Hypothalamische Kisspeptin-Neurone als Ziel für Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitungen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, mit dem eine Ganzzell-Patchklemme auf Hirnschnitten durchgeführt werden kann, die Kisspeptin-Neuronen, den primären Modulator von Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH)-Zellen, enthalten. Durch das Hinzufügen von Wissen über die Aktivität von Kisspeptin-Neuronen hat dieses elektrophysiologische Werkzeug in den letzten 20 Jahren als Grundlage für bedeutende Fortschritte auf dem Gebiet der Neuroendokrinologie gedient.

Zusammenfassung

Kisspeptine sind essentiell für die Reifung der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (HPG) und die Fruchtbarkeit. Hypothalamische Kisspeptin-Neuronen, die sich im anteroventralen periventrikulären Kern und rostralen periventrikulären Kern sowie im Nucleus arcuatus des Hypothalamus befinden, projizieren unter anderem auf Neuronen des Gonadotropin-Releasing-Hormons (GnRH). Frühere Studien haben gezeigt, dass der Kisspeptin-Signalweg über den Kiss1-Rezeptor (Kiss1r) erfolgt, was letztendlich die Aktivität des GnRH-Neurons anregt. In Menschen und experimentellen Tiermodellen sind Kisspeptine ausreichend, um die GnRH-Sekretion und damit die Freisetzung des luteinisierenden Hormons (LH) und des follikelstimulierenden Hormons (FSH) zu induzieren. Da Kisspeptine eine wesentliche Rolle bei den Fortpflanzungsfunktionen spielen, arbeiten die Forscher daran, zu untersuchen, wie die intrinsische Aktivität der hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen zu reproduktionsbezogenen Aktionen beiträgt, und die primären Neurotransmitter/Neuromodulatoren zu identifizieren, die diese Eigenschaften verändern können. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik hat sich zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung der Aktivität von Kisspeptin-Neuronen in Nagetierzellen entwickelt. Diese experimentelle Technik ermöglicht es den Forschern, spontane erregende und hemmende Ionenströme, das Ruhemembranpotential, das Aktionspotentialfeuer und andere elektrophysiologische Eigenschaften von Zellmembranen aufzuzeichnen und zu messen. In der vorliegenden Arbeit werden entscheidende Aspekte der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik, bekannt als elektrophysiologische Messungen, die hypothalamische Kisspeptin-Neurone definieren, und eine Diskussion relevanter Fragen zur Technik besprochen.

Einleitung

Hodgkin und Huxley machten den ersten intrazellulären Nachweis eines Aktionspotentials, das in mehreren wissenschaftlichen Studien beschrieben wurde. Diese Aufnahme wurde am Squid-Axon durchgeführt, das einen großen Durchmesser (~500 μm) hat, so dass eine Mikroelektrode im Axon platziert werden kann. Diese Arbeit bot große Möglichkeiten für die wissenschaftliche Forschung, die später in der Schaffung des Spannungszangenmodus gipfelte, der zur Untersuchung der ionischen Grundlagen der Erzeugung von Aktionspotentialen^verwendet wurde 1,2,3,4,5,6,7,8. Im Laufe der Jahre wurde die Technik verbessert und in der wissenschaftlichen Forschung weit verbreitet ^6,9. Die Erfindung der Patch-Clamp-Technik, die Ende der 1970er Jahre durch Studien von Erwin Neher und Bert Sakmann erfolgte, ermöglichte es den Forschern, einzelne Ionenkanäle und intrazelluläre Membranpotentiale oder -ströme in praktisch jedem Zelltyp mit nur einer einzigen Elektrode aufzuzeichnen 9,10,11,12. Patch-Clamp-Ableitungen können an einer Vielzahl von Gewebepräparaten, wie z. B. kultivierten Zellen oder Gewebeschnitten, entweder im Voltage-Clamp-Modus (Halten der Zellmembran auf einer festgelegten Spannung, was die Aufzeichnung von z. B. spannungsabhängigen Strömen und synaptischen Strömen ermöglicht) oder im Current-Clamp-Modus (der die Aufzeichnung von z. B. Änderungen des Ruhemembranpotentials ermöglicht, die durch Ionenströme induziert werden) durchgeführt werden. Aktionspotentiale und postsynaptische Potentialfrequenz).

Der Einsatz der Patch-Clamp-Technik ermöglichte mehrere bemerkenswerte Entdeckungen. In der Tat sind die bahnbrechenden Erkenntnisse über die elektrophysiologischen Eigenschaften von hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen, die sich an den anteroventralen periventrikulären und rostralen periventrikulären Kernen (AVPV/PeN Kisspeptin), auch bekannt als rostraler periventrikulärer Bereich des dritten Ventrikels (RP3V), und dem Nucleus arcuatus des Hypothalamus (ARH^Kisspeptin) befinden13,14,15 sind von besonderem Interesse. Im Jahr 2010 führten Ducret et al. die ersten Aufnahmen von AVPV/^{PeN-Kisspeptin-Neuronen}in Mäusen mit einem anderen elektrophysiologischen Werkzeug, der Loose-Cell-Patch-Clamp-Technik, durch. Diese Studien lieferten eine elektrische Beschreibung von AVPV/^{PeN-Kisspeptin-Neuronen} und zeigten, dass ihre Feuermuster vom Brunstzyklus abhängen¹⁶. Im Jahr 2011 verwendeten Qiu et al. die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik, um zu zeigen, dass^{ARH-Kisspeptin-Neuronen} endogene Schrittmacherströme exprimieren¹⁷. In der Folge zeigten Gottsch et al., dass Kisspeptin-Neuronen spontane Aktivität aufweisen und sowohl h-Typ (Schrittmacher) als auch T-Typ Kalziumströme exprimieren, was darauf hindeutet, dass^{ARH-Kisspeptin-Neuronen} elektrophysiologische Eigenschaften mit anderen Schrittmacherneuronen des Zentralnervensystems teilen¹⁸. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass ARH-Kisspeptin-Neurone sexuell dimorphe Feuerraten aufweisen und dass AVPV/^{PeN-Kisspeptin-Neurone} ein bimodales Ruhemembranpotential (RMP) aufweisen, das von ATP-sensitiven Kaliumkanälen (K_ATP) beeinflusst ^wird19,20. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass Gonadensteroide die spontane elektrische Aktivität der Kisspeptin-Neuronen in Mäusen positiv beeinflussen 19,20,21. Die ersten Arbeiten, die die elektrophysiologischen Eigenschaften von Kisspeptin-Neuronen untersuchen, werden erwähnt 16,17,18,19,20. Seitdem wurde in vielen Studien die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik verwendet, um zu zeigen, welche Faktoren/Neuromodulatoren ausreichen, um die elektrische Aktivität von Kisspeptin-Neuronen zu modulieren (Abbildung 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,^31,32.

Angesichts der Bedeutung dieser Technik für die Untersuchung von Neuronen, die für die Fortpflanzung benötigt werden, neben anderen Zelltypen, die hier nicht behandelt werden, beschreibt dieser Artikel die grundlegenden Schritte für die Entwicklung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik, wie z. B. die Herstellung der Lösungen, das Sezieren und Schneiden des Gehirns und das Versiegeln der Zellmembran für Aufzeichnungen. Darüber hinaus werden relevante Fragen der Technik diskutiert, wie z.B. ihre Vorteile, technischen Einschränkungen und wichtigen Variablen, die für eine optimale experimentelle Leistung kontrolliert werden müssen.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden von der Tierethikkommission des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften an der Universität von São Paulo genehmigt und gemäß den ethischen Richtlinien des brasilianischen Kollegiums für Tierversuche durchgeführt.

1. Herstellung von Lösungen

1. Herstellung der inneren Lösung
   Anmerkungen: Die interne Lösung füllt die Patch-Clamp-Mikropipette und kommt mit dem Inneren der Zelle in Kontakt (siehe Beispiel in Abbildung 2). Interne Lösungen können je nach Art der zu messenden Aktivität variieren³³.
   1. Wählen Sie die interne Lösung unter Berücksichtigung ihres experimentellen Zwecks und des geeigneten Datensatztyps aus. Um das Membranpotential im Stromklemmenmodus aufzuzeichnen, verwenden Sie die interne Lösung, die aus 120 mM K-Gluconat, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl₂, 3 mM KOH, 10 mM KCl und 4 mM (Mg)-ATP besteht. Wiegen Sie alle Salze entsprechend dem gewünschten Endvolumen, wie in Tabelle 1 angegeben.
   2. Verwenden Sie genügend deionisiertes Wasser, um 90 % des Endvolumens der Lösung zu erreichen. Dieses Volumen bietet genügend Platz, um den pH-Wert und die Osmolarität einzustellen.
   3. Nachdem Sie alle Zutaten hinzugefügt und gründlich gemischt haben, stellen Sie den pH-Wert mit 5 M KOH mit einem pH-Messgerät auf 7,2-7,3 ein. Verwenden Sie ein Osmometer, um die Osmolarität zu überprüfen, die bei etwa 275-280 mOsm liegen sollte (stellen Sie bei Bedarf nur nach unten ein).
   4. Bereiten Sie die innere Lösung im Voraus vor und lagern Sie sie bei 8 °C. Fügen Sie das ATP am Tag des Experiments hinzu. Lagern Sie die ATP-haltige interne Lösung bei -20 °C (1 mL Aliquots) für 3-4 Monate.
2. Herstellung der Schneidelösung
   1. Bereiten Sie eine Schnittlösung vor, die 238 mM Saccharose, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,0 mM_NaH2PO4, 10 mM Glucose, 1,0 mM CaCl2_und 5,0 mM_MgCl2 enthält. Wiegen Sie alle Salze entsprechend dem gewünschten Endvolumen, wie in Tabelle 2 gezeigt. Das genaue Volumen dieser herzustellenden Lösung hängt von der Größe der Schneidkammer ab.
   2. Während Sie alle Salze in deionisiertem Wasser mischen, sättigen Sie sie ständig mit Carbogen (95% O 2 und 5% CO₂). Befestigen Sie Polyethylenschläuche (1,57 mm Außendurchmesser [OD] x 1,14 mm Innendurchmesser [ID]) an einem Carbogenzylinder, um Carbogen der Schneidlösung zuzuführen. Halten Sie das offene Ende des Röhrchens in das Becherglas mit der Schneidlösung.
   3. Nachdem Sie alle Zutaten gut vermischt haben, stellen Sie den pH-Wert mit 10% Salpetersäure mit einem pH-Messgerät auf 7,3 ein. Verwenden Sie ein Osmometer, um die Osmolarität zu überprüfen, die 290-295 mOsm betragen sollte (stellen Sie bei Bedarf nur nach unten ein). Anschließend kühlen Sie die Lösung auf 0-2 °C ab.
3. Vorbereiten einer CSF-Lösung für Aufnahmen
   1. Bereiten Sie eine künstliche Liquorlösung (aCSF) für Aufnahmen vor, die 124 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 1,25 mM_NaH2PO₄, 1,2 mM_MgSO4, 5 mM Glukose und 2,5 mM CaCl₂ enthalten. Wiegen Sie alle Salze entsprechend dem gewünschten Endvolumen, das in Tabelle 3 angegeben ist.
   2. Während Sie alle Salze in deionisiertem Wasser mischen, sättigen Sie sie ständig mit Carbogen (95 %_O2 und 5 % CO 2_), wie in Schritt 1.2.2 beschrieben.
   3. Nachdem Sie alle Zutaten hinzugefügt und gemischt haben, stellen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät auf 7,3 (10% Salpetersäure kann verwendet werden) ein. Verwenden Sie ein Osmometer, um die Osmolarität zu überprüfen, die 290-300 mOsm betragen sollte. Anschließend das aCSF in ein Becherglas geben und im Wasserbad bei 30 °C aufbewahren.

2. Dissektion und Schneiden des Gehirns

HINWEIS: Da unterschiedliche Gehirnstrukturen in verschiedenen Ebenen (koronale, sagittale oder horizontale Schichten) geschnitten werden müssen, hängt der genaue Ansatz zur Gewinnung der Schnitte von der interessierenden Gehirnregion ab. Typischerweise werden die Kiss1-exprimierenden Zellen in den AVPV/PeN- und ARH-Neuronen (hier als AVPV/PeN-Kisspeptin-Neuronen und^{ARH-Kisspeptin-Neuronen} bezeichnet; Abbildung 2A,B), werden koronale Hirnschnitte (200-300 μm) in der Regel 17,19,20,21,34 hergestellt. Die AVPV/PeN-Kisspeptin-Neuronen befinden sich etwa 0,5 bis -0,22 mm vom Bregma entfernt, während die^{ARH-Kisspeptin-Neuronen} bei -1,22 bis -2,70 mm liegen. Die Lage der Zellkerne kann mit Hilfe eines stereotaktischen Maushirnatlas³⁵ oder des Allen Mouse Brain Reference Atlas (http://mouse.brain-map.org/) bestimmt werden. In dieser Studie wurden adulte weibliche (Diestrus-Stadium) und männliche Kiss1-Cre/GFP-Mäuse³⁶ verwendet.

1. Entfernung des Gehirns
   1. Bereiten Sie die Sezierstelle und die Werkzeuge vor, die zum Extrahieren des Gehirns benötigt werden: Enthauptungsschere, Irisschere, gebogene Castroviejo-Schere, Osteotom, Pinzette, Spatel, Filterpapier, Petrischale, Rasierklinge und Cyanacrylatkleber.
   2. Bereiten Sie vor der Herstellung der Scheiben die Bank vor, auf der die Präparation durchgeführt werden soll, da alle nachfolgenden Eingriffe schnell durchgeführt werden müssen. Stellen Sie sicher, dass Sie Zugang zu einem Schneidegerät wie einem Vibratom haben.
   3. Bereiten Sie eine Aufnahmekammer vor, um die Hirnschnitte zu erhalten, bevor Sie das Gewebe schneiden. Erwerben Sie eine Aufnahmekammer mit Badabmessungen von 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x B x H) von einer Handelsmarke (Table of Materials) oder stellen Sie eine im eigenen Haus her.
      HINWEIS: Eine hauseigene Rückgewinnungskammer kann wie folgt hergestellt werden: Schneiden Sie eine 24-Well-Platte so zu, dass neun Wells zur Verfügung stehen. Kleben Sie ein Nylonsieb auf den Boden der neun Vertiefungen. Machen Sie mit dem Rest der Wellplatte eine Basis, so dass der untere Teil des Nylons frei ist. Dieser angepasste Boden kann in ein 500-ml-Becherglas mit dem aCSF gegeben werden (ergänzende Abbildung 1).
   4. Nachdem Sie alles vorbereitet haben, betäuben Sie das Tier mit einem inhalativen Anästhetikum mit 4%-5% Isofluran. Die Anästhesie muss nach einem von der Ethikkommission genehmigten Protokoll erfolgen. Kurz nachdem das Tier bewegungsunfähig ist, führen Sie Schwanz- und Pfotenquetschtests durch, um sicherzustellen, dass das Tier tief betäubt ist.
   5. Enthaupten Sie die Mäuse schnell, während das Herz noch aktiv ist, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen. Ernte das Gehirn schnell nach der Enthauptung.
   6. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt in die Haut an der Oberseite des Schädels des Tieres, von kaudal bis rostral, und entfernen Sie die Kopfhaut vom Kopf des Tieres. Als nächstes schneiden Sie die Interparietalplatte mit der Irisschere entlang der sagittalen Naht und entfernen das Hinterhauptbein. Schieben Sie das Osteotom unter den Scheitelbein und ziehen Sie es vorsichtig heraus, bis das Gehirn freigelegt ist.
   7. Nachdem Sie das Gehirn freigelegt haben, drehen Sie den Kopf auf den Kopf, senken Sie das Gehirn sanft ab, um den Trigeminusnerv auf jeder Seite sichtbar zu machen, und schneiden Sie dann den Trigeminusnerv mit einer gebogenen Castroviejo-Schere durch. Nachdem Sie den Hypothalamus dargestellt haben, identifizieren Sie den Sehnerv und schneiden Sie ihn sanft durch.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den Sehnerv durchtrennen, da durch Ziehen der angrenzende hypothalamische Bereich, der den AVPV/PeN-Kern enthält, zerrissen wird.
   8. Schneiden Sie den vordersten Teil des Frontallappens ab und entfernen Sie das Gehirn vollständig. Tauchen Sie das Gehirn sofort in die Schneidelösung ein, bis Sie die Scheiben erhalten.
2. Schneiden von Gehirnproben
   1. Legen Sie das Gehirn auf Filterpapier (gestützt auf eine Petrischale), um die überschüssige Lösung zu trocknen. Führen Sie dann mit einer scharfen Rasierklinge einen koronalen Schnitt durch, der den Hirnstamm mit dem Kleinhirn vom Rest des Gewebes trennt.
   2. Als nächstes kleben Sie den kaudalen Teil des Gehirns auf die Basis des Vibratoms und füllen die Kammer des Schneidegeräts mit der auf 0-2 °C abgekühlten Schneide-/aCSF-Lösung. Packen Sie während des Vorgangs Trockeneis um die Vibratomkammer, um die Schneidelösung kalt zu halten.
   3. Führen Sie die Rasierklinge in das Vibratom ein und stellen Sie die entsprechenden Schneidparameter des Geräts ein: Geschwindigkeit = 3, Frequenz = 9 und Vorschub = 250 μm. Verwenden Sie eine Acryl-Transferpipette (invertierte Pasteur-Glaspipette, die an einem Silikonsauger befestigt ist), um die Scheiben während des Gewebeschneidens in die Auffangkammer (siehe Schritt 2.1.3) zu übertragen. Warten Sie 60 Minuten, bis sich das Gewebe nach der Schnittaufnahme erholt hat.

3. Zellenversiegelung für die Aufnahme

1. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte (Mikroskop, Verstärker, Digitizer, Mikromanipulator und andere) eingeschaltet sind, bevor Sie mit der Aufnahme beginnen.
2. Füllen Sie die am Mikroskop angebrachte Aufnahmekammer einer handelsüblichen Marke (Table of Materials) mit der aCSF-Lösung für Aufzeichnungen. Verwenden Sie eine Perfusionspumpe, um den aCSF konstant mit einer Rate von 2 ml/min zu perfundieren.
3. Übertragen Sie einen gewünschten Brain Slice (einen nach dem anderen) in die Aufnahmekammer. Verwenden Sie eine Acryl-Transferpipette (invertierte Pasteur-Glaspipette, die an einem Silikonsauger befestigt ist), um die hypothalamischen Scheiben in die Kammer zu übertragen. Verwenden Sie einen Schichtanker (Materialtabelle), um die Scheibe so zu halten, dass sie sich während der aCSF-Perfusion nicht bewegt.
4. Legen Sie eine Scheibe in die Mitte der Aufnahmekammer, die am Mikroskop befestigt ist. Die Schichtposition ist entscheidend, um eine gute Sicht auf den gewünschten Bereich unter dem Mikroskop zu ermöglichen und die Aufnahmemikropipette perfekt zu erreichen.
5. Verwenden Sie die lichtsparende Objektivlinse (10x oder 20x) eines Tauchmikroskops, um die Positionierung der Schicht und die Lokalisierung des interessierenden Bereichs zu unterstützen.
6. Nachdem Sie die interessierende Region lokalisiert haben, schalten Sie die Objektivlinse auf die Hochleistungslinse (63x) um und konzentrieren Sie sich auf die Gewebeebene, wobei Sie das endogene fluoreszierende Protein und die Formen der Zellen in der Zielregion beobachten, um die Kisspeptin-Zellen auf der Oberfläche der Gehirnscheibe²⁰ zu lokalisieren.
7. Wenn sich eine mögliche Zielzelle befindet, markieren Sie sie auf dem Computerbildschirm mit dem Mauszeiger oder indem Sie ein Format, z. B. ein Quadrat, über den gewünschten Bereich zeichnen. Die Bildschirmmarkierung des Computers hilft dabei, die Position der Aufzeichnungsmikropipette zur Zelle zu führen.
8. Nachdem Sie die genaue Position der Zielzelle bestimmt haben, heben Sie das Objektiv an und führen Sie die mit der internen Lösung gefüllte Aufnahmemikropipette ein. Achten Sie beim Einsetzen der Mikropipette in den Elektrodenhalter darauf, dass die innere Lösung mit der Silberelektrode in Kontakt steht.
   Anmerkungen: Informationen zur Vorbereitung, Platzierung und Positionierung der Mikropipette auf dem Elektrodenhalter finden Sie unter³³.
9. Üben Sie vor dem Eintauchen der Mikropipette in die aCSF-Lösung einen Überdruck aus, um zu verhindern, dass Schmutz in die Mikropipette eindringt, indem Sie eine luftgefüllte 1-3-ml-Spritze verwenden, die über einen Polyethylenschlauch (≈130 cm länger) mit dem Mikropipettenhalter verbunden ist. Tragen Sie fast 100-200 μl Luft auf.
10. Führen Sie die Mikropipette mit dem Mikromanipulator unter die Mitte des Objektivs. Bewegen Sie die Tasten am Mikromanipulator, um die Mikropipette auf der X-Y-Z-Achse in Richtung der gewünschten Zelle zu führen.
11. Stellen Sie den Fokus so ein, dass die Spitze der Mikropipette zu sehen ist, und bringen Sie den Fokus näher, aber nicht zu nah an die Schicht. Verringern Sie die Geschwindigkeit des Mikromanipulators und senken Sie die Mikropipette langsam auf die Fokusebene. Achten Sie darauf, dass die Mikropipettenspitze nicht abrupt in die Scheibe eindringt, sondern langsam absinkt, bis sie die Oberfläche der Zelle/Zielregion berührt.
12. Üben Sie mit der luftgefüllten 1-3-ml-Spritze, die am Mikropipettenhalter befestigt ist, leichten Überdruck (≈100 μl) aus, um jeglichen Schmutz von der Annäherungsbahn zu entfernen.
13. Konzentrieren Sie sich auf die Zielzelle und bewegen Sie den Mikromanipulator langsam auf der X-Y-Z-Achse, um die Mikropipette näher an die Zielzelle zu bringen. Wenn die Mikropipette mit der Zelle berührt wird, wird ein Grübchen beobachtet, das durch den Druck verursacht wird, der durch die Mikropipettenspitze ausgeübt wird (Abbildung 2C).
14. Nach der Bildung des Grübchens ist aufgrund der Nähe der Mikropipette zur Zelle ein schwacher, kurzer Sog mit dem Mund (1-2 s) durch das mit dem Mikropipettenhalter verbundene Röhrchen durchzuführen, um die Abdichtung zwischen der Mikropipette und der Zelle zu erzeugen (Gigaohm-Dichtung oder Gigaseal >1 GΩ; Abbildung 2D). Um die Dichtung zu bilden, verwenden Sie den Voltage-Clamp-Modus in der Software. Einzelheiten zur Siegelbildung finden Sie unter³³.
15. Wenn die Dichtung stabil bleibt (die Gigaohm-Dichtung sollte mechanisch stabil und ohne Rauschstörungen sein, ermittelt durch Beobachtung für ca. 1 min), stellen Sie die Haltespannung auf das nächstgelegene physiologische Ruhepotential der interessierenden Zelle ein. Für Kisspeptin-Hypothalamus-Neurone werden -50 mV empfohlen.
16. Saugen Sie kurz mit dem Mund (Unterdruck) ab, wobei die Mikropipette an der Zelle versiegelt ist, um die Plasmamembran zu durchbrechen (Abbildung 2E). Eine adäquate Ganzzellkonfiguration wird erreicht, wenn das Absaugen mit ausreichender Kraft durchgeführt wird, so dass die gerissene Membran die Mikropipette nicht verstopft und keinen beträchtlichen Teil der Membran oder sogar der Zelle anzieht.
17. Überprüfen Sie das verwendete Handbuch für die Systemeinstellungen. Mit der Software (siehe Materialtabelle) können Sie den Serienwiderstand (SR) und die Ganzzellkapazität (wcc) digital überprüfen und berechnen.
18. Aktivieren Sie im Voltage-Clamp-Modus nach dem Aufbrechen der Zellmembran die Option "Gesamte Zelle" und klicken Sie auf den Befehl Auto, der sich auf die Registerkarte "Gesamte Zelle" bezieht. Die SR und WCC der Zelle werden automatisch berechnet und sofort von der Software angezeigt. Diese Parameter können auch überprüft werden, indem der Membrantest mit dem in der Materialtabelle³³ genannten Verstärker durchgeführt wird.
19. Stellen Sie sicher, dass Sie die Parameter der Zellviabilität überprüfen. Überprüfen Sie bei Kisspeptin-Neuronen, ob die elektrophysiologischen Messungen wie folgt sind: SR < 25 mΩ, Eingangswiderstand > 0,3 GΩ und Haltestrom Absolutwert < 30 pA (persönliche Beobachtungen und Referenz²¹). Der Mittelwert des WCC von AVPV/PeN-Kisspeptin- oder^{ARH-Kisspeptin-Neuronen} beträgt ≈ 10-12 pF in Gonaden-intakten Mäusen²⁰.
20. Überwachen Sie die SR und die stationäre Kapazität der Zelle während der Experimente. Stellen Sie sicher, dass sich der SR während einer Aufnahme nicht um mehr als 20 % ändert und dass die Membrankapazität stabil ist.
21. Überprüfen Sie die Softwareeinstellungen. Erstellen Sie spezifische Protokolle für die Aufzeichnungen, je nach Art des Experiments. Um das Membranpotential im Stromzangenmodus mit den in der Materialtabelle genannten Geräten aufzuzeichnen, filtern Sie die elektrophysiologischen Signale bei 2-4 kHz im Tiefpass und analysieren Sie die Ergebnisse offline in einer Software (Softwareinformationen finden Sie in der Materialtabelle ).
22. Sobald die Gesamtzellenkonfiguration korrekt erreicht ist, messen Sie die synaptischen Ströme im Voltage-Clamp-Modus (Abbildung 2G). Zeichnen Sie Änderungen des Ruhemembranpotentials (RMP) und der induzierten RMP-Variationen im Stromzangenmodus auf (Abbildung 2H). Veränderungen des RMP, wie z. B. die Depolarisation der Zellmembran, können durch die Verabreichung eines bekannten Arzneimittels/Neurotransmitters in das Bad (beschrieben in Schritt 3.2) induziert werden, wie in Abbildung 1 dargestellt.
    Anmerkungen: Im Stromzangenmodus kann positiver oder negativer Strom eingespeist werden, um die Membranspannung auf einer gewünschten Spannung zu halten. Für Kisspeptin-Neuronen setzen wir normalerweise Null-Strom-Injektion (I = 0), um die spontane Variation des Membranpotentials aufzuzeichnen.

Ergebnisse

Um die möglichen Auswirkungen von humanem rekombinantem Wachstumshormon (hGH) auf die Aktivität von hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen zu untersuchen, führten wir Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitungen in Hirnschnitten durch und untersuchten, ob dieses Hormon akute Veränderungen in der Aktivität von AVPV/PeN-Kisspeptin- und^{ARH-Kisspeptin-Neuronen} verursacht. In dieser Studie wurden adulte weibliche (Diestrus-Stadium) und männliche Kiss1-Cre/GFP-Mäuse³⁶ verwendet. Für die...

Diskussion

Die Entwicklung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik hatte einen erheblichen Einfluss auf die wissenschaftliche Gemeinschaft, da sie als von größter Bedeutung für die Entwicklung der wissenschaftlichen Forschung angesehen wurde und mehrere Entdeckungen ermöglichte. Ihr Einfluss auf die Wissenschaft reichte aus, um 1991 mit dem Nobelpreis für Medizin zu kulminieren, da diese Entdeckung die Tür zu einem besseren Verständnis der Funktionsweise von Ionenkanälen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen sowie z...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP	Sigma Aldrich/various	A9187
CaCl2	Sigma Aldrich/various	C7902
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich/various	G7021
EGTA	Sigma Aldrich/various	O3777
HEPES	Sigma Aldrich/various	H3375
KCL	Sigma Aldrich/various	P5405
K-gluconate	Sigma Aldrich/various	G4500
KOH	Sigma Aldrich/various	P5958
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M9272
MgSO4	Sigma Aldrich/various	230391
NaCl	Sigma Aldrich/various	S5886
NaH2PO4	Sigma Aldrich/various	S5011
NaHCO3	Sigma Aldrich/various	S5761
nitric acid	Sigma Aldrich/various	225711	CAUTION
Sucrose	Sigma Aldrich/various	S1888
Equipments
Air table	TMC	63-534
Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Computer	various	-
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM	Molecular Devices	DD1440
Digital peristaltic pump	Ismatec	ISM833C
Faraday cage	TMC	81-333-03
Imaging Camera	Leica	DFC 365 FX
Micromanipulator	Sutter Instruments	Roe-200
Micropipette Puller	Narishige	PC-10
Microscope	Leica	DM6000 FS
Osteotome	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	128
Recovery chamber	Warner Instruments/Harvard apparatus	-	can be made in-house
Recording chamber	Warner Instruments	640277
Spatula	Fisher Scientific /various	FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome	Leica	VT1000 S
Water Bath	Fisher Scientific /various	Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software	Molecular Devices	-	Commander Software
LAS X wide field system	Leica	-	Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B	Molecular Devices	MULTICLAMP 700B	Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS	Molecular Devices	Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm	Warner Instruments	64-1309
Curved hemostatic forcep	various	-
cyanoacrylate glue	LOCTITE/various	-
Decapitation scissors	various	-
Filter paper	various	-
Glass capillaries (micropipette)	World Precision Instruments, Inc	TW150F-4
Iris scissors	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	65-66
Pasteur glass pipette	Sigma Aldrich/various	CLS7095B9-1000EA
Petri dish	various	-
Polyethylene tubing	Warner Instruments	64-0756
Razor blade for brain dissection	TED PELLA	TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome	TED PELLA	TEDP-121-9
Scissors	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	71-72, 48,49;
silicone teat	various	-
Slice Anchor	Warner Instruments	64-0246
Syringe filters	Merck Millipore Ltda	SLGVR13SL	Millex-GV 0.22 μm
Tweezers	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	131, 1518