’hématoxyline Mayer. Rincez-les délicatement à l’eau courante pendant 10 min. Ensuite, déshydratez et nettoyez les lames de tissu. Scellez-les comme indiqué à l’étape 5.4.

8. Effectuer l’immunohistochimie

1. Dépatisser et hydrater les échantillons de paraffine comme décrit à l’étape 5.2.
2. Infiltrer les échantillons avec une solution de prélèvement d’antigène EDTA à 3 mg/mL d’environ 30 mL. Faire bouillir pendant 20-30 min. Lavez les tissus avec de l’eau déminéralisée, puis incubez-les dans une solution tamponnée au phosphate contenant 0,5 % de Tween-20 (PBST) pendant 5 min.
3. Faire tremper les échantillons pendant 15 min avec une solution de peroxyde d’hydrogène à 0,3 % pour inactiver la peroxydase endogène dans les échantillons. Lavez-les 3 fois avec du PBST pendant 5 min à chaque fois.
   REMARQUE : La solution de peroxyde d’hydrogène à 0,3 % doit être fraîche dans un environnement à l’abri de la lumière.
4. Perméabiliser la membrane des échantillons pendant 15 min avec une solution de Triton-100 à 0,3 %. Ensuite, bloquez avec 30 à 40 μL d’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % pendant 1 h.
5. Retirez la solution bloquante. Ajouter les anticorps primaires dilués NF-κB (dilution 1 :200) et CD68 (dilution 1 :1 000) et incuber les échantillons pendant une nuit à 2-8 °C dans une boîte humide IHC pour lames de microscope afin d’éviter l’évaporation et la lumière.
6. Le lendemain, transférez-les à RT pendant 1 h. Ensuite, lavez-les avec PBST 3x pendant 5 min chacun.
7. Incuber les échantillons pendant 1 h dans des anticorps secondaires marqués à la peroxydase de raifort de lapin (rapport de dilution de 1 :500) à RT et les laver avec PBST 3x pendant 5 min chacun.
   REMARQUE : Les anticorps primaires et secondaires ont été dilués avec 5 % de BSA.
8. Incuber les échantillons avec le substrat 3,3'-diaminobenzidine (DAB) correspondant à l’anticorps marqué par l’enzyme pendant 5 à 20 minutes. Arrêtez la réaction avec de l’eau déminéralisée lorsque l’intensité optimale de coloration est atteinte.
   REMARQUE : La solution DAB doit être préparée fraîche et à l’abri de la lumière. La réaction de développement de la couleur doit être observée en temps réel au microscope pour déterminer quand arrêter la coloration. Les spécimens positifs présentent une coloration intense, tandis que les spécimens négatifs ne développent pas de couleur.
9. Contre-colorer les échantillons pendant 30 s avec de l’hématoxyline de Weigert. Ensuite, rincez les mouchoirs sous l’eau courante pendant 1 min. Ensuite, déshydratez, nettoyez et scellez les lames de tissu, comme mentionné à l’étape 5.4.

9. Réalisation d’une analyse par transfert Western

1. Lyser les tissus pulmonaires pour en extraire les protéines. Ajouter 200 μL de solution de travail RIPA à 20 mg de tissu pulmonaire.
2. Homogénéiser le tissu sur de la glace pendant 5 min à l’aide d’un broyeur électrique portatif et incuber pendant 1 h sur de la glace en agitant doucement. Ensuite, centrifugez l’homogénat à 4 °C pendant 15 min à 14 800 x g.
3. Prélevez le surnageant et déterminez la concentration en protéines à l’aide du kit de dosage des protéines BCA. Préparez la solution de stockage des protéines avec RIPA à 6 μg/μL de protéines. Ajouter 20 μL de tampon de charge 5x aux 80 μL de lysat de protéines. Perturber la structure de la protéine secondaire en chauffant les tubes de microcentrifugation contenant des protéines dans un bain métallique (100 °C) pendant 20 min.
4. Après refroidissement, aliquotez 100 μL de la solution de stockage des protéines dans chaque tube et conservez les échantillons dans un réfrigérateur à -80 °C. Diluer la concentration de protéines à 2–3 μg/μL avec 1x tampon de charge avant l’électrophorèse.
   REMARQUE : Le processus d’extraction des protéines doit être effectué sur de la glace. Pour la solution de fonctionnement RIPA, ajouter 1 μL de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) à 100 mM à 99 μL de RIPA pour inhiber la dégradation des protéines phosphorylées.  Préparez 1x tampon de chargement en diluant 5x tampon de chargement avec RIPA dans un rapport de 1 :4.
5. Ajoutez 20 μg d’échantillons dans chaque puits et faites couler le gel. Pour les gels concentrés à 5 %, utilisez 80 V pendant 20 min pour que les protéines soient électrophorisées à partir du même point de départ. Pour les gels isolés à 10 %, faire fonctionner à 100 V pendant 1 h pour permettre de séparer au maximum les protéines de différents poids moléculaires.
6. Pré-activer la membrane PVDF avec du méthanol pendant 20 s. Transférez les protéines sur la membrane PVDF en utilisant la méthode de transfert humide avec un courant de 400 mA pendant 1 à 2 h.
   REMARQUE : Assurez-vous que le réservoir d’électrophorèse et le réservoir d’électrotransfert sont horizontaux. Refroidissez tout le réservoir avec de la glace, car le processus de transfert de membrane génère beaucoup de chaleur.
7. Lavez la membrane avec la solution TBST pendant 5 minutes à chaque fois, 5 fois. Ensuite, bloquez avec du lait écrémé 5 % BSA ou 5 % pendant 1 h. Diluer les anticorps primaires NF-κB (1 :1 000) et β-actine (1 :1 000) avec 5 % de BSA. Plongez les bandelettes dans la solution d’anticorps et agitez-les doucement pendant la nuit à une température comprise entre 2 et 8 °C.
8. Lavez les bandelettes avec du PBST. Ensuite, diluez l’anticorps secondaire anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) de chèvre (1 :10 000) et incubez-les dans l’anticorps secondaire dilué pendant 1 h à RT en agitant doucement.
9. Préparez un révélateur de chimiluminescence améliorée (ECL), déposez-le sur la bandelette et incubez pendant 3 minutes.
10. Exposez la bandelette à un imageur de gel pendant 20 s. Mesurez la valeur de gris de la bandelette pour évaluer le niveau de protéines à l’aide du logiciel système. Utiliser β-actine comme contrôle interne.

Résultats

La pathogenèse potentielle de la silicose chez la souris a été étudiée à l’aide de la méthode proposée. Nous avons constaté que le poids corporel des souris du groupe expérimental diminuait significativement par rapport au groupe témoin et que le poids corporel se rétablissait lentement après l’arrêt de l’exposition. En raison de la dose optimisée utilisée ici, aucune mortalité n’a été observée chez les souris exposées à la silice dans cette expérience. La feuille de route technique de l’...

Discussion

Les modèles murins de silicose sont cruciaux pour l’étude de la pathogenèse et du traitement de la silicose. Ce protocole décrit une méthode de préparation d’un modèle de silicose chez la souris par exposition nasale répétée. Cette méthode permet d’étudier les caractéristiques pathologiques de la silicose induite par différents temps d’exposition. Les souris ont été anesthésiées sous respirateur et leur fréquence respiratoire a été surveillée. Le rythme respiratoire initial court et rapide a...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL tube	Biosharp	BS-05-M
10% formalin neutral fixative	Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.	NA
Adobe Illustrator	Adobe	NA
Alcohol disinfectant	Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.	NA
CD68	Abcam	ab125212
Citrate antigen retrieval solution	biosharp life science	BL619A
DAB chromogenic kit	NJJCBio	W026-1-1
Dimethyl benzene	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
Enhanced BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology	P0009
Hematoxylin and Eosin (H&E)	Beyotime Biotechnology	C0105S
HRP substrate	Millipore Corporation	P90720
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	Sa00001-2
Iceacetic acid	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
ImageJ	NIH	NA
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22
Masson's Trichrome stain kit	Solarbio	G1340
Methanol	Macklin	NA
Microtubes	Millipore	AXYMCT150CS
NF-κB p65	Cell Signaling Technology	8242S
Oscillatory thermostatic metal bath	Abson	NA
Paraffin embedding machine	Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.	PBM-A
Paraffin Slicer	Jinhua Kratai Instruments Co.	NA
Phosphate buffer (PBS)	Biosharp	BL601A
Physiological saline	The First People's Hospital of Huainan City	NA
Pipettes	Eppendorf	NA
PMSF	Beyotime Biotechnological	ST505
Polarized light microscope	Olympus	BX51
Precision balance	Acculab	ALC-110.4
Prism7.0	GraphPad	Version 7.0
PVDF membranes	Millipore	3010040001
RIPA lysis buffer	Beyotime Biotechnology	P0013B
RODI IOT intelligent multifunctional water purification system	RSJ	RODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker	Scilogex	NA
SDS-PAGE gel preparation kit	Beyotime Biotechnology	P0012A
Silicon dioxid	Sigma	#BCBV6865
Sirius red staining	Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.	181012
Small animal anesthesia machine	Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.	ZL-04A
Universal Pipette Tips (0.1–10 µL)	KIRGEN	KG1011
Universal Pipette Tips (100–1000 µL)	KIRGEN	KG1313
Universal Pipette Tips (1–200 µL)	KIRGEN	KG1212
Vortex mixer	VWR	NA
ZEISS GeminiSEM 500	Zeiss Germany	SEM 500
β-actin	Bioss	bs-0061R