Modelo de silicose em camundongos estabelecido por inalação repetida de pó de sílica cristalina

Resumo

Este protocolo descreve um método para estabelecer um modelo de silicose em camundongos através da exposição repetida a suspensões de sílica via gotejamento nasal. Este modelo pode eficiente, convenientemente e flexivelmente mimetizar o processo patológico da silicose humana com alta repetibilidade e economia.

Resumo

A silicose pode ser causada pela exposição à poeira de sílica cristalina respiratória (MSF) em ambiente industrial. A fisiopatologia, o rastreamento e o tratamento da silicose em humanos têm sido extensivamente estudados usando o modelo de silicose em camundongos. Ao fazer repetidamente camundongos inalarem refrigerante em seus pulmões, os camundongos podem imitar os sintomas clínicos da silicose humana. Essa metodologia é prática e eficiente em termos de tempo e débito e não causa lesão mecânica no trato respiratório superior devido à cirurgia. Além disso, esse modelo pode mimetizar com sucesso o processo de transformação aguda/crônica da silicose. Os principais procedimentos foram os seguintes. O pó CSD esterilizado de 1-5 μm foi totalmente triturado, suspenso em solução salina e disperso em banho-maria ultrassônico por 30 min. Camundongos sob anestesia induzida por isoflurano mudaram de respiração rápida superficial para aspiração profunda e lenta por aproximadamente 2 s. O rato foi colocado na palma de uma mão, e a ponta do polegar tocou suavemente a borda labial da mandíbula do rato para endireitar as vias aéreas. Após cada expiração, os camundongos respiraram a suspensão de sílica gota a gota através de uma narina, completando o processo dentro de 4-8 s. Depois que a respiração dos camundongos se estabilizou, seu peito foi acariciado e acariciado para evitar que o DSC inalado fosse tossido. Os camundongos foram então devolvidos à gaiola. Em conclusão, esse modelo pode quantificar DSC ao longo da passagem fisiológica típica de partículas minúsculas para o pulmão, do trato respiratório superior aos bronquíolos terminais e alvéolos. Também pode replicar a exposição recorrente dos funcionários devido ao trabalho. O modelo pode ser realizado por uma pessoa e não precisa de equipamentos caros. Simula de forma conveniente e eficaz as características da doença da silicose humana com alta repetibilidade.

Introdução

Os trabalhadores estão inevitavelmente expostos à poeira irregular de sílica cristalina (MSF), que pode ser inalada e é mais tóxica em vários contextos ocupacionais, incluindo mineração, cerâmica, vidro, processamento de quartzo e concreto ^1,2. Uma condição crônica de inalação de poeira conhecida como silicose causa fibrose pulmonar progressiva³. De acordo com dados epidemiológicos, a incidência da silicose vem diminuindo globalmente nas últimas décadas, mas, nos últimos anos, vem aumentando e acometendo pessoas mais^jovens4,5,6. O mecanismo subjacente da silicose representa um desafio significativo para a pesquisa científica devido ao seu início insidioso e período prolongado de incubação. Ainda não se sabe como a silicose se desenvolve. Além disso, nenhuma medicação atual pode interromper a progressão da silicose e reverter a fibrose pulmonar.

Os modelos atuais de silicose em camundongos envolvem a ingestão traqueal de uma suspensão mista de DSC. Por exemplo, a administração de DSF nos pulmões adotando o trauma da traqueia cervical após a anestesia não atende à exposição humana repetida à poeira do corante⁷. O impacto da exposição à poeira ambiente sobre os indivíduos pode ser estudado expondo-os ao MSC na forma de aerossóis, o que reflete com maior precisão as concentrações ambientais dessa substância tóxica⁸. No entanto, o DSC ambiental não pode ser simplesmente inalado diretamente para os pulmões devido à estrutura fisiológica única do nariz de camundongo⁹. Além disso, o equipamento associado a essa tecnologia é caro, o que fez com que os pesquisadores reavaliassem o modelo¹⁰ da silicose em camundongos. Inalando a suspensão do DSC por gotejamento nasal cinco vezes em 2 semanas, foi possível construir um modelo dinâmico de silicose. Este modelo é consistente e seguro, ao mesmo tempo que é fácil de usar. É importante notar que este estudo permite a inalação repetida de DSC em camundongos. Espera-se que o modelo de silicose em camundongos criado através desse procedimento seja mais benéfico para as necessidades de pesquisa.

Protocolo

Todos os procedimentos seguiram as diretrizes do National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publication No. 8023, revisado em 1978) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui.

1. Manejo e alimentação de camundongos

1. Atribuir 20 camundongos machos C57BL/6 saudáveis aos grupos experimental ou veículo em uma proporção de 1:1. Aclimatar os ratos ao novo ambiente por 1 semana.
2. Forneça um tempo de luz constante de 12 h por dia. Use um interruptor de controle de tempo para um tempo preciso.

2. Preparação da suspensão da CDT

1. Pelo menos 1 dia antes de gotejar nasalmente, triture a sílica em uma argamassa de ágata por 0,5 h.
2. Observe o tamanho e a forma das partículas de cristal. Tire fotografias representativas usando microscopia eletrônica de varredura (MEV).
   1. Use uma fita condutora para prender as partículas para preparar a amostra para MEV. Use um secador de cabelo para soprar suavemente as partículas de silício que não estão firmemente ligadas.
   2. Evacue a câmara de amostra, ligue a alta pressão e capture a imagem.
      NOTA: A distância de trabalho (WD) entre a lente e a amostra é de 5,9 mm, a tensão de aceleração é de 2,0 kV e a ampliação (Mag) é de 100.000x, usando o detector SignalA. As partículas são dispersas com cristalização irregular, e aproximadamente 80% têm um diâmetro de 1-5 μm (Figura 1A).
3. Fazer uma suspensão de DSC estéril de 20 mg/mL. Diluir o refrigerante com soro fisiológico estéril e misturá-lo com um agitador ultrassônico (40 kHz, 80 W) à temperatura ambiente (TR) por 30 min.
4. Mexa e misture bem a suspensão de refrigerante num misturador de vórtices durante 10 s antes de administrar os gotejamentos nasais.

3. Administração de gotejamentos nasais em camundongos

1. Anestesiar rapidamente um camundongo com isoflurano a 2% na dose de 3,6 mL/h em um aparelho de anestesia (Figura 1B, painel esquerdo).
   OBS: A anestesia deve ser realizada em exaustor para evitar a inalação do anestésico pelo técnico. Certifique-se da profundidade adequada da anestesia, observando a mudança de respiração rápida e irregular para um estado lento e estável nos camundongos.
2. Gotejamento de 50 μL do DSC por via nasal dentro de 4-8 s (Figura 1B, direita).
   1. Para o gotejamento nasal, coloque a cabeça do camundongo na articulação metacarpofalangeana do pesquisador com a ponta do dedo indicador.
   2. Mantenha o mouse em decúbito ventral, com quatro dedos levemente flexionados e a ponta do polegar tocando levemente o lábio inferior do mouse para endireitar as vias aéreas. Evite tocar a faringe para provocar o reflexo de vômito.
   3. Aspirar 50 μl de líquido utilizando uma pipeta de 200 μl. Solte o líquido na cavidade nasal do rato em três a quatro doses divididas, dependendo da frequência respiratória do rato. Cada instilação deve consistir de 15 a 20 μl de líquido. Administrar os gotejamentos uma vez a cada 3 dias, 5x dentro de 12 dias. Trate o rato de controlo com uma quantidade igual de soro fisiológico.
3. Massageie suavemente a área cardíaca do mouse 5x-10x por 5 s.
   1. Segure o corpo do mouse com a palma da mão, aperte a pele na parte de trás do pescoço com o polegar e o indicador e fixe os membros posteriores do mouse com os outros dedos. Em seguida, pressione suavemente a área de batimento cardíaco do mouse com o dedo indicador da outra mão 5-10 vezes em um período de 5 s.
4. Quando a respiração do rato tiver estabilizado, coloque-o numa gaiola de recuperação com uma almofada de aquecimento e observe até que se recupere da anestesia e, em seguida, devolva o rato à sua gaiola de casa. Sacrifique o rato aos 31 dias.

4. Coleta dos tecidos pulmonares e preparação de um corte de parafina

1. Injetar 0,18 mL de hidrato de cloral a 10% por via intraperitoneal, garantindo que os camundongos não respondam à estimulação dos dedos dos pés ou da cauda (realizada com a pinça dentada). Em seguida, prossiga para a próxima etapa.
2. Fixe os membros do rato em uma placa de teste de espuma e borrife com álcool 75% para umedecer o pelo. Remova a maioria das costelas torácicas na linha média da clavícula e abra a cavidade torácica dos ratos para expor o coração e os pulmões.
3. Cortar imediatamente o átrio direito com tesoura cirúrgica oftálmica e injetar lentamente 20 mL de tampão fosfato (PBS) da ponta do coração no batimento atrial esquerdo com a maior amplitude para permitir que todo o sangue flua. Em seguida, remova o lobo inferior do pulmão direito e armazene-o a -80 °C para análise de western blotting.
4. Manter a perfusão de 10 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% no mesmo local após a injeção de PBS. Coletar o pulmão remanescente e preservar a amostra em 30 mL de PFA a 4% para análise anatomopatológica.
5. Após 72 h de fixação, embutir os espécimes em parafina.
   1. Desidratar os tecidos através de uma série graduada de diluições de etanol (EtOH) em água deionizada (60%, 70%, 80%, 90%, 100%) por 1 h cada em TR. Limpar a amostra em duas lavagens de xileno por 1 h cada.
   2. Infiltrar-se nas amostras com a cera de parafina fundida aquecendo a 50 °C durante 2 h. Repita esse processo em outro cilindro. Resfriar os moldes de cera com lenços por 1 h para endurecer.
   3. Depois que a cera endurecer e o tecido tiver sido incorporado, use uma máquina de corte de parafina para cortar o tecido a 5 μm. Os passos precisos de seccionamento e montagem das lâminas foram descritos^{previamente11}.
      NOTA: A perfusão tecidual suficiente é indicada pelo desenvolvimento de contração muscular e torção da cauda em forma de "S" ou flexão após receber 10 mL de PFA a 4%.

5. Realização da coloração de hematoxilina e eosina (HE)

1. Aqueça os tecidos embebidos em parafina em uma placa quente (60 °C) por mais de 4 h para permitir a adesão às lâminas e melhorar a desparafinação.
2. Descerpar e hidratar seções de parafina. Mergulhe as lâminas com amostras em xileno 2x por 30 min de cada vez. Em seguida, mergulhe-os em etanol anidro, depois álcool 95%, 85%, 75% e água deionizada por 5 min, respectivamente.
3. Realizar coloração de hematoxilina e eosina. Manchar os tecidos em um balde de coloração de hematoxilina por 10 min. Enxágue com água corrente suave por 5 min. Em seguida, mergulhe as lâminas no balde de coloração de eosina por 10 s.
4. Desidratar as amostras em etanol anidro 75%, 85%, 95% e anidro por 5 min cada. Limpe os cortes de tecido mergulhando-os em xileno por 5 min. Sele a seção com aproximadamente 60 μL de gotas de resina neutra. Coloque a tampa deslize sobre a seção e abaixe-a cuidadosamente para evitar bolhas de ar.

6. Realização da coloração de Masson

1. Desencenar e hidratar as amostras de parafina, conforme mencionado na etapa 5.2. Em seguida, corar os núcleos celulares com hematoxilina de Weigert a 50% por 10 min. Mergulhe o tecido em liquefação ácida de etanol por 10 s e lave suavemente as lâminas de tecido com água corrente para o rubor dos núcleos.
   NOTA: Preparar a solução corante de hematoxilina de Weigert imediatamente antes do uso.
2. Manchar as amostras com gotas de solução corante vermelha de Lichun (40 μL para cada lâmina de tecido) por 7 min e lavá-las com uma solução de trabalho de ácido fraco (ácido clorídrico a 30%) por 1 min para remover o corante vermelho Lichun não ligado.
3. Mergulhá-los em álcool 95% por 20 s e desidratá-los 2x com etanol anidro por 1-3 s cada. Em seguida, limpar os tecidos com xileno e selá-los com 60 μL de gotas de resina neutra, conforme mencionado no passo 5.4.

7. Realização da coloração vermelha do Sirius

1. Descerpar e hidratar as secções de parafina, tal como referido no passo 5.2.
2. Infiltrar-se nos cortes por 1 h com solução corante Sirius red.
3. Manchar os núcleos celulares das amostras por 8-10 min com solução de coloração de hematoxilina Mayer. Enxágue suavemente com água corrente por 10 min. Em seguida, desidrate e limpe as lâminas de tecido. Selá-los conforme mencionado no passo 5.4.

8. Realização de imunohistoquímica

1. Descerpar e hidratar as amostras de parafina, tal como descrito no passo 5.2.
2. Infiltrar-se nos espécimes com uma solução de recuperação de antígeno EDTA de 3 mg/mL de cerca de 30 mL. Ferva por 20-30 min. Lave os tecidos com água deionizada e, em seguida, incube-os em solução tamponada com fosfato contendo Tween-20 a 0,5% (PBST) por 5 min.
3. Deixar as amostras de molho por 15 min com solução de peróxido de hidrogênio a 0,3% para inativar a peroxidase endógena nos espécimes. Lave-os 3x com PBST por 5 min de cada vez.
   NOTA: A solução de peróxido de hidrogénio a 0,3% deve ser fresca num ambiente à prova de luz.
4. Permeabilizar a membrana dos espécimes por 15 min com solução de Triton-100 a 0,3%. Em seguida, bloquear com 30-40 μL de albumina de soro bovino (BSA) a 5% por 1 h.
5. Remova a solução de bloqueio. Adicionar anticorpos primários diluídos NF-κB (diluição 1:200) e CD68 (diluição 1:1.000) e incubar os espécimes durante a noite a 2-8 °C em uma caixa úmida IHC de lâmina de microscópio para evitar evaporação e luz.
6. No dia seguinte, transfira-os para RT por 1 h. Em seguida, lave-os com PBST 3x por 5 min cada.
7. Incubar as amostras durante 1 h em anticorpos secundários de peroxidase de rábano de coelho anti-rato (razão de diluição 1:500) em RT e lavá-las com PBST 3x durante 5 minutos cada.
   NOTA: Ambos os anticorpos primários e secundários foram diluídos com BSA a 5%.
8. Incubar as amostras com o substrato 3,3'-Diaminobenzidina (DAB) correspondente ao anticorpo marcado com enzima por 5-20 min. Pare a reação com água deionizada quando a intensidade de coloração ideal for atingida.
   NOTA: A solução DAB precisa ser preparada na hora e protegida da luz. A reação de desenvolvimento de cor deve ser observada em tempo real sob o microscópio para determinar quando parar de colorir. Espécimes positivos exibem coloração intensa, enquanto espécimes negativos não desenvolvem cor.
9. Contra-corar as amostras por 30 s com hematoxilina de Weigert. Em seguida, enxágue os tecidos em água corrente por 1 min. Em seguida, desidrate, limpe e sele as lâminas de tecido, conforme mencionado no passo 5.4.

9. Realização de análise de western blotting

1. Lisar os tecidos pulmonares para extrair proteínas. Adicionar 200 μL de solução de trabalho RIPA a 20 mg de tecido pulmonar.
2. Homogeneizar o tecido no gelo por 5 min usando um moedor elétrico portátil e incubar por 1 h no gelo com agitação suave. Em seguida, centrifugar o homogeneizado a 4 °C por 15 min a 14.800 x g.
3. Coletar o sobrenadante e determinar a concentração de proteína com o kit de ensaio de proteína BCA. Fazer a solução de armazenamento de proteína com RIPA a 6 μg/μL de proteína. Adicionar 20 μL de tampão de carga 5x aos 80 μL do lisado proteico. Interromper a estrutura da proteína secundária aquecendo os tubos de microcentrífuga contendo proteínas em um banho de metal (100 °C) por 20 min.
4. Após arrefecimento, aliquotar 100 μL da solução de armazenamento de proteínas em cada tubo e armazenar as amostras num frigorífico de -80 °C. Diluir a concentração de proteína para 2–3 μg/μL com 1x tampão de carga antes da eletroforese.
   NOTA: O processo de extração de proteínas deve ser realizado em gelo. Para a solução de trabalho RIPA, adicionar 1 μL de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) a 100 mM a 99 μL de RIPA para inibir a degradação de proteínas fosforiladas.  Prepare 1x buffer de carregamento diluindo 5x buffer de carregamento com RIPA na proporção de 1:4.
5. Adicione 20 μg de amostras a cada poço e passe o gel. Para géis concentrados a 5%, use 80 V por 20 min para que as proteínas sejam eletroforadas a partir do mesmo ponto de partida. Para géis isolados a 10%, correr a 100 V durante 1 h para permitir que as proteínas de diferentes pesos moleculares sejam separadas tanto quanto possível.
6. Pré-ativar a membrana de PVDF com metanol por 20 s. Transferir as proteínas para a membrana de PVDF usando o método de transferência úmida com corrente de 400 mA por 1-2 h.
   NOTA: Certifique-se de que o tanque de eletroforese e o tanque de eletrotransferência estejam horizontais. Resfrie todo o tanque com gelo, pois o processo de transferência de membrana gera muito calor.
7. Lave a membrana com solução de TBST durante 5 min de cada vez, 5x. Em seguida, bloqueie com 5% de BSA ou 5% de leite desnatado por 1 h. Diluir os anticorpos primários NF-κB (1:1.000) e β-actina (1:1.000) com BSA a 5%. Submergir as tiras na solução de anticorpos e agitá-las suavemente durante a noite a 2-8 °C.
8. Lave as tiras com PBST. Em seguida, diluir o anticorpo secundário de cabra anticoelho conjugado à horseradish peroxidase (HRP) (1:10.000) e incubá-los no anticorpo secundário diluído por 1 h na RT com agitação suave.
9. Prepare um revelador de quimioluminescência aprimorada (ECL), solte-o na tira e incube por 3 min.
10. Exponha a tira a um imageador de gel por 20 s. Meça o valor de cinza da tira para avaliar o nível de proteína pelo software do sistema. Use β-actina como controle interno.

Resultados

A patogênese potencial da silicose em camundongos foi investigada usando o método proposto. Verificamos que o peso corporal dos camundongos do grupo experimental diminuiu significativamente em relação ao grupo controle e que o peso corporal se recuperou lentamente após a cessação da exposição. Devido à dose otimizada usada aqui, nenhuma mortalidade foi observada em camundongos expostos à sílica neste experimento. O roteiro técnico de gotejamento nasal repetido para DSC é mostrado em (Fi...

Discussão

Modelos de silicose em camundongos são cruciais para o estudo da patogênese e tratamento da silicose. Este protocolo descreve um método para preparar um modelo de silicose em camundongos através de exposição nasal repetida. Este método permite o estudo das características patológicas da silicose induzida por diferentes tempos de exposição. Os camundongos foram anestesiados em um ventilador e sua frequência respiratória foi monitorada. A frequência respiratória inicial curta e rápida diminuiu gradualmente ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL tube	Biosharp	BS-05-M
10% formalin neutral fixative	Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.	NA
Adobe Illustrator	Adobe	NA
Alcohol disinfectant	Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.	NA
CD68	Abcam	ab125212
Citrate antigen retrieval solution	biosharp life science	BL619A
DAB chromogenic kit	NJJCBio	W026-1-1
Dimethyl benzene	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
Enhanced BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology	P0009
Hematoxylin and Eosin (H&E)	Beyotime Biotechnology	C0105S
HRP substrate	Millipore Corporation	P90720
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	Sa00001-2
Iceacetic acid	West Asia Chemical Technology (Shandong) Co	NA
ImageJ	NIH	NA
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22
Masson's Trichrome stain kit	Solarbio	G1340
Methanol	Macklin	NA
Microtubes	Millipore	AXYMCT150CS
NF-κB p65	Cell Signaling Technology	8242S
Oscillatory thermostatic metal bath	Abson	NA
Paraffin embedding machine	Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.	PBM-A
Paraffin Slicer	Jinhua Kratai Instruments Co.	NA
Phosphate buffer (PBS)	Biosharp	BL601A
Physiological saline	The First People's Hospital of Huainan City	NA
Pipettes	Eppendorf	NA
PMSF	Beyotime Biotechnological	ST505
Polarized light microscope	Olympus	BX51
Precision balance	Acculab	ALC-110.4
Prism7.0	GraphPad	Version 7.0
PVDF membranes	Millipore	3010040001
RIPA lysis buffer	Beyotime Biotechnology	P0013B
RODI IOT intelligent multifunctional water purification system	RSJ	RODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker	Scilogex	NA
SDS-PAGE gel preparation kit	Beyotime Biotechnology	P0012A
Silicon dioxid	Sigma	#BCBV6865
Sirius red staining	Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.	181012
Small animal anesthesia machine	Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.	ZL-04A
Universal Pipette Tips (0.1–10 µL)	KIRGEN	KG1011
Universal Pipette Tips (100–1000 µL)	KIRGEN	KG1313
Universal Pipette Tips (1–200 µL)	KIRGEN	KG1212
Vortex mixer	VWR	NA
ZEISS GeminiSEM 500	Zeiss Germany	SEM 500
β-actin	Bioss	bs-0061R