Neurônios Kisspeptin Hipotalâmicos como Alvo para Gravações de Patch-Clamp de Células Inteiras

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar um patch-clamp de células inteiras em fatias cerebrais contendo neurônios de kisspeptina, o principal modulador das células do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH). Ao agregar conhecimento sobre a atividade neuronal da kisspeptina, essa ferramenta eletrofisiológica tem servido de base para avanços significativos no campo da neuroendocrinologia nos últimos 20 anos.

Resumo

As kisspeptinas são essenciais para a maturação do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (HPG) e fertilidade. Os neurônios kisspeptina hipotalâmicos, localizados no núcleo periventricular anteroventral e no núcleo periventricular rostral, bem como o núcleo arqueado do hipotálamo, projetam-se para neurônios do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH), entre outras células. Estudos anteriores demonstraram que a sinalização da kisspeptina ocorre através do receptor Kiss1 (Kiss1r), excitando a atividade do neurônio de GnRH. Em humanos e modelos animais experimentais, as kisspeptinas são suficientes para induzir a secreção de GnRH e, consequentemente, a liberação de hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo estimulante (FSH). Uma vez que as kisspeptinas desempenham um papel essencial nas funções reprodutivas, os pesquisadores estão trabalhando para avaliar como a atividade intrínseca dos neurônios hipotalâmicos da kisspeptina contribui para ações relacionadas à reprodução e identificar os neurotransmissores/neuromoduladores primários capazes de alterar essas propriedades. A técnica de patch-clamp de células inteiras tornou-se uma ferramenta valiosa para investigar a atividade de neurônios de kisspeptina em células de roedores. Esta técnica experimental permite aos pesquisadores registrar e medir correntes iônicas excitatórias e inibitórias espontâneas, potencial de membrana de repouso, disparo de potencial de ação e outras propriedades eletrofisiológicas das membranas celulares. No presente estudo, aspectos cruciais da técnica de patch-clamp de células inteiras, conhecida como medidas eletrofisiológicas que definem os neurônios hipotalâmicos da kisspeptina, e uma discussão de questões relevantes sobre a técnica são revistos.

Introdução

Hodgkin e Huxley fizeram o primeiro registro intracelular de um potencial de ação descrito em vários estudos científicos. Este registro foi realizado no axônio da lula, que tem um grande diâmetro (~500 μm), permitindo que um microeletrodo seja colocado dentro do axônio. Este trabalho proporcionou grandes possibilidades para a pesquisa científica, culminando posteriormente com a criação do modo tensão-pinça, que foi utilizado para estudar a base iônica da geração do potencial de ação 1,2,3,4,5,6,7,8. Com o passar dos anos, a técnica foi se aprimorando, tornando-se amplamente aplicada em pesquisas^{científicas6,9}. A invenção da técnica patch-clamp, ocorrida no final da década de 1970 por meio de estudos iniciados por Erwin Neher e Bert Sakmann, permitiu aos pesquisadores registrar canais iônicos únicos e potenciais ou correntes de membrana intracelular em praticamente todos os tipos celulares utilizando apenas um eletrodo 9,10,11,12. Os registos de patch-clamp podem ser feitos numa variedade de preparações de tecidos, tais como células cultivadas ou cortes de tecido, quer em modo voltage-clamp (mantendo a membrana celular a uma tensão definida que permite o registo, por exemplo, de correntes dependentes de voltagem e correntes sinápticas) quer em modo corrente-clamp (permitindo o registo de, por exemplo, alterações no potencial de membrana de repouso induzidas por correntes iónicas, potenciais de ação e frequência potencial pós-sináptico).

O uso da técnica patch-clamp possibilitou várias descobertas notáveis. De fato, os achados seminais sobre as propriedades eletrofisiológicas dos neurônios kisspeptina hipotalâmico localizados nos núcleos periventricular anteroventral e periventricular rostral (VPVV/PeN Kisspeptina), também conhecidos como área periventricular rostral do terceiro ventrículo (RP3V), e núcleo arqueado do hipotálamo (ARH^kisspeptina)^13,14,15 são de particular interesse. Em 2010, Ducret e colaboradores realizaram os primeiros registros de neurônios de^KisspeptinAVPV/PeN em camundongos usando outra ferramenta eletrofisiológica, a técnica de patch-clamp de células soltas. Esses estudos forneceram uma descrição elétrica dos neurônios^Kisspeptin AVPV/PeN e demonstraram que seus padrões de disparo são dependentes do ciclo estral¹⁶. Em 2011, Qiu e col. utilizaram a técnica de patch-clamp de células inteiras para demonstrar que os neurônios da^kisspeptina ARH expressam correntes endógenas de marcapasso¹⁷. Posteriormente, Gottsch e col. mostraram que os neurônios kisspeptin exibem atividade espontânea e expressam correntes de cálcio do tipo h (marca-passo) e do tipo T, sugerindo que os neurônios da^kisspeptina ARH compartilham propriedades eletrofisiológicas com outros neurônios marca-passo do sistema nervoso^central18. Além disso, foi demonstrado que os neurônios da kisspeptina ARH exibem taxas de disparo sexualmente dimórficas e que os neurônios da^Kisspeptina AVPV/PeN exibem um potencial de membrana de repouso (RMP) bimodal influenciado por canais de potássio sensíveis ao ATP (K_ATP)^19,20. Além disso, foi estabelecido que os esteroides gonadais afetam positivamente a atividade elétrica espontânea dos neurônios kisspeptin em camundongos 19,20,21. São citados os primeiros trabalhos que estudam as propriedades eletrofisiológicas dos neurônios kisspeptina 16,17,18,19,20. Desde então, muitos estudos têm utilizado a técnica de patch-clamp de células inteiras para demonstrar quais fatores/neuromoduladores são suficientes para modular a atividade elétrica dos neurônios kisspeptin (Figura 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,^31,32.

Dada a importância dessa técnica para o estudo dos neurônios necessários para a reprodução, entre outros tipos celulares não abordados aqui, este artigo descreve os passos básicos para o desenvolvimento da técnica de patch-clamp de células inteiras, como preparar as soluções, dissecar e fatiar o cérebro e realizar o selamento da membrana celular para registros. Além disso, questões relevantes sobre a técnica são discutidas, como suas vantagens, limitações técnicas e variáveis importantes que devem ser controladas para um ótimo desempenho experimental.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Animais do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo e foram realizados de acordo com as diretrizes éticas adotadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal.

1. Preparação das soluções

1. Preparação da solução interna
   NOTA: A solução interna preenche a micropipeta patch-clamp e entrará em contato com o interior da célula (veja um exemplo na Figura 2). As soluções internas podem variar dependendo do tipo de atividade a ser medida³³.
   1. Escolha a solução interna considerando sua finalidade experimental e o tipo de registro apropriado. Para registrar o potencial de membrana no modo de fixação de corrente, use a solução interna composta por 120 mM K-gluconato, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl₂, 3 mM KOH, 10 mM KCl e 4 mM (Mg)-ATP. Pesar todos os sais de acordo com o volume final desejado, conforme indicado na Tabela 1.
   2. Utilizar água deionizada suficiente para atingir 90% do volume final da solução. Esse volume garantirá espaço suficiente para ajustar o pH e a osmolaridade.
   3. Depois de adicionar e misturar todos os ingredientes completamente, ajuste o pH para 7,2-7,3 com 5 M KOH usando um medidor de pH. Use um osmômetro para verificar a osmolaridade, que deve estar em torno de 275-280 mOsm (ajuste, se necessário, apenas para baixo).
   4. Preparar a solução interna com antecedência e conservar a 8 °C. Adicione o ATP no dia do experimento. Conservar a solução interna contendo ATP a -20 °C (alíquotas de 1 ml) durante 3-4 meses.
2. Preparação da solução de fatiamento
   1. Preparar solução de fatiamento contendo 238 mM de sacarose, 2,5 mM de KCl, 26 mM de NaHCO₃, 1,0 mM de NaH 2 PO₄, 10 mM de glicose, 1,0 mM de CaCl 2 e 5,0 mM de MgCl₂. Pesar todos os sais de acordo com o volume final desejado, conforme mostra a Tabela 2. O volume exato desta solução a ser preparada dependerá do tamanho da câmara de corte.
   2. Ao misturar todos os sais em água deionizada, saturar constantemente com carbogênio (95% O 2 e 5% CO₂). Conecte tubos de polietileno (1,57 mm de diâmetro externo [OD] x 1,14 mm de diâmetro interno [ID]) a um cilindro de carbogênio para fornecer carbogênio à solução de fatiamento. Segure a extremidade aberta do tubo dentro do copo que contém a solução de fatiamento.
   3. Depois de misturar bem todos os ingredientes, ajuste o pH para 7,3 com 10% de ácido nítrico usando um medidor de pH. Use um osmômetro para verificar a osmolaridade, que deve ser de 290-295 mOsm (ajuste, se necessário, apenas para baixo). Depois, arrefecer a solução a 0-2 °C.
3. Preparar solução aCSF para gravações
   1. Preparar solução artificial de líquido cefalorraquidiano (aCSF) para gravações contendo NaCl 124 mM, KCl 2,8 mM, NaHCO₃ 26 mM, NaH 2 PO 4 1,25 mM, MgSO₄ mM, glicose 5 mM e CaCl 2_2,5mM. Pesar todos os sais de acordo com o volume final desejado, indicado na Tabela 3.
   2. Ao misturar todos os sais em água deionizada, saturar constantemente com carbogênio (95% O 2 e 5% CO 2), conforme descrito na etapa 1.2.2.
   3. Depois de adicionar e misturar todos os ingredientes, ajuste o pH para 7,3 (10% de ácido nítrico pode ser usado) usando um medidor de pH. Use um osmômetro para verificar a osmolaridade, que deve ser de 290-300 mOsm. Depois, despeje o aCSF em um copo e mantenha em banho-maria a 30 °C.

2. Dissecção e fatiamento cerebral

NOTA: Como diferentes estruturas cerebrais podem exigir cortes em diferentes planos (cortes coronais, sagitais ou horizontais), a abordagem exata para a obtenção dos cortes depende da região cerebral de interesse. Tipicamente, estudar as células que expressam Kiss1 no AVPV/PeN e ARH (aqui denominados como neurônios AVPV/PeN^Kisspeptin e neurônios ARH^kisspeptin; Figura 2A,B), cortes cerebrais coronais (200-300 μm) são usualmente confeccionados 17,19,20,21,34. Os neurônios^Kisspeptin AVPV/PeN estão localizados a aproximadamente 0,5 a -0,22 mm do bregma, enquanto os neurônios ARH^kisspeptin estão em -1,22 a -2,70 mm. A localização dos núcleos pode ser determinada usando um atlas estereotáxico do cérebro de camundongo³⁵ ou o Allen Mouse Brain Reference Atlas (http://mouse.brain-map.org/). Camundongos adultos Kiss1-Cre/GFP fêmeas (estádio diestro) e machos³⁶ foram utilizados neste estudo.

1. Remoção do cérebro
   1. Prepare o local da dissecção e as ferramentas necessárias para extrair o cérebro: tesoura de decapitação, tesoura de íris, tesoura curva de Castroviejo, osteótomo, pinça, espátula, papel de filtro, placa de Petri, lâmina de barbear e cola de cianoacrilato.
   2. Antes de fazer os cortes, prepare a bancada na qual será realizada a dissecção, pois todos os procedimentos subsequentes devem ser realizados rapidamente. Certifique-se de ter acesso a um dispositivo de fatiamento, como um vibratome.
   3. Prepare uma câmara de gravação para manter as fatias cerebrais antes de cortar o tecido. Adquira uma câmara de gravação, dimensões de banho de 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x W x H), de uma marca comercial (Tabela de Materiais) ou faça uma in-house.
      NOTA: Uma câmara de recuperação interna pode ser fabricada da seguinte forma: corte uma placa de 24 poços para que nove poços estejam disponíveis. Cole uma tela de nylon na base dos nove poços. Com o restante da placa do poço, faça uma base para que a parte inferior do nylon fique livre. Essa base adaptada pode ser colocada dentro de um copo de 500 mL contendo o aCSF (Figura 1 Suplementar).
   4. Após o preparo tudo, anestesiar o animal com anestésico inalatório com isoflurano a 4%-5%. A anestesia deve estar de acordo com um protocolo aprovado pelo comitê de ética. Logo após o animal ficar imóvel, realize testes de pinça da cauda e da pata para garantir que o animal esteja profundamente anestesiado.
   5. Decapite rapidamente os ratos enquanto o coração ainda está ativo para aumentar a viabilidade celular. Colha o cérebro rapidamente após a decapitação.
   6. Com a tesoura cirúrgica, faça uma incisão na pele na parte superior do crânio do animal, de caudal a rostral, e retire o couro cabeludo da cabeça do animal. Em seguida, cortar a placa interparietal ao longo da sutura sagital com a tesoura da íris e remover o osso occipital. Deslize o osteótomo sob o osso parietal e retire-o suavemente até que o cérebro fique exposto.
   7. Depois de expor o cérebro, vire a cabeça de cabeça para baixo, abaixe suavemente o cérebro para visualizar o nervo trigêmeo de cada lado e, em seguida, corte o nervo trigêmeo usando uma tesoura curva de Castroviejo. Depois de visualizar o hipotálamo, identifique o nervo óptico e corte-o suavemente.
      NOTA: Tenha cuidado ao cortar o nervo óptico, pois puxá-lo rasgará a área hipotalâmica adjacente que contém o núcleo da VPV/PeN.
   8. Corte a porção mais anterior do lobo frontal e remova o cérebro completamente. Mergulhe imediatamente o cérebro na solução de fatiamento até adquirir as fatias.
2. Fatiamento de amostras cerebrais
   1. Coloque o cérebro em papel filtro (apoiado em uma placa de Petri) para secar o excesso de solução. Em seguida, com uma lâmina de barbear cortante afiada, execute um corte coronal separando o tronco cerebral com o cerebelo do resto do tecido.
   2. Em seguida, cole a porção caudal do cérebro na base do vibratomo e preencha a câmara do dispositivo de fatiamento com a solução de fatiamento/aCSF resfriada a 0-2 °C. Durante o procedimento, coloque gelo seco ao redor da câmara vibratória para manter a solução de fatiamento fria.
   3. Insira a lâmina de barbear no vibratomo e defina os parâmetros de corte apropriados do dispositivo: velocidade = 3, frequência = 9 e alimentação = 250 μm. Utilizar uma pipeta de transferência acrílica (pipeta de vidro Pasteur invertida acoplada a um teto de silicone) para transferir os cortes para a câmara de recuperação (descrita no passo 2.1.3) durante o procedimento de fatiamento do tecido. Aguarde 60 min para recuperação do tecido após a aquisição do corte.

3. Vedação de células para gravação

1. Certifique-se de que todos os equipamentos (microscópio, amplificador, digitalizador, micromanipulador e outros) estejam ligados antes de iniciar a gravação.
2. Preencher a câmara de gravação, de marca comercial (Tabela de Materiais), acoplada ao microscópio com a solução de aCSF para gravações. Use uma bomba de perfusão para perfundir constantemente o aCSF a uma taxa de 2 mL/min.
3. Transfira uma fatia cerebral de interesse (uma de cada vez) para a câmara de gravação. Use uma pipeta de transferência de acrílico (pipeta de vidro Pasteur invertida acoplada a um teto de silicone) para transferir as fatias hipotalâmicas para a câmara. Use uma âncora de corte (Tabela de Materiais) para segurar a fatia para que ela não se mova durante a perfusão do aCSF.
4. Coloque uma fatia no centro da câmara de gravação conectada ao microscópio. A posição do corte é fundamental para permitir uma boa visualização da região desejada sob o microscópio e para um perfeito alcance da micropipeta de registro.
5. Use a lente objetiva de baixa potência de um microscópio de imersão (10x ou 20x) para auxiliar no posicionamento do corte e na localização da região de interesse.
6. Após localizar a região de interesse, alternar a lente objetiva para a lente de alta potência (63x) e focalizar o nível tecidual, observando a proteína fluorescente endógena e as formas das células na região alvo para localizar as células kisspeptina na superfície do corte cerebral²⁰.
7. Quando uma possível célula de destino estiver localizada, marque-a na tela do computador com o cursor do mouse ou desenhando um formato, como um quadrado, sobre a área de interesse. A marca de tela do computador ajuda a guiar a posição da micropipeta de gravação para a célula.
8. Depois de determinar a localização exata da célula alvo, levante a objetiva e introduza a micropipeta de gravação preenchida com a solução interna. Ao colocar a micropipeta no suporte do eletrodo, verifique se a solução interna está em contato com o eletrodo de prata.
   NOTA: Para a preparação, colocação e posicionamento da micropipeta no suporte do eletrodo, consulte^{o item 33}.
9. Aplicar pressão positiva antes de submergir a micropipeta na solução de aCSF, para evitar a entrada de detritos na micropipeta, utilizando uma seringa de 1-3 mL cheia de ar conectada ao suporte da micropipeta através de uma tubulação de polietileno (≈130 cm mais longa); aplicar cerca de 100-200 μL de ar.
10. Usando o micromanipulador, guie a micropipeta abaixo do centro da objetiva. Mova os botões do micromanipulador para guiar a micropipeta no eixo X-Y-Z em direção à célula de interesse.
11. Ajuste o foco para ver a ponta da micropipeta e aproxime o foco, mas não muito perto, da fatia. Reduza a velocidade do micromanipulador e abaixe lentamente a micropipeta para o plano de foco. Certifique-se de que a ponta da micropipeta não penetre abruptamente na fatia, mas desca lentamente até tocar a superfície da célula/região alvo.
12. Aplicar pressão positiva leve (≈100 μL) com a seringa de 1-3 mL cheia de ar conectada ao suporte da micropipeta para remover quaisquer detritos do caminho de aproximação.
13. Concentre-se na célula alvo e mova lentamente o micromanipulador no eixo X-Y-Z para aproximar a micropipeta da célula alvo. Ao tocar a micropipeta na célula, observa-se uma covinha causada pela pressão aplicada através da ponta da micropipeta (Figura 2C).
14. Após a formação da fossa, devido à proximidade da micropipeta com a célula, aplicar sucção fraca e breve pela boca (1-2 s) através do tubo conectado ao suporte da micropipeta para gerar a vedação entre a micropipeta e a célula (selo gigaohm ou gigaseal >1 GΩ; Figura 2D). Para formar o selo, use o modo de fixação de tensão no software. Para detalhes sobre a formação do selo, consulte³³.
15. Se a vedação permanecer estável (a vedação gigaohm deve ser mecanicamente estável e sem interferência de ruído, determinada pela observação por cerca de 1 min), ajuste a tensão de retenção no potencial de repouso fisiológico mais próximo da célula de interesse. Para neurônios hipotalâmicos kisspeptin, -50 mV é recomendado.
16. Aplicar breve sucção por via oral (pressão negativa) com a micropipeta selada à célula para romper a membrana plasmática (Figura 2E). A configuração adequada de célula inteira é alcançada quando a sucção é realizada com força suficiente para que a membrana rompida não obstrua a micropipeta e não atraia uma porção considerável da membrana ou mesmo da célula.
17. Verifique o manual de configurações do sistema usado. Use o software (consulte Tabela de Materiais) para verificar e calcular digitalmente a resistência em série (SR) e a capacitância de célula inteira (wcc).
18. No modo de fixação de tensão, depois de quebrar a membrana celular, ative a opção de célula inteira e clique no comando Auto referente à guia de célula inteira. O SR e o wcc da célula serão calculados automaticamente e exibidos instantaneamente pelo software. Esses parâmetros também podem ser verificados através da realização do teste de membrana com o amplificador mencionado na Tabela de Materiais³³.
19. Certifique-se de verificar os parâmetros de viabilidade celular. Para os neurônios da kisspeptina, verificar se as medidas eletrofisiológicas são: SR < 25 mΩ, resistência de entrada > 0,3 GΩ e mantendo o valor absoluto da corrente < 30 pA (observações pessoais e referência²¹). O valor médio do wcc dos neurônios AVPV/PeN kisspeptin ou ARH^kisspeptin é ≈ 10-12 pF em camundongos gônadas intactos²⁰.
20. Monitorar o SR e a capacitância em estado estacionário da célula durante os experimentos. Certifique-se de que o SR não mude mais de 20% durante uma gravação e que a capacitância da membrana seja estável.
21. Verifique as configurações do software. Criar protocolos específicos para as gravações de acordo com o tipo de experimento. Para registrar o potencial de membrana no modo corrente-pinça, com os equipamentos mencionados na Tabela de Materiais, filtre passa-baixa os sinais eletrofisiológicos em 2-4 kHz e analise os resultados off-line em um software (consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre o software).
22. Uma vez que a configuração de célula inteira esteja adequadamente alcançada, meça as correntes sinápticas no modo de pinça de tensão (Figura 2G). Registrar alterações no potencial de membrana de repouso (RMP) e variações induzidas de RMP no modo de pinça de corrente (Figura 2H). Alterações no PGR, como a despolarização da membrana celular, podem ser induzidas pela administração de um medicamento/neurotransmissor conhecido ao banho (descrito no passo 3.2), conforme ilustrado na Figura 1.
    NOTA: No modo de fixação de corrente, a corrente positiva ou negativa pode ser injetada para manter a tensão da membrana em uma tensão desejada. Para os neurônios de kisspeptina, geralmente definimos a injeção de corrente zero (I = 0) para registrar a variação espontânea do potencial de membrana.

Resultados

Para estudar os possíveis efeitos do hormônio de crescimento recombinante humano (hGH) sobre a atividade dos neurônios hipotalâmicos kisspeptina, realizamos registros de patch-clamp de células inteiras em fatias cerebrais e avaliamos se esse hormônio causa alterações agudas na atividade dos neurônios de^kisspeptina AVPV/PeN e ARH^kisspeptina. Camundongos adultos Kiss1-Cre/GFP fêmeas (estádio diestro) e machos³⁶ foram utilizados neste estudo. Animais gônadas intacto...

Discussão

O desenvolvimento da técnica de patch-clamp de células inteiras teve um impacto significativo na comunidade científica, sendo considerada de suma importância para o desenvolvimento de pesquisas científicas e possibilitando diversas descobertas. Seu impacto na ciência foi suficiente para culminar com o Prêmio Nobel de Medicina em 1991, pois essa descoberta abriu as portas para uma melhor compreensão do funcionamento dos canais iônicos em condições fisiológicas e patológicas, bem como a identificação de pote...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP	Sigma Aldrich/various	A9187
CaCl2	Sigma Aldrich/various	C7902
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich/various	G7021
EGTA	Sigma Aldrich/various	O3777
HEPES	Sigma Aldrich/various	H3375
KCL	Sigma Aldrich/various	P5405
K-gluconate	Sigma Aldrich/various	G4500
KOH	Sigma Aldrich/various	P5958
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M9272
MgSO4	Sigma Aldrich/various	230391
NaCl	Sigma Aldrich/various	S5886
NaH2PO4	Sigma Aldrich/various	S5011
NaHCO3	Sigma Aldrich/various	S5761
nitric acid	Sigma Aldrich/various	225711	CAUTION
Sucrose	Sigma Aldrich/various	S1888
Equipments
Air table	TMC	63-534
Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Computer	various	-
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM	Molecular Devices	DD1440
Digital peristaltic pump	Ismatec	ISM833C
Faraday cage	TMC	81-333-03
Imaging Camera	Leica	DFC 365 FX
Micromanipulator	Sutter Instruments	Roe-200
Micropipette Puller	Narishige	PC-10
Microscope	Leica	DM6000 FS
Osteotome	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	128
Recovery chamber	Warner Instruments/Harvard apparatus	-	can be made in-house
Recording chamber	Warner Instruments	640277
Spatula	Fisher Scientific /various	FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome	Leica	VT1000 S
Water Bath	Fisher Scientific /various	Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software	Molecular Devices	-	Commander Software
LAS X wide field system	Leica	-	Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B	Molecular Devices	MULTICLAMP 700B	Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS	Molecular Devices	Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm	Warner Instruments	64-1309
Curved hemostatic forcep	various	-
cyanoacrylate glue	LOCTITE/various	-
Decapitation scissors	various	-
Filter paper	various	-
Glass capillaries (micropipette)	World Precision Instruments, Inc	TW150F-4
Iris scissors	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	65-66
Pasteur glass pipette	Sigma Aldrich/various	CLS7095B9-1000EA
Petri dish	various	-
Polyethylene tubing	Warner Instruments	64-0756
Razor blade for brain dissection	TED PELLA	TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome	TED PELLA	TEDP-121-9
Scissors	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	71-72, 48,49;
silicone teat	various	-
Slice Anchor	Warner Instruments	64-0246
Syringe filters	Merck Millipore Ltda	SLGVR13SL	Millex-GV 0.22 μm
Tweezers	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	131, 1518