נוירוני קיספפטין היפותלמיים כיעד להקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע מהדק טלאי של תאים שלמים על פרוסות מוח המכילות נוירוני קיספפטין, המודולטור העיקרי של תאי הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH). על ידי הוספת ידע על פעילות נוירוני קיספפטין, כלי אלקטרופיזיולוגי זה שימש בסיס להתקדמות משמעותית בתחום הנוירואנדוקרינולוגיה במהלך 20 השנים האחרונות.

Abstract

קיספפטינים חיוניים להבשלת ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-גונדל (HPG) ולפוריות. נוירוני קיספפטין היפותלמיים הממוקמים בגרעין הפריוונטריקולרי האנטרו-ונטרלי ובגרעין הפריוונטריקולרי הרוסטרלי, כמו גם בגרעין ארקואט של ההיפותלמוס, מקרינים לנוירונים משחררי הורמונים גונדוטרופינים (GnRH), בין תאים אחרים. מחקרים קודמים הראו כי איתות קיספפטין מתרחש דרך קולטן Kiss1 (Kiss1r), מה שבסופו של דבר מעורר פעילות נוירונים GnRH. בבני אדם ובמודלים ניסיוניים של בעלי חיים, קיספפטין מספיקים לגרימת הפרשת GnRH, וכתוצאה מכך, שחרור הורמון מחלמן (LH) והורמון ממריץ זקיקים (FSH). מאחר שקיספפטינים ממלאים תפקיד חיוני בתפקודי הרבייה, חוקרים עובדים כדי להעריך כיצד הפעילות הפנימית של נוירוני קיספפטין היפותלמיים תורמת לפעולות הקשורות לרבייה ולזהות את המוליכים העצביים/נוירומודולטורים העיקריים המסוגלים לשנות תכונות אלה. טכניקת הידוק המדבקים של כל התא הפכה לכלי רב ערך לחקר פעילות נוירוני קיספפטין בתאי מכרסמים. טכניקה ניסיונית זו מאפשרת לחוקרים להקליט ולמדוד זרמים יוניים מעוררים ומעכבים ספונטניים, פוטנציאל קרום מנוחה, ירי פוטנציאלי פעולה ותכונות אלקטרופיזיולוגיות אחרות של קרום התא. במחקר הנוכחי נסקרים היבטים מכריעים של טכניקת מהדק טלאי של כל התא, הידועה כמדידות אלקטרופיזיולוגיות המגדירות נוירונים קיספפטין היפותלמיים, ודיון בסוגיות רלוונטיות לגבי הטכניקה.

Introduction

הודג'קין והאקסלי ערכו את התיעוד התוך-תאי הראשון של פוטנציאל פעולה שתואר במספר מחקרים מדעיים. הקלטה זו בוצעה על אקסון הדיונון, בעל קוטר גדול (~500 מיקרומטר), המאפשר למקם מיקרואלקטרודה בתוך האקסון. עבודה זו סיפקה אפשרויות גדולות למחקר מדעי, שמאוחר יותר הגיע לשיאו ביצירת מצב מהדק מתח, ששימש לחקר הבסיס היוני של יצירת פוטנציאל פעולה 1,2,3,4,5,6,7,8. במהלך השנים, הטכניקה שופרה, והיא הפכה להיות מיושמת באופן נרחב במחקר מדעי ^6,9. המצאת טכניקת מהדק הטלאים, שהתרחשה בסוף שנות השבעים באמצעות מחקרים שיזמו ארווין נהר וברט סאקמן, אפשרה לחוקרים להקליט תעלות יונים בודדות ופוטנציאלים או זרמים של קרום תוך תאי כמעט בכל סוג של תא באמצעות אלקטרודה אחת בלבד 9,10,11,12. הקלטות מהדק טלאי יכולות להתבצע על מגוון תכשירי רקמות, כגון תאים בתרבית או פרוסות רקמה, במצב מהדק מתח (החזקת קרום התא במתח מוגדר המאפשר הקלטה, למשל, של זרמים תלויי מתח וזרמים סינפטיים) או במצב מהדק זרם (המאפשר הקלטה, למשל, של שינויים בפוטנציאל קרום המנוחה המושרה על ידי זרמי יונים, פוטנציאלי פעולה, ותדירות פוטנציאל פוסט-סינפטי).

השימוש בטכניקת מהדק הטלאי איפשר מספר תגליות בולטות. ואכן, הממצאים הראשוניים על התכונות האלקטרופיזיולוגיות של נוירוני קיספפטין היפותלמיים הממוקמים בגרעינים הפריוונטריקולריים האנטרו-ונטרליים (AVPV/PeN^Kisspeptin), הידוע גם בשם האזור הפרי-חדרי הרוסטרלי של החדר השלישי (RP3V), וגרעין הארקואט של ההיפותלמוס (ARH^kisspeptin)^13,14,15 הם בעלי עניין מיוחד. בשנת 2010, Ducret et al. ביצעו את ההקלטות הראשונות של נוירונים AVPV/PeN^Kisspeptinבעכברים באמצעות כלי אלקטרופיזיולוגי אחר, טכניקת מהדק טלאי תאים רופפים. מחקרים אלה סיפקו תיאור חשמלי של נוירוני^{קיספטין} AVPV/PeN והראו כי דפוסי הירי שלהם תלויים במחזור הייחום¹⁶. בשנת 2011, Qiu et al. השתמשו בטכניקת מהדק טלאי התא כולו כדי להדגים כי נוירוני^{קיספפטין} ARH מבטאים זרמי קוצב לב אנדוגניים¹⁷. לאחר מכן, גוטש ועמיתיו הראו כי נוירוני קיספפטין מפגינים פעילות ספונטנית ומבטאים הן זרמי סידן מסוג H (קוצב לב) והן זרמי סידן מסוג T, דבר המצביע על כך שנוירוני^{קיספפטין} ARH חולקים תכונות אלקטרופיזיולוגיות עם נוירוני קוצב אחרים של מערכת העצבים המרכזית¹⁸. בנוסף, הוכח כי נוירוני^{קיספפטין} ARH מפגינים קצבי ירי דימורפיים מינית וכי נוירוני^{קיספטין} AVPV/PeN מפגינים פוטנציאל קרום מנוחה בימודאלי (RMP) המושפע מתעלות אשלגן רגישות ל-ATP (K_ATP)^19,20. יתר על כן, נקבע כי סטרואידים גונדל משפיעים באופן חיובי על הפעילות החשמלית הספונטנית של נוירוני קיספפטין בעכברים 19,20,21. העבודות הראשונות החוקרות את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של נוירוני קיספפטין מוזכרות ^{16,17,18,19,20}. מאז, מחקרים רבים השתמשו בטכניקת מהדק טלאי של כל התא כדי להדגים אילו גורמים/נוירומודולטורים מספיקים כדי לווסת את הפעילות החשמלית של נוירוני קיספפטין (איור 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,^31,32.

בהתחשב בחשיבותה של טכניקה זו לחקר תאי עצב הדרושים להתרבות, בין סוגי תאים אחרים שאינם מכוסים כאן, מאמר זה מתאר את השלבים הבסיסיים לפיתוח טכניקת מהדק טלאי התא כולו, כגון הכנת התמיסות, ניתוח וחיתוך המוח, וביצוע אטימת קרום התא להקלטות. יתר על כן, נדונים נושאים רלוונטיים לגבי הטכניקה, כגון יתרונותיה, מגבלות טכניות ומשתנים חשובים שיש לשלוט בהם לביצוע ניסויי אופטימלי.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של המכון למדעים ביו-רפואיים באוניברסיטת סאו פאולו ובוצעו בהתאם להנחיות האתיות שאומצו על ידי המכללה הברזילאית לניסויים בבעלי חיים.

1. הכנת פתרונות

1. הכנת פתרון פנימי
   הערה: התמיסה הפנימית ממלאת את המיקרופיפטה המהדקה ובאה במגע עם פנים התא (ראו דוגמה באיור 2). הפתרונות הפנימיים עשויים להשתנות בהתאם לסוג הפעילות שיש למדוד³³.
   1. בחר את הפתרון הפנימי בהתחשב במטרה הניסיונית שלו ובסוג הרשומה המתאים. כדי לרשום את פוטנציאל הממברנה במצב מהדק זרם, השתמש בתמיסה הפנימית המורכבת מ 120 mM K-gluconate, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl₂, 3 mM KOH, 10 mM KCl ו- 4 mM (Mg)-ATP. שקלו את כל המלחים לפי הנפח הסופי הרצוי, כפי שניתן בטבלה 1.
   2. השתמש מספיק מים deionized כדי להגיע 90% מהנפח הסופי של התמיסה. נפח זה יבטיח מספיק מקום כדי להתאים את ה- pH ואת האוסמולריות.
   3. לאחר הוספה וערבוב יסודי של כל המרכיבים, התאימו את ה-pH ל-7.2-7.3 עם 5 M KOH באמצעות מד pH. השתמש אוסמומטר כדי לבדוק את האוסמולריות, אשר צריך להיות סביב 275-280 mOsm (להתאים, אם יש צורך, למטה בלבד).
   4. הכינו את התמיסה הפנימית מראש ואחסנו בטמפרטורה של 8 מעלות צלזיוס. הוסף את ה- ATP ביום הניסוי. אחסנו את התמיסה הפנימית המכילה ATP בטמפרטורה של -20°C (1 מ"ל aliquots) למשך 3-4 חודשים.
2. הכנת תמיסת חיתוך
   1. הכינו תמיסת חיתוך המכילה 238 mM סוכרוז, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 1.0 mM NaH 2 PO₄, 10 mM גלוקוז, 1.0 mM CaCl 2 ו-5.0 mM MgCl₂. שקלו את כל המלחים לפי הנפח הסופי הרצוי, כפי שמוצג בטבלה 2. הנפח המדויק של פתרון זה להיות מוכן יהיה תלוי בגודל של תא החיתוך.
   2. תוך ערבוב כל המלחים במים נטולי יונים, רוויים כל הזמן בקרבוגן (95% O 2 ו-5% CO₂). חבר צינורות פוליאתילן (קוטר חיצוני של 1.57 מ"מ [OD] x קוטר פנימי של 1.14 מ"מ [ID]) לגליל קרבוגן כדי לספק קרבוגן לתמיסת החיתוך. החזק את הקצה הפתוח של הצינור בתוך הכד המכיל את תמיסת החיתוך.
   3. לאחר ערבוב כל המרכיבים היטב, להתאים את ה- pH ל 7.3 עם 10% חומצה חנקתית באמצעות מד pH. השתמש אוסמומטר כדי לבדוק את האוסמולריות, אשר צריך להיות 290-295 mOsm (להתאים, במידת הצורך, למטה בלבד). לאחר מכן, מצננים את התמיסה ל 0-2 מעלות צלזיוס.
3. הכנת פתרון aCSF להקלטות
   1. הכן תמיסת נוזל שדרה מוחי מלאכותי (aCSF) להקלטות המכילות 124 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 1.25 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgSO₄, 5 mM גלוקוז ו- 2.5 mM CaCl₂. שקלו את כל המלחים לפי הנפח הסופי הרצוי, המופיע בטבלה 3.
   2. תוך ערבוב כל המלחים במים נטולי יונים, רווי כל הזמן בקרבוגן (95% O 2 ו-5% CO 2), כמתואר בשלב 1.2.2.
   3. לאחר הוספה וערבוב של כל המרכיבים, התאימו את ה-pH ל-7.3 (ניתן להשתמש ב-10% חומצה חנקתית) באמצעות מד pH. השתמש אוסמומטר כדי לבדוק את האוסמולריות, אשר צריך להיות 290-300 mOsm. לאחר מכן, לשפוך את aCSF בכוס ולשמור באמבט מים ב 30 ° C.

2. דיסקציה מוחית וחיתוך

הערה: מאחר שמבני מוח שונים עשויים לדרוש חיתוך במישורים שונים (פרוסות קורונליות, קשת או אופקיות), הגישה המדויקת להשגת הפרוסות תלויה באזור המעניין במוח. בדרך כלל, לחקור את התאים המבטאים Kiss1 בתאי AVPV/PeN ו-ARH (כאן נקובים כנוירוני קיספפטין AVPV/PeN ונוירוני^{קיספפטין} ARH; איור 2A,B), פרוסות מוח קורונליות (200-300 מיקרומטר) מיוצרות בדרך כלל 17,19,20,21,34. תאי העצב AVPV/PeN^Kisspeptin ממוקמים במרחק של כ-0.5 עד -0.22 מ"מ מהברגמה, בעוד שתאי העצב מסוג ARH^kisspeptin נמצאים במרחק של -1.22 עד -2.70 מ"מ. ניתן לקבוע את מיקום הגרעינים באמצעות אטלס מוח סטריאוטקסי^{של עכבר 35} או אטלס ייחוס המוח של עכבר אלן (http://mouse.brain-map.org/). במחקר זה נעשה שימוש בנקבת Kiss1-Cre/GFP בוגרת (שלב הדיזטרוס) ובעכברים זכרים³⁶.

1. הסרת מוח
   1. הכינו את אתר הדיסקציה ואת הכלים הדרושים לחילוץ המוח: מספריים לעריפת ראש, מספריים של קשתית, מספריים מעוקלים של Castroviejo, אוסטאוטום, פינצטה, מרית, נייר פילטר, צלחת פטרי, סכין גילוח ודבק ציאנואקרילט.
   2. לפני ביצוע הפרוסות, להכין את הספסל שבו הדיסקציה תבוצע, כמו כל ההליכים הבאים חייב להתבצע במהירות. ודא שיש לך גישה למכשיר חיתוך כגון ויברטום.
   3. הכינו תא הקלטה כדי לשמור על פרוסות המוח לפני חיתוך הרקמה. לרכוש תא הקלטה, מידות אמבטיה של 24 מ"מ x 15 מ"מ x 2 מ"מ (l x w x h), ממותג מסחרי (טבלה של חומרים) או לעשות אחד בבית.
      הערה: ניתן לייצר תא התאוששות פנימי באופן הבא: לחתוך צלחת 24 בארות כך תשע בארות זמינות. הדביקו מסך ניילון לבסיס תשע הבארות. עם שאר צלחת הבאר, לעשות בסיס כך החלק התחתון של הניילון הוא חופשי. הבסיס המותאם הזה יכול להיות ממוקם בתוך של 500 מ"ל שמכילה את ה-aCSF (איור משלים 1).
   4. לאחר הכנת הכל, להרדים את בעל החיים עם הרדמה בשאיפה באמצעות 4%-5% isoflurane. ההרדמה צריכה להיות בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה. זמן קצר לאחר שבעל החיים אינו נייד, בצעו בדיקות צביטת זנב וכפה כדי לוודא שבעל החיים מורדם עמוק.
   5. ערפו במהירות את ראשיהם של העכברים בזמן שהלב עדיין פעיל כדי להגביר את יכולת הקיום של התא. קצרו את המוח במהירות לאחר עריפת ראשכם.
   6. בעזרת מספריים כירורגיים, בצע חתך בעור בחלק העליון של גולגולת החיה, מהקאודל לרוסטרל, והסר את הקרקפת מראשה של החיה. לאחר מכן, לחתוך את הצלחת interparietal לאורך תפר sagittal עם מספריים הקשתית ולהסיר את עצם העורף. החליקו את האוסטאוטום מתחת לעצם הקודקוד ומשכו אותו החוצה בעדינות עד שהמוח נחשף.
   7. לאחר חשיפת המוח, הפוך את הראש, הורד בעדינות את המוח כדי לדמיין את העצב הטריגמינלי בכל צד, ואז חתוך את העצב הטריגמינלי באמצעות מספריים מעוקלים Castroviejo. לאחר הדמיה של ההיפותלמוס, זהה את עצב הראייה וחתך אותו בעדינות.
      הערה: היזהר בעת חיתוך עצב הראייה, שכן משיכה שלו תקרע את אזור ההיפותלמוס הסמוך המכיל את גרעין AVPV/PeN.
   8. לחתוך את החלק הקדמי ביותר של האונה הקדמית ולהסיר את המוח לחלוטין. מיד לטבול את המוח בתמיסת חיתוך עד רכישת פרוסות.
2. חיתוך דגימות מוח
   1. הניחו את המוח על נייר פילטר (נתמך על צלחת פטרי) כדי לייבש את התמיסה העודפת. לאחר מכן, עם סכין גילוח חיתוך חד, לבצע חתך העטרה המפריד את גזע המוח עם המוח הקטן משאר הרקמה.
   2. לאחר מכן, הדביקו את החלק הקאודלי של המוח לבסיס הוויברטום ומלאו את החדר של מכשיר החיתוך בתמיסת החיתוך/aCSF מקוררת ל-0-2 מעלות צלזיוס. במהלך ההליך, ארזו קרח יבש סביב תא הוויברטומה כדי לשמור על תמיסת החיתוך קרה.
   3. הכנס את סכין הגילוח לוויברטום והגדר את פרמטרי החיתוך המתאימים של המכשיר: מהירות = 3, תדר = 9 והזנה = 250 מיקרומטר. השתמש בפיפטת העברה אקרילית (פיפטה הפוכה מזכוכית פסטר המחוברת לטיט סיליקון) כדי להעביר את הפרוסות לתא ההתאוששות (המתואר בשלב 2.1.3) במהלך הליך חיתוך הרקמות. המתן 60 דקות לשחזור רקמות לאחר רכישת הפרוסה.

3. איטום תאים להקלטה

1. ודא שכל חלקי הציוד (מיקרוסקופ, מגבר, דיגיטציה, מיקרומניפולטור ואחרים) מופעלים לפני תחילת ההקלטה.
2. ממלאים את תא ההקלטה, של מותג מסחרי (Table of Materials), המחובר למיקרוסקופ בתמיסת aCSF להקלטות. השתמש במשאבת זילוח כדי לנקב כל הזמן את aCSF בקצב של 2 מ"ל / דקה.
3. העבירו פרוסת מוח מעניינת (אחת בכל פעם) לתא ההקלטה. השתמשו בפיפטת העברה אקרילית (פיפטה הפוכה מזכוכית פסטר המחוברת לטיט סיליקון) כדי להעביר את פרוסות ההיפותלמוס לתא. השתמשו בעוגן פרוסה (רשימת חומרים) כדי להחזיק את הפרוסה כך שהיא לא תזוז במהלך זילוח aCSF.
4. מניחים פרוסה במרכז תא ההקלטה המחוברת למיקרוסקופ. מיקום הפרוסה הוא קריטי כדי לאפשר תצוגה טובה של האזור הרצוי מתחת למיקרוסקופ ולהגעה מושלמת של מיקרופיפטת ההקלטה.
5. השתמש בעדשה אובייקטיבית בעוצמה נמוכה של מיקרוסקופ טבילה (10x או 20x) כדי לסייע במיקום הפרוסה ואיתור אזור העניין.
6. לאחר איתור האזור המעניין, העבירו את עדשת האובייקט לעדשה בעלת עוצמה גבוהה (63x) והתמקדו ברמת הרקמה, תוך התבוננות בחלבון הפלואורסצנטי האנדוגני ובצורות התאים באזור היעד כדי לאתר את תאי הקיספפטין על פני השטח של פרוסת המוח²⁰.
7. כאשר תא יעד אפשרי ממוקם, סמן אותו על מסך המחשב באמצעות סמן העכבר או על ידי ציור תבנית, כמו ריבוע, מעל אזור העניין. סימן המסך של המחשב מסייע להנחות את מיקום המיקרופיפטה המקליטה אל התא.
8. לאחר קביעת המיקום המדויק של תא היעד, להרים את המטרה ולהציג את micropipette הקלטה מלא הפתרון הפנימי. בעת הצבת המיקרופיפטה במחזיק האלקטרודה, ודא כי התמיסה הפנימית נמצאת במגע עם אלקטרודת הכסף.
   הערה: להכנת מיקרופיפטה, מיקום ומיקום על מחזיק האלקטרודות, עיין בסעיף³³.
9. הפעל לחץ חיובי לפני השקעת המיקרופיפטה בתמיסת aCSF, כדי למנוע כניסת פסולת למיקרופיפטה, באמצעות מזרק מלא אוויר 1-3 מ"ל המחובר למחזיק המיקרופיפטה באמצעות צינור פוליאתילן (≈130 ס"מ יותר); החל כמעט 100-200 μL של אוויר.
10. באמצעות micromanipulator, להנחות את micropipette מתחת למרכז המטרה. הזיזו את הכפתורים במיקרומניפולטור כדי להנחות את המיקרופיפטה על ציר X-Y-Z לכיוון התא המעניין.
11. כוונן את המיקוד כדי לראות את קצה המיקרופיפטה וקירב את הפוקוס, אך לא קרוב מדי, לפרוסה. להפחית את המהירות של micromanipulator ולאט לאט להוריד את micropipette למישור המיקוד. ודאו שקצה המיקרופיפטה אינו חודר בפתאומיות את הפרוסה, אלא יורד באיטיות עד שהוא נוגע בפני השטח של התא/אזור המטרה.
12. יש להפעיל לחץ חיובי קל (≈100 μL) עם מזרק מלא אוויר 1-3 מ"ל המחובר למחזיק המיקרופיפטה כדי לפנות פסולת מנתיב הגישה.
13. התמקדו בתא המטרה והזיזו לאט את המיקרומניפולטור על ציר X-Y-Z כדי לקרב את המיקרופיפטה לתא היעד. כאשר נוגעים במיקרופיפטה בתא, ניתן להבחין בגומה הנגרמת על-ידי הלחץ המופעל דרך קצה המיקרופיפטה (איור 2C).
14. לאחר יצירת הגומה, בשל קרבתו של המיקרופיפטה לתא, יש להפעיל יניקה חלשה וקצרה דרך הפה (1-2 שניות) דרך הצינור המחובר למחזיק המיקרופיפטה כדי ליצור את האיטום בין המיקרופיפטה לתא (חותם ג'יגה או ג'יגאזל >1 GΩ; איור 2D). כדי ליצור את החותם, השתמש במצב מהדק מתח בתוכנה. לפרטים על היווצרות החותם, עיין בסעיף³³.
15. אם האטם נשאר יציב (אטם הג'יגה-אוהם צריך להיות יציב מכנית וללא הפרעות רעש, הנקבעות על ידי תצפית במשך כדקה), כוונו את מתח האחיזה לפוטנציאל המנוחה הפיזיולוגי הקרוב ביותר של התא המעניין. עבור נוירונים היפותלמיים kisspeptin, -50 mV מומלץ.
16. הפעילו יניקה קצרה דרך הפה (לחץ שלילי) כשהמיקרופיפטה אטומה לתא כדי לשבור את קרום הפלזמה (איור 2E). תצורה נאותה של כל התא מושגת כאשר היניקה מבוצעת בכוח מספיק, כך שהקרום הקרוע אינו סותם את המיקרופיפטה ואינו מושך חלק ניכר מהקרום או אפילו את התא.
17. בדוק את מדריך הגדרות המערכת שבו נעשה שימוש. השתמש בתוכנה (ראה טבלת חומרים) כדי לבדוק ולחשב דיגיטלית את התנגדות הסידרה (SR) ואת הקיבול של התא כולו (wcc).
18. במצב מהדק מתח, לאחר שבירת קרום התא, הפעל את אפשרות התא כולו ולחץ על הפקודה אוטומטי המפנה לכרטיסיית התא כולה. SR ו- wcc של התא יחושבו באופן אוטומטי ויוצגו באופן מיידי על ידי התוכנה. ניתן לבדוק פרמטרים אלה גם על ידי ביצוע בדיקת הממברנה עם המגבר המוזכר בטבלת החומרים³³.
19. הקפד לבדוק פרמטרים של כדאיות התא. עבור נוירוני קיספפטין, בדוק כי המדידות האלקטרופיזיולוגיות הן: SR < 25 mΩ, התנגדות קלט > 0.3 GΩ, ומחזיק ערך מוחלט נוכחי < 30 pA (תצפיות אישיות והפניה²¹). הערך הממוצע של wcc של נוירונים AVPV/PeN^Kisspeptin או ARH^kisspeptin הוא ≈ 10-12 pF בעכברים שלמים גונאד²⁰.
20. עקוב אחר ה- SR וקיבול המצב היציב של התא במהלך הניסויים. ודא שה-SR אינו משתנה יותר מ-20% במהלך הקלטה ושקיבוליות הממברנה יציבה.
21. בדוק את הגדרות התוכנה. צור פרוטוקולים ספציפיים להקלטות בהתאם לסוג הניסוי. כדי לרשום את פוטנציאל הממברנה במצב מהדק זרם, עם ציוד המוזכר בטבלת החומרים, מסננים במעבר נמוך את האותות האלקטרופיזיולוגיים ב- 2-4 קילוהרץ ומנתחים תוצאות במצב לא מקוון בתוכנה (עיין בטבלת החומרים לקבלת מידע על תוכנה).
22. ברגע שתצורת התא כולו מושגת כראוי, מדדו זרמים סינפטיים במצב מהדק מתח (איור 2G). תיעדו שינויים בפוטנציאל קרום המנוחה (RMP) ושינויים מושרים ב-RMP במצב מהדק זרם (איור 2H). שינויים ב-RMP, כגון דפולריזציה של קרום התא, יכולים להיגרם על-ידי מתן תרופה/מוליך עצבי ידוע לאמבטיה (המתואר בשלב 3.2), כפי שמודגם באיור 1.
    הערה: במצב מהדק זרם, ניתן להזריק זרם חיובי או שלילי כדי להחזיק את מתח הממברנה במתח הרצוי. עבור נוירוני קיספפטין, אנו בדרך כלל קובעים הזרקת זרם אפס (I = 0) כדי לרשום את השונות הספונטנית של פוטנציאל הממברנה.

תוצאות

כדי לחקור את ההשפעות האפשריות של הורמון גדילה רקומביננטי אנושי (hGH) על הפעילות של נוירוני קיספפטין היפותלמיים, ביצענו רישומי מהדק טלאי של תאים שלמים בפרוסות מוח והערכנו אם הורמון זה גורם לשינויים חריפים בפעילות של תאי עצב מסוג AVPV/PeN^{קיספפטין} ו-ARH^{קיספפטין}. במחקר זה נעשה שימוש בנק?...

Discussion

לפיתוח טכניקת מהדק המדבקים של התא כולו הייתה השפעה משמעותית על הקהילה המדעית, והיא נחשבה לבעלת חשיבות עליונה לפיתוח המחקר המדעי ואפשרה מספר תגליות. השפעתה על המדע הספיקה כדי להגיע לשיאה בפרס נובל לרפואה בשנת 1991, שכן תגלית זו פתחה את הדלת להבנה טובה יותר של האופן שבו תעלות יונים מתפקדות בתנ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP	Sigma Aldrich/various	A9187
CaCl2	Sigma Aldrich/various	C7902
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich/various	G7021
EGTA	Sigma Aldrich/various	O3777
HEPES	Sigma Aldrich/various	H3375
KCL	Sigma Aldrich/various	P5405
K-gluconate	Sigma Aldrich/various	G4500
KOH	Sigma Aldrich/various	P5958
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M9272
MgSO4	Sigma Aldrich/various	230391
NaCl	Sigma Aldrich/various	S5886
NaH2PO4	Sigma Aldrich/various	S5011
NaHCO3	Sigma Aldrich/various	S5761
nitric acid	Sigma Aldrich/various	225711	CAUTION
Sucrose	Sigma Aldrich/various	S1888
Equipments
Air table	TMC	63-534
Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Computer	various	-
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM	Molecular Devices	DD1440
Digital peristaltic pump	Ismatec	ISM833C
Faraday cage	TMC	81-333-03
Imaging Camera	Leica	DFC 365 FX
Micromanipulator	Sutter Instruments	Roe-200
Micropipette Puller	Narishige	PC-10
Microscope	Leica	DM6000 FS
Osteotome	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	128
Recovery chamber	Warner Instruments/Harvard apparatus	-	can be made in-house
Recording chamber	Warner Instruments	640277
Spatula	Fisher Scientific /various	FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome	Leica	VT1000 S
Water Bath	Fisher Scientific /various	Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software	Molecular Devices	-	Commander Software
LAS X wide field system	Leica	-	Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B	Molecular Devices	MULTICLAMP 700B	Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS	Molecular Devices	Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm	Warner Instruments	64-1309
Curved hemostatic forcep	various	-
cyanoacrylate glue	LOCTITE/various	-
Decapitation scissors	various	-
Filter paper	various	-
Glass capillaries (micropipette)	World Precision Instruments, Inc	TW150F-4
Iris scissors	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	65-66
Pasteur glass pipette	Sigma Aldrich/various	CLS7095B9-1000EA
Petri dish	various	-
Polyethylene tubing	Warner Instruments	64-0756
Razor blade for brain dissection	TED PELLA	TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome	TED PELLA	TEDP-121-9
Scissors	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	71-72, 48,49;
silicone teat	various	-
Slice Anchor	Warner Instruments	64-0246
Syringe filters	Merck Millipore Ltda	SLGVR13SL	Millex-GV 0.22 μm
Tweezers	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	131, 1518