Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لإجراء مشبك رقعة خلية كاملة على شرائح الدماغ التي تحتوي على خلايا كيسبيبتين العصبية ، المغير الأساسي لخلايا الهرمون المطلق للغدد التناسلية (GnRH). من خلال إضافة المعرفة حول نشاط الخلايا العصبية kisspeptin ، كانت هذه الأداة الكهربية بمثابة الأساس لتطورات كبيرة في مجال الغدد الصماء العصبية على مدى السنوات ال 20 الماضية.

Abstract

Kisspeptins ضرورية لنضوج محور الغدة النخامية والغدد التناسلية (HPG) والخصوبة. الخلايا العصبية تحت المهاد kisspeptin الموجودة في النواة الأمامية البطنية المحيطة بالبطين والنواة حول البطين المنقارية ، وكذلك النواة المقوسة في منطقة ما تحت المهاد ، تسقط على الخلايا العصبية لهرمون إفراز الغدد التناسلية (GnRH) ، من بين خلايا أخرى. أظهرت الدراسات السابقة أن إشارات كيسبيبتين تحدث من خلال مستقبل Kiss1 (Kiss1r) ، مما يؤدي في النهاية إلى إثارة نشاط الخلايا العصبية GnRH. في البشر والنماذج الحيوانية التجريبية ، تكون القبلات كافية للحث على إفراز GnRH ، وبالتالي إطلاق الهرمون اللوتيني (LH) والهرمون المنشط للجريب (FSH). نظرا لأن kisspeptins تلعب دورا أساسيا في الوظائف الإنجابية ، يعمل الباحثون على تقييم كيفية مساهمة النشاط الجوهري للخلايا العصبية تحت المهاد في الإجراءات المتعلقة بالتكاثر وتحديد الناقلات العصبية / المعدلات العصبية الأولية القادرة على تغيير هذه الخصائص. أصبحت تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة أداة قيمة للتحقيق في نشاط الخلايا العصبية كيسبيبتين في خلايا القوارض. تسمح هذه التقنية التجريبية للباحثين بتسجيل وقياس التيارات الأيونية المثيرة والمثبطة التلقائية ، وإمكانات غشاء الراحة ، وإطلاق جهد الفعل ، وغيرها من الخصائص الكهربية لأغشية الخلايا. في هذه الدراسة ، تتم مراجعة الجوانب الحاسمة لتقنية مشبك التصحيح للخلية بأكملها ، والمعروفة باسم القياسات الكهربية الفسيولوجية التي تحدد الخلايا العصبية تحت المهاد كيسبيبتين ، ومناقشة القضايا ذات الصلة حول هذه التقنية.

Introduction

قام هودجكين وهكسلي بأول سجل داخل الخلايا لجهد الفعل الموصوف في العديد من الدراسات العلمية. تم إجراء هذا التسجيل على محور الحبار ، الذي يبلغ قطره الكبير (~ 500 ميكرومتر) ، مما يسمح بوضع قطب كهربائي دقيق داخل المحور. قدم هذا العمل إمكانيات كبيرة للبحث العلمي ، وبلغت ذروتها لاحقا في إنشاء وضع مشبك الجهد ، والذي تم استخدامه لدراسة الأساس الأيوني لتوليد جهد العمل1،2،3،4،5،6،7،8. على مر السنين ، تم تحسين هذه التقنية ، وأصبحت مطبقة على نطاق واسع في البحث العلمي 6,9. اختراع تقنية التصحيح المشبك، الذي حدث في أواخر سبعينيات القرن العشرين من خلال الدراسات التي بدأها إروين نيهر وبيرت ساكمان، سمح للباحثين لتسجيل القنوات أيون واحد وإمكانات الغشاء داخل الخلايا أو التيارات في كل نوع من الخلايا تقريبا باستخدام قطب كهربائي واحد فقط9،10،11،12. يمكن إجراء تسجيلات المشبك الرقعي على مجموعة متنوعة من مستحضرات الأنسجة ، مثل الخلايا المستزرعة أو شرائح الأنسجة ، إما في وضع مشبك الجهد (تثبيت غشاء الخلية عند جهد محدد يسمح بتسجيل ، على سبيل المثال ، التيارات المعتمدة على الجهد والتيارات المشبكية) أو وضع المشبك الحالي (مما يسمح بتسجيل ، على سبيل المثال ، التغيرات في جهد غشاء الراحة الناجم عن التيارات الأيونية ، إمكانات الفعل ، وتردد جهد ما بعد المشبكي).

جعل استخدام تقنية التصحيح المشبك العديد من الاكتشافات البارزة ممكنة. في الواقع ، فإن النتائج المنوية حول الخصائص الفيزيولوجية الكهربية للخلايا العصبية تحت المهاد kisspeptin الموجودة في النواة المحيطة بالبطين الأمامي البطني والمنقار حول البطين (AVPV / PeN Kisspeptin) ، والمعروفة أيضا باسم المنطقة المحيطة بالبطين المنقاري للبطين الثالث (RP3V) ، والنواة المقوسة لما تحت المهاد (ARH kisspeptin)13،14،15 ذات أهمية خاصة. في عام 2010 ، أجرى Ducret et al. التسجيلات الأولى للخلايا العصبية AVPV /PeN Kisspeptinفي الفئران باستخدام أداة فيزيولوجية كهربية أخرى ، وهي تقنية مشبك التصحيح للخلايا السائبة. قدمت هذه الدراسات وصفا كهربائيا للخلايا العصبية AVPV / PeNKisspeptin وأظهرت أن أنماط إطلاقها تعتمد على الدورة16. في عام 2011 ، استخدم Qiu et al. تقنية مشبك تصحيح الخلية بالكامل لإثبات أن الخلايا العصبية ARHkisspeptin تعبر عن تيارات جهاز تنظيم ضربات القلب الداخلي17. في وقت لاحق ، أظهر Gottsch et al. أن الخلايا العصبية kisspeptin تظهر نشاطا عفويا وتعبر عن كل من تيارات الكالسيوم من النوع h (جهاز تنظيم ضربات القلب) وتيارات الكالسيوم من النوع T ، مما يشير إلى أن الخلايا العصبيةARH kisspeptin تشترك في الخصائص الفيزيولوجية الكهربية مع الخلايا العصبية الأخرى لجهاز تنظيم ضربات القلب في الجهاز العصبي المركزي18. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن الخلايا العصبية ARH kisspeptin تظهر معدلات إطلاق ثنائية الشكل جنسيا وأن الخلايا العصبية AVPV /PeN Kisspeptin تظهر إمكانات غشاء استراحة ثنائية النمط (RMP) تتأثر بقنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP (KATP) 19,20. علاوة على ذلك ، ثبت أن المنشطات التناسلية تؤثر بشكل إيجابي على النشاط الكهربائي التلقائي للخلايا العصبية kisspeptin في الفئران19،20،21. تم ذكر الأعمال الأولى التي تدرس الخصائص الكهربية للخلايا العصبية كيسبيبتين16،17،18،19،20. منذ ذلك الحين ، استخدمت العديد من الدراسات تقنية مشبك التصحيح للخلية بأكملها لإثبات العوامل / المعدلات العصبية الكافية لتعديل النشاط الكهربائي للخلايا العصبية كيسبيبتين (الشكل 1)17،21،22،23،24،25،26،27،28،29،30، 31,32.

نظرا لأهمية هذه التقنية لدراسة الخلايا العصبية المطلوبة للتكاثر ، من بين أنواع الخلايا الأخرى التي لا يتم تناولها هنا ، تصف هذه المقالة الخطوات الأساسية لتطوير تقنية مشبك التصحيح للخلية بأكملها ، مثل تحضير المحاليل ، وتشريح الدماغ وتقطيعه ، وإجراء ختم غشاء الخلية للتسجيلات. علاوة على ذلك ، تتم مناقشة القضايا ذات الصلة حول التقنية ، مثل مزاياها والقيود الفنية والمتغيرات المهمة التي يجب التحكم فيها للحصول على الأداء التجريبي الأمثل.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات الحيوانات التابعة لمعهد العلوم الطبية الحيوية في جامعة ساو باولو وتم تنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية التي اعتمدتها الكلية البرازيلية للتجارب على الحيوانات.

1. إعداد الحلول

  1. إعداد الحل الداخلي
    ملاحظة: يملأ المحلول الداخلي الماصة الدقيقة ذات المشبك التصحيحي وسوف يتصل بداخل الخلية (انظر المثال في الشكل 2). قد تختلف الحلول الداخلية حسب نوع النشاط المراد قياسه33.
    1. اختيار الحل الداخلي مع مراعاة الغرض التجريبي منه ونوع السجل المناسب. لتسجيل جهد الغشاء في وضع المشبك الحالي ، استخدم المحلول الداخلي المكون من 120 mM K-gluconate ، 1 mM NaCl ، 5 mM EGTA ، 10 mM HEPES ، 1 mM MgCl 2 ، 1 mM CaCl2 ، 3 mM KOH ، 10 mM KCl ، و 4 mM (Mg) -ATP. قم بوزن جميع الأملاح وفقا للحجم النهائي المطلوب ، كما هو موضح في الجدول 1.
    2. استخدم كمية كافية من الماء منزوع الأيونات للوصول إلى 90٪ من الحجم النهائي للمحلول. سيضمن هذا الحجم مساحة كافية لضبط الأس الهيدروجيني والأسمولية.
    3. بعد إضافة وخلط جميع المكونات جيدا ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2-7.3 مع 5 M KOH باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. استخدم مقياس الأسموزية للتحقق من الأسمولية ، والتي يجب أن تكون حوالي 275-280 mOsm (اضبط ، إذا لزم الأمر ، لأسفل فقط).
    4. تحضير المحلول الداخلي مسبقا وتخزينه في درجة حرارة 8 درجات مئوية. أضف الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP) في يوم التجربة. قم بتخزين المحلول الداخلي المحتوي على ATP عند -20 درجة مئوية (1 مل من القسامة) لمدة 3-4 أشهر.
  2. تحضير محلول التقطيع
    1. تحضير محلول تقطيع يحتوي على 238 mM سكروز ، 2.5 mM KCl ، 26 mM NaHCO3 ، 1.0 mM NaH 2 PO4 ، 10 mM Glucose ، 1.0 mM CaCl 2، و 5.0 mM MgCl2. قم بوزن جميع الأملاح وفقا للحجم النهائي المطلوب ، كما هو موضح في الجدول 2. يعتمد الحجم الدقيق لهذا المحلول المراد تحضيره على حجم غرفة القطع.
    2. أثناء خلط جميع الأملاح في الماء منزوع الأيونات ، تشبع باستمرار مع الكاربوجين (95 ٪ O 2 و 5 ٪ CO2). قم بتوصيل أنابيب البولي إيثيلين (القطر الخارجي 1.57 مم [OD] × القطر الداخلي 1.14 مم [ID]) بأسطوانة كاربوجين لتزويد محلول التقطيع بالكاربوجين. أمسك الطرف المفتوح للأنبوب داخل الكأس الزجاجية التي تحتوي على محلول التقطيع.
    3. بعد خلط جميع المكونات جيدا ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3 مع حمض النيتريك بنسبة 10٪ باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. استخدم مقياس الأسموزية للتحقق من الأسمولية ، والتي يجب أن تكون 290-295 mOsm (اضبط ، إذا لزم الأمر ، لأسفل فقط). بعد ذلك ، قم بتبريد المحلول إلى 0-2 درجة مئوية.
  3. إعداد حل aCSF للتسجيلات
    1. تحضير محلول السائل النخاعي النخاعي الاصطناعي (aCSF) للتسجيلات التي تحتوي على 124 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 2.8 مللي مول KCl ، 26 مللي متر NaHCO3 ، 1.25 mMNaH2 PO 4 ، 1.2 mM MgSO4 ، 5 mM الجلوكوز ، و 2.5 mM CaCl2. قم بوزن جميع الأملاح وفقا للحجم النهائي المطلوب ، الوارد في الجدول 3.
    2. أثناء خلط جميع الأملاح في الماء منزوع الأيونات ، تشبع باستمرار بالكربوجين (95٪ O 2 و 5٪ CO 2) ، كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.
    3. بعد إضافة وخلط جميع المكونات ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3 (يمكن استخدام حمض النيتريك بنسبة 10٪) باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. استخدم مقياس الأسمومتر للتحقق من الأسمولية ، والتي يجب أن تكون 290-300 mOsm. بعد ذلك ، صب السائل الدماغي الشوكي في دورق واحتفظ به في حمام مائي عند 30 درجة مئوية.

2. تشريح الدماغ وتقطيعه

ملاحظة: نظرا لأن هياكل الدماغ المختلفة قد تتطلب قطعا في مستويات مختلفة (شرائح إكليلية أو سهمية أو أفقية) ، فإن النهج الدقيق للحصول على الشرائح يعتمد على منطقة الدماغ محل الاهتمام. عادة ، لدراسة الخلايا المعبرة عن Kiss1 في AVPV / PeN و ARH (المقومة هنا باسم الخلايا العصبية AVPV / PeN Kisspeptin والخلايا العصبية ARHkisspeptin ؛ الشكل 2 أ ، ب) ، عادة ما تصنع شرائح الدماغ الإكليلي (200-300 ميكرومتر)17،19،20،21،34. تقع الخلايا العصبية AVPV / PeN Kisspeptin على بعد حوالي 0.5 إلى -0.22 مم من bregma ، في حين أن الخلايا العصبيةARH kisspeptin هي في -1.22 إلى -2.70 ملم. يمكن تحديد موقع النوى باستخدام أطلس دماغ الفأرالتجسيمي 35 أو أطلس ألين المرجعي لدماغ الفأر (http://mouse.brain-map.org/). تم استخدام إناث Kiss1-Cre / GFP البالغة (مرحلة diestrus) والفئرانالذكور 36 في هذه الدراسة.

  1. إزالة الدماغ
    1. قم بإعداد موقع التشريح والأدوات اللازمة لاستخراج الدماغ: مقص قطع الرأس ، مقص القزحية ، مقص Castroviejo المنحني ، العظم العظمي ، الملقط ، الملعقة ، ورق الترشيح ، طبق بتري ، شفرة الحلاقة ، وغراء cyanoacrylate.
    2. قبل عمل الشرائح ، قم بإعداد المقعد الذي سيتم إجراء التشريح عليه ، حيث يجب تنفيذ جميع الإجراءات اللاحقة بسرعة. تأكد من الوصول إلى جهاز تقطيع مثل الاهتزاز.
    3. قم بإعداد غرفة تسجيل للحفاظ على شرائح الدماغ قبل تقطيع الأنسجة. احصل على غرفة تسجيل ، أبعاد حمام 24 مم × 15 مم × 2 مم (الطول × العرض × الارتفاع) ، من علامة تجارية (جدول المواد) أو اصنع واحدة داخليا.
      ملاحظة: يمكن تصنيع غرفة الاسترداد الداخلية على النحو التالي: قطع لوحة من 24 بئرا بحيث تتوفر تسعة آبار. قم بلصق شاشة من النايلون على قاعدة الآبار التسعة. مع ما تبقى من لوحة البئر ، قم بعمل قاعدة بحيث يكون الجزء السفلي من النايلون مجانيا. يمكن وضع هذه القاعدة المكيفة داخل كأس زجاجية سعة 500 mL تحتوي على aCSF (الشكل التكميلي 1).
    4. بعد تحضير كل شيء ، قم بتخدير الحيوان بمخدر مستنشق باستخدام 4٪ -5٪ إيزوفلوران. يجب أن يكون التخدير وفقا لبروتوكول معتمد من لجنة الأخلاقيات. بعد فترة وجيزة من عدم قدرة الحيوان على الحركة ، قم بإجراء اختبارات قرصة الذيل والمخلب للتأكد من تخدير الحيوان بعمق.
    5. قطع رأس الفئران بسرعة بينما لا يزال القلب نشطا لزيادة صلاحية الخلية. حصاد الدماغ بسرعة بعد قطع الرأس.
    6. باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل شق في الجلد في الجزء العلوي من جمجمة الحيوان ، من الذيلية إلى المنضدة ، وقم بإزالة فروة الرأس من رأس الحيوان. بعد ذلك ، قم بقطع الصفيحة بين الجداريات على طول الخيط السهمي بمقص القزحية وإزالة العظم القذالي. حرك العظم العظمي أسفل العظم الجداري واسحبه برفق للخارج حتى ينكشف الدماغ.
    7. بعد تعريض الدماغ ، اقلب الرأس رأسا على عقب ، واخفض الدماغ برفق لتصور العصب الثلاثي التوائم على كل جانب ، ثم اقطع العصب الثلاثي التوائم باستخدام مقص Castroviejo المنحني. بعد تصور منطقة ما تحت المهاد ، حدد العصب البصري واقطعه برفق.
      ملاحظة: كن حذرا عند قطع العصب البصري ، لأن سحبه سوف يمزق منطقة ما تحت المهاد المجاورة التي تحتوي على نواة AVPV / PeN.
    8. قطع الجزء الأمامي من الفص الجبهي وإزالة الدماغ تماما. اغمر الدماغ على الفور في محلول التقطيع حتى الحصول على الشرائح.
  2. تشريح عينات الدماغ
    1. ضع الدماغ على ورق ترشيح (مدعوم على طبق بتري) لتجفيف المحلول الزائد. ثم ، باستخدام شفرة حلاقة حادة ، قم بإجراء قطع إكليلي يفصل جذع الدماغ مع المخيخ عن بقية الأنسجة.
    2. بعد ذلك ، قم بلصق الجزء الذيلي من الدماغ بقاعدة الاهتزاز واملأ حجرة جهاز التقطيع بمحلول التقطيع / aCSF المبرد إلى 0-2 درجة مئوية. أثناء الإجراء ، قم بتعبئة الثلج الجاف حول حجرة الاهتزاز للحفاظ على محلول التقطيع باردا.
    3. أدخل شفرة الحلاقة في الاهتزاز واضبط معلمات القطع المناسبة للجهاز: السرعة = 3 ، التردد = 9 ، والتغذية = 250 ميكرومتر. استخدم ماصة نقل الأكريليك (ماصة زجاج باستور المقلوبة المرفقة بحلمة سيليكون) لنقل الشرائح إلى غرفة الاسترداد (الموضحة في الخطوة 2.1.3) أثناء إجراء تقطيع الأنسجة. انتظر 60 دقيقة لاستعادة الأنسجة بعد الحصول على شريحة.

3. ختم الخلية للتسجيل

  1. تأكد من تشغيل جميع قطع المعدات (المجهر ، مكبر الصوت ، التحويل الرقمي ، المعالج الدقيق ، وغيرها) قبل بدء التسجيل.
  2. املأ غرفة التسجيل ، من علامة تجارية (جدول المواد) ، متصلة بالمجهر بمحلول aCSF للتسجيلات. استخدم مضخة التروية لتغذية السائل الدماغي النخاعي باستمرار بمعدل 2 مل / دقيقة.
  3. انقل شريحة دماغية مثيرة للاهتمام (واحدة تلو الأخرى) إلى غرفة التسجيل. استخدم ماصة نقل الأكريليك (ماصة زجاج باستور المقلوبة المرفقة بحلمة سيليكون) لنقل شرائح ما تحت المهاد إلى الغرفة. استخدم مرساة شريحة (جدول المواد) لتثبيت الشريحة حتى لا تتحرك أثناء نضح السائل الدماغي النخاعي.
  4. ضع شريحة في وسط غرفة التسجيل متصلة بالمجهر. يعد موضع الشريحة أمرا بالغ الأهمية للسماح برؤية جيدة للمنطقة المرغوبة تحت المجهر وللوصول المثالي إلى ماصة التسجيل الدقيقة.
  5. استخدم عدسة الهدف منخفضة الطاقة لمجهر الغمر (10x أو 20x) للمساعدة في تحديد موضع الشريحة وتحديد منطقة الاهتمام.
  6. بعد تحديد المنطقة محل الاهتمام ، قم بتبديل العدسة الموضوعية إلى العدسة عالية الطاقة (63x) والتركيز على مستوى الأنسجة ، ومراقبة البروتين الفلوري الداخلي وأشكال الخلايا في المنطقة المستهدفة لتحديد موقع خلايا kisspeptin على سطح شريحة الدماغ20.
  7. عند تحديد موقع خلية هدف محتملة ، قم بتمييزها على شاشة الكمبيوتر بمؤشر الماوس أو عن طريق رسم تنسيق ، مثل مربع ، فوق منطقة الاهتمام. تساعد علامة شاشة الكمبيوتر في توجيه موضع ماصة التسجيل الدقيقة إلى الخلية.
  8. بعد تحديد الموقع الدقيق للخلية المستهدفة ، ارفع الهدف وأدخل ماصة التسجيل المملوءة بالمحلول الداخلي. عند وضع الماصة الدقيقة في حامل القطب ، تأكد من أن المحلول الداخلي ملامس للقطب الفضي.
    ملاحظة: لإعداد الماصة الدقيقة ووضعها ووضعها على حامل القطب ، يرجى الرجوع إلى33.
  9. تطبيق ضغط إيجابي قبل غمر الماصة الدقيقة في محلول aCSF ، لمنع الحطام من دخول الماصة الدقيقة ، باستخدام حقنة مملوءة بالهواء سعة 1-3 مل متصلة بحامل الماصة الدقيقة من خلال أنبوب بولي إيثيلين (أطول ≈130 سم) ؛ تطبيق ما يقرب من 100-200 ميكرولتر من الهواء.
  10. باستخدام المناور الدقيق ، قم بتوجيه الماصة الدقيقة أسفل مركز الهدف. حرك الأزرار الموجودة على المناور الدقيق لتوجيه الماصة الدقيقة على محور X-Y-Z نحو الخلية محل الاهتمام.
  11. اضبط التركيز البؤري لرؤية طرف الماصة الدقيقة واجعل التركيز البؤري أقرب ، ولكن ليس قريبا جدا ، من الشريحة. قلل من سرعة المعالج الدقيق وقم بخفض الماصة الدقيقة ببطء إلى مستوى التركيز. تأكد من أن طرف الماصة الدقيقة لا يخترق الشريحة فجأة ، بل ينزل ببطء حتى يلامس سطح الخلية / المنطقة المستهدفة.
  12. استخدم ضغطا إيجابيا خفيفا (≈100 ميكرولتر) باستخدام حقنة مملوءة بالهواء سعة 1-3 مل متصلة بحامل الماصة الدقيقة لإزالة أي حطام من مسار الاقتراب.
  13. ركز على الخلية المستهدفة وحرك المعالج الدقيق ببطء على المحور X-Y-Z لتقريب الماصة الدقيقة من الخلية المستهدفة. عند لمس الماصة الدقيقة بالخلية ، سيتم ملاحظة غمازة ناتجة عن الضغط المطبق من خلال طرف الماصة الدقيقة (الشكل 2C).
  14. بعد تشكيل الدمل ، نظرا لقرب الماصة الدقيقة من الخلية ، ضع شفطا ضعيفا وقصيرا عن طريق الفم (1-2 ثانية) من خلال الأنبوب المتصل بحامل الماصة الدقيقة لتوليد الختم بين الماصة الدقيقة إلى الخلية (ختم جيجاأوم أو جيجاسيل >1 GΩ ؛ الشكل 2 د). لتشكيل الختم ، استخدم وضع مشبك الجهد على البرنامج. للحصول على تفاصيل تشكيل الختم ، يرجى الرجوع إلى33.
  15. إذا ظل الختم مستقرا (يجب أن يكون ختم gigaohm مستقرا ميكانيكيا وبدون تدخل ضوضاء ، يتم تحديده عن طريق الملاحظة لمدة 1 دقيقة تقريبا) ، اضبط جهد التثبيت عند أقرب إمكانات الراحة الفسيولوجية للخلية المعنية. بالنسبة للخلايا العصبية تحت المهاد كيسبيبتين ، يوصى باستخدام -50 مللي فولت.
  16. تطبيق شفط قصير عن طريق الفم (الضغط السلبي) مع إغلاق الماصة الدقيقة على الخلية لكسر غشاء البلازما (الشكل 2E). يتم تحقيق التكوين المناسب للخلية الكاملة عند إجراء الشفط بقوة كافية بحيث لا يسد الغشاء الممزق الماصة الدقيقة ولا يجذب جزءا كبيرا من الغشاء أو حتى الخلية.
  17. تحقق من دليل إعدادات النظام المستخدم. استخدم البرنامج (انظر جدول المواد) للتحقق رقميا وحساب مقاومة السلسلة (SR) وسعة الخلية الكاملة (wcc).
  18. في وضع مشبك الجهد ، بعد كسر غشاء الخلية ، قم بتمكين خيار الخلية بأكملها ، وانقر فوق الأمر "تلقائي" الذي يشير إلى علامة تبويب الخلية بأكملها. سيتم حساب SR و wcc للخلية تلقائيا وعرضها على الفور بواسطة البرنامج. يمكن أيضا التحقق من هذه المعلمات عن طريق إجراء اختبار الغشاء باستخدام مكبر الصوت المذكور في جدول المواد33.
  19. تأكد من التحقق من معلمات صلاحية الخلية. بالنسبة للخلايا العصبية كيسبيبتين ، تحقق من أن القياسات الفيزيولوجية الكهربية هي: SR < 25 mΩ ، ومقاومة المدخلات > 0.3 GΩ ، والاحتفاظ بالقيمة المطلقة الحالية < 30 pA (الملاحظات الشخصية والمرجع21). القيمة المتوسطة ل WCC للخلايا العصبية AVPV / PeNKisspeptin أو ARHkisspeptin هي ≈ 10-12 pF في الفئران السليمةللغدد التناسلية 20.
  20. راقب SR وسعة الحالة المستقرة للخلية أثناء التجارب. تأكد من أن SR لا يتغير أكثر من 20٪ أثناء التسجيل وأن سعة الغشاء مستقرة.
  21. تحقق من إعدادات البرنامج. إنشاء بروتوكولات محددة للتسجيلات وفقا لنوع التجربة. لتسجيل جهد الغشاء في وضع المشبك الحالي ، باستخدام المعدات المذكورة في جدول المواد ، يقوم تمرير منخفض بتصفية الإشارات الكهربية عند 2-4 كيلو هرتز وتحليل النتائج في وضع عدم الاتصال في برنامج (انظر جدول المواد للحصول على معلومات البرنامج).
  22. بمجرد تحقيق تكوين الخلية بأكملها بشكل صحيح ، قم بقياس التيارات المشبكية في وضع مشبك الجهد (الشكل 2G). سجل التغيرات في إمكانات غشاء الراحة (RMP) وتغيرات RMP المستحثة في وضع المشبك الحالي (الشكل 2H). يمكن إحداث تغييرات في RMP ، مثل إزالة استقطاب غشاء الخلية ، عن طريق إعطاء دواء / ناقل عصبي معروف للحمام (كما هو موضح في الخطوة 3.2) ، كما هو موضح في الشكل 1.
    ملاحظة: في وضع المشبك الحالي ، يمكن حقن التيار الموجب أو السالب للحفاظ على جهد الغشاء عند الجهد المطلوب. بالنسبة للخلايا العصبية kisspeptin ، عادة ما نضع حقنة تيار صفرية (I = 0) لتسجيل التباين التلقائي لجهد الغشاء.

النتائج

لدراسة الآثار المحتملة لهرمون النمو البشري المؤتلف (hGH) على نشاط الخلايا العصبية تحت المهاد ، أجرينا تسجيلات مشبك رقعة للخلية الكاملة في شرائح الدماغ وقيمنا ما إذا كان هذا الهرمون يسبب تغيرات حادة في نشاط الخلايا العصبية AVPV / PeNKisspeptin و ARHkisspeptin. تم استخدام إناث Kiss1-Cre / GFP البالغة (م...

Discussion

كان لتطوير تقنية المشبك التصحيحي للخلية الكاملة تأثير كبير على المجتمع العلمي ، حيث تعتبر ذات أهمية قصوى لتطوير البحث العلمي وتمكين العديد من الاكتشافات. كان تأثيره على العلم كافيا ليتوج بجائزة نوبل في الطب في عام 1991 ، حيث فتح هذا الاكتشاف الباب أمام فهم أفضل لكيفية عمل القنوات الأيونية ف...

Disclosures

لا يوجد تضارب في المصالح ليتم الإعلان عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة أبحاث ساو باولو [أرقام منح FAPESP: 2021/11551-4 (JNS) ، 2015/20198-5 (TTZ) ، 2019/21707/1 (RF) ؛ ومن قبل Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - قانون المالية 001" (HRV).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATPSigma Aldrich/variousA9187
CaCl2Sigma Aldrich/variousC7902
D-(+)-GlucoseSigma Aldrich/variousG7021
EGTASigma Aldrich/variousO3777
HEPESSigma Aldrich/variousH3375
KCLSigma Aldrich/variousP5405
K-gluconateSigma Aldrich/variousG4500
KOHSigma Aldrich/variousP5958
MgCl2Sigma Aldrich/variousM9272
MgSO4Sigma Aldrich/various230391
NaClSigma Aldrich/variousS5886
NaH2PO4 Sigma Aldrich/variousS5011
NaHCO3Sigma Aldrich/variousS5761
nitric acidSigma Aldrich/various225711CAUTION
SucroseSigma Aldrich/variousS1888
Equipments
Air tableTMC63-534
AmplifierMolecular DevicesMulticlamp 700B
Computervarious-
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEMMolecular DevicesDD1440
Digital peristaltic pumpIsmatecISM833C 
Faraday cageTMC81-333-03
Imaging CameraLeicaDFC 365 FX
MicromanipulatorSutter InstrumentsRoe-200
Micropipette PullerNarishigePC-10
MicroscopeLeicaDM6000 FS
OsteotomeBonther equipamentos & Tecnologia/various128
Recovery chamberWarner Instruments/Harvard apparatus-can be made in-house
Recording chamberWarner Instruments640277
SpatulaFisher Scientific /variousFISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome LeicaVT1000 S
Water Bath Fisher Scientific /variousIsotemp
Software and systems
AxoScope 10 softwareMolecular Devices-Commander Software
LAS X wide field systemLeica-Image acquisition and analysis
MultiClamp 700BMolecular DevicesMULTICLAMP 700BCommander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWSMolecular DevicesPclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mmWarner Instruments64-1309
Curved hemostatic forcepvarious-
cyanoacrylate glueLOCTITE/various-
Decapitation scissorsvarious-
Filter papervarious-
Glass capillaries (micropipette)World Precision Instruments, IncTW150F-4
Iris scissorsBonther equipamentos & Tecnologia/various65-66
Pasteur glass pipette Sigma Aldrich/variousCLS7095B9-1000EA
Petri dishvarious-
Polyethylene tubing Warner Instruments64-0756
Razor blade for brain dissectionTED PELLATEDP-121-1
Razor blade for the vibratomeTED PELLATEDP-121-9
ScissorsBonther equipamentos & Tecnologia/various71-72, 48,49; 
silicone teatvarious-
Slice Anchor Warner Instruments64-0246
Syringe filtersMerck Millipore LtdaSLGVR13SLMillex-GV 0.22 μm
TweezersBonther equipamentos & Tecnologia/various131, 1518

References

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
  3. Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
  4. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  5. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  6. Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357 (2019).
  7. Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  8. Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
  11. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  12. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  13. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  14. Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
  15. Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
  16. Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
  17. Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
  18. Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
  19. de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
  20. Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
  21. DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
  22. Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532 (2022).
  23. Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006 (2022).
  24. Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
  25. Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
  26. Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698 (2013).
  27. Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
  28. Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
  29. de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
  30. Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
  31. True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
  32. Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
  33. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  34. Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
  35. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , (2001).
  36. Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neuroscience. 173, 37-56 (2011).
  37. Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
  38. Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
  39. Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380 (1991).
  40. Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449 (1991).
  41. Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
  42. Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
  43. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
  44. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  45. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
  46. Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
  47. Dallas, M., Bell, D. . Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
  48. Robinson, R. A., Stokes, R. H. . Electrolyte Solutions. 2nd edition. , (1959).
  49. de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
  50. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  51. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  52. Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
  53. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
  54. Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
  55. Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246 (2016).
  56. Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928 (2020).
  57. Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045 (2022).
  58. Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957 (2021).
  59. Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
  60. Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425 (2020).
  61. Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 193 Kiss1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved