АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для выполнения цельноклеточного пластыря на срезах мозга, содержащих нейроны кисспептина, первичный модулятор клеток гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ). Добавляя знания об активности кисспептиновых нейронов, этот электрофизиологический инструмент послужил основой для значительных достижений в области нейроэндокринологии за последние 20 лет.

Аннотация

Кисспептины необходимы для созревания оси гипоталамо-гипофиз-гонад (HPG) и фертильности. Нейроны гипоталамического кисспептина, расположенные в передневентральном перивентрикулярном ядре и ростральном перивентрикулярном ядре, а также дугообразное ядро гипоталамуса, проецируются на нейроны гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) и другие клетки. Предыдущие исследования показали, что передача сигналов кисспептина происходит через рецептор Kiss1 (Kiss1r), в конечном итоге возбуждая активность нейронов ГнРГ. У людей и экспериментальных животных кисспептины достаточны для индукции секреции ГнРГ и, следовательно, высвобождения лютеинизирующего гормона (ЛГ) и гормона-стимулятора фолликулов (ФСГ). Поскольку кисспептины играют важную роль в репродуктивных функциях, исследователи работают над тем, чтобы оценить, как внутренняя активность нейронов гипоталамуса кисспептина способствует действиям, связанным с размножением, и определить первичные нейротрансмиттеры / нейромодуляторы, способные изменять эти свойства. Метод цельноклеточного пластыря стал ценным инструментом для исследования активности нейронов кисспептина в клетках грызунов. Этот экспериментальный метод позволяет исследователям регистрировать и измерять спонтанные возбуждающие и тормозные ионные токи, мембранный потенциал покоя, возбуждение потенциала действия и другие электрофизиологические свойства клеточных мембран. В настоящем исследовании рассматриваются важнейшие аспекты метода цельноклеточного пластыря, известные как электрофизиологические измерения, определяющие гипоталамические кисспептиновые нейроны, и обсуждение соответствующих вопросов о методе.

Введение

Ходжкин и Хаксли сделали первую внутриклеточную запись потенциала действия, описанного в нескольких научных исследованиях. Эта запись была выполнена на аксоне кальмара, который имеет большой диаметр (~ 500 мкм), что позволяет поместить микроэлектрод внутрь аксона. Эта работа предоставила большие возможности для научных исследований, которые впоследствии завершились созданием режима напряжения-зажима, который был использован для изучения ионной основы генерации потенциала действия 1,2,3,4,5,6,7,8. С годами методика совершенствовалась, и она стала широко применяться в научныхисследованиях6,9. Изобретение метода патч-зажима, которое произошло в конце 1970-х годов благодаря исследованиям, инициированным Эрвином Неером и Бертом Сакманном, позволило исследователям регистрировать одиночные ионные каналы и внутриклеточные мембранные потенциалы или токи практически в каждом типе клеток, используя только один электрод 9,10,11,12. Запись с помощью патч-зажима может быть выполнена на различных тканевых препаратах, таких как культивируемые клетки или срезы тканей, либо в режиме зажима напряжения (удерживая клеточную мембрану при заданном напряжении, позволяющем записывать, например, зависимые от напряжения токи и синаптические токи), либо в режиме токового зажима (позволяя регистрировать, например, изменения мембранного потенциала покоя, индуцированные ионными токами, потенциалы действия и частота постсинаптических потенциалов).

Использование техники патч-зажима сделало возможным несколько заметных открытий. Действительно, основополагающие данные об электрофизиологических свойствах нейронов кисспептина гипоталамуса, расположенных в передневентральных перивентрикулярных и ростральных перивентрикулярных ядрах (AVPV / PeNKisspeptin), также известных как ростральная перивентрикулярная область третьего желудочка (RP3V), и дугообразное ядро гипоталамуса (АРГкисспептин)13,14,15 представляют особый интерес. В 2010 году Ducret et al. выполнили первые записи нейронов AVPV / PeNKisspeptinу мышей, используя другой электрофизиологический инструмент, метод зажима свободных клеток. Эти исследования предоставили электрическое описание нейроновкисспептина AVPV / PeN и продемонстрировали, что их паттерны возбуждения зависят от эстрального цикла16. В 2011 году Qiu et al. использовали технику зажима всей клетки, чтобы продемонстрировать, что нейроныАРГ кисспептина экспрессируют эндогенные токи кардиостимулятора17. Впоследствии Gottsch et al. показали, что кисспептиновые нейроны проявляют спонтанную активность и экспрессируют кальциевые токи как h-типа (кардиостимулятор), так и T-типа, предполагая, что нейроныАРГ кисспептина разделяют электрофизиологические свойства с другими нейронами кардиостимулятора центральной нервной системы18. Кроме того, было продемонстрировано, что нейроныАРГ кисспептина демонстрируют половую диморфную скорость возбуждения и что нейроны AVPV / PeNKisspeptin проявляют бимодальный мембранный потенциал покоя (RMP), на который влияют чувствительные к АТФ калиевые каналы (KATP)19,20. Кроме того, было установлено, что гонадные стероиды положительно влияют на спонтанную электрическую активность нейронов кисспептина у мышей 19,20,21. Упоминаются первые работы, изучающие электрофизиологические свойства кисспептиновых нейронов 16,17,18,19,20. С тех пор во многих исследованиях использовался метод цельноклеточного пластыря, чтобы продемонстрировать, какие факторы/нейромодуляторы достаточны для модуляции электрической активности нейронов кисспептина (рис. 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Учитывая важность этого метода для изучения нейронов, необходимых для размножения, среди других типов клеток, не рассмотренных здесь, в этой статье описываются основные этапы разработки метода патч-зажима целых клеток, такие как приготовление растворов, рассечение и разрезание мозга, а также выполнение уплотнения клеточной мембраны для записей. Кроме того, обсуждаются соответствующие вопросы о методе, такие как его преимущества, технические ограничения и важные переменные, которые необходимо контролировать для оптимальной экспериментальной работы.

протокол

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике животных Института биомедицинских наук при Университете Сан-Паулу и выполнялись в соответствии с этическими принципами, принятыми Бразильским колледжем экспериментов на животных.

1. Приготовление растворов

  1. Приготовление внутреннего раствора
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренний раствор заполняет микропипетку с пластырем и контактирует с внутренней частью клетки (см. пример на рисунке 2). Внутренние решения могут варьироваться в зависимости от типа измеряемой активности33.
    1. Выбирайте внутреннее решение с учетом его экспериментального назначения и соответствующего типа записи. Для регистрации мембранного потенциала в режиме токового зажима используют внутренний раствор, состоящий из 120 мМ K-глюконата, 1 мМ NaCl, 5 мМ EGTA, 10 мМ HEPES, 1 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 3 мМ KOH, 10 мМ KCl и 4 мМ (Mg)-АТФ. Взвесьте все соли в соответствии с желаемым конечным объемом, как указано в таблице 1.
    2. Используйте достаточное количество деионизированной воды, чтобы достичь 90% конечного объема раствора. Этот объем обеспечит достаточно места для регулировки pH и осмолярности.
    3. После добавления и тщательного перемешивания всех ингредиентов отрегулируйте рН до 7,2-7,3 с помощью 5 М КОН с помощью рН-метра. Используйте осмометр для проверки осмолярности, которая должна составлять около 275-280 мОсм (при необходимости отрегулируйте только в меньшую сторону).
    4. Заранее приготовьте внутренний раствор и храните при температуре 8 °C. Добавьте АТФ в день эксперимента. Храните АТФ-содержащий внутренний раствор при -20 °C (1 мл аликвот) в течение 3-4 месяцев.
  2. Приготовление раствора для нарезки
    1. Приготовьте раствор для нарезки, содержащий 238 мМ сахарозы, 2,5 мМ KCl, 26 мМ NaHCO3, 1,0 мМ 2 PO4, 10 мМ глюкозы, 1,0 мМCaCl2 и 5,0 мМ MgCl2. Взвесьте все соли в соответствии с желаемым конечным объемом, как показано в таблице 2. Точный объем этого раствора, который необходимо приготовить, будет зависеть от размера режущей камеры.
    2. Смешивая все соли в деионизированной воде, постоянно насыщайте карбогеном (95% О2 и 5%СО2). Прикрепите полиэтиленовую трубку (наружный диаметр 1,57 мм [OD] x внутренний диаметр 1,14 мм [ID]) к цилиндру с карбогеном, чтобы подать карбоген в раствор для нарезки. Держите открытый конец трубки внутри стакана, содержащего раствор для нарезки.
    3. Хорошо перемешав все ингредиенты, отрегулируйте рН до 7,3 с 10% азотной кислотой с помощью рН-метра. Используйте осмометр для проверки осмолярности, которая должна составлять 290-295 мОсм (при необходимости отрегулируйте только в меньшую сторону). После этого охладите раствор до 0-2 °C.
  3. Подготовьте раствор aCSF для записей
    1. Приготовьте раствор искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) для записи, содержащий 124 мМ NaCl, 2,8 мМ KCl, 26 мМ NaHCO3, 1,25 мМ 2 PO 4, 1,2 мМ MgSO4, 5 мМ глюкозы и 2,5 мМ CaCl2. Взвесьте все соли в соответствии с желаемым конечным объемом, приведенным в таблице 3.
    2. Смешивая все соли в деионизированной воде, постоянно насыщайте их карбогеном (95% О2 и 5%СО2), как описано в шаге 1.2.2.
    3. После добавления и смешивания всех ингредиентов отрегулируйте рН до 7,3 (можно использовать 10% азотную кислоту) с помощью рН-метра. Используйте осмометр для проверки осмолярности, которая должна составлять 290-300 мОсм. После этого налейте aCSF в стакан и выдержите на водяной бане при температуре 30 °C.

2. Вскрытие и нарезка мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку различные структуры мозга могут потребовать разрезания в разных плоскостях (корональный, сагиттальный или горизонтальный срезы), точный подход к получению срезов зависит от интересующей области мозга. Как правило, для изучения клеток, экспрессирующих Kiss1, в нейронах AVPV/PeN и ARH (здесь обозначаются как нейроны AVPV/PeNKisspeptin и нейроныАРГ кисспептина; Рисунок 2А, Б), корональные срезы мозга (200-300 мкм) обычно составляют 17,19,20,21,34. Нейроны кисспептина AVPV / PeN расположены примерно от 0,5 до -0,22 мм от брегмы, тогда как нейроныкисспептина ARH находятся на расстоянии от -1,22 до -2,70 мм. Расположение ядер можно определить с помощью стереотаксического атласа мозга мыши35 или эталонного атласа мозга мыши Аллена (http://mouse.brain-map.org/). В этом исследовании использовались взрослые самки Kiss1-Cre / GFP (стадия диэструса) и самцымышей 36.

  1. Удаление мозга
    1. Подготовьте место вскрытия и инструменты, необходимые для извлечения мозга: обезглавливающие ножницы, ножницы для радужной оболочки глаза, изогнутые ножницы Кастровьехо, остеотом, пинцет, шпатель, фильтровальная бумага, чашка Петри, лезвие бритвы и цианоакрилатный клей.
    2. Перед тем, как сделать срезы, подготовьте скамейку, на которой будет производиться вскрытие, так как все последующие процедуры необходимо выполнять быстро. Убедитесь, что у вас есть доступ к устройству для нарезки, например вибратому.
    3. Подготовьте записывающую камеру для поддержания срезов мозга перед разрезанием ткани. Приобретите записывающую камеру размером 24 мм x 15 мм x 2 мм (Д x Ш x В) у коммерческого бренда (Table of Materials) или изготовьте ее самостоятельно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Собственная камера восстановления может быть изготовлена следующим образом: разрежьте плиту на 24 лунки так, чтобы было доступно девять скважин. Приклейте капроновый экран к основанию девяти лунок. Из остатка колодезной пластины сделайте основание так, чтобы нижняя часть капрона была свободна. Это адаптированное основание может быть помещено в стакан объемом 500 мл, содержащий aCSF (дополнительный рисунок 1).
    4. После того, как все приготовлено, обезболите животное ингаляционным анестетиком, используя 4%-5% изофлурана. Анестезия должна проводиться в соответствии с протоколом, утвержденным этическим комитетом. Вскоре после того, как животное станет неподвижным, проведите тесты на ущипывание хвоста и лап, чтобы убедиться, что животное глубоко обезболито.
    5. Быстро обезглавливайте мышей, пока сердце все еще активно, чтобы повысить жизнеспособность клеток. Быстро собирают мозг после обезглавливания.
    6. Хирургическими ножницами сделайте разрез на коже в верхней части черепа животного, от каудального до рострального, и снимите кожу головы с головы животного. Далее разрежьте ножницами радужной оболочки межтеменную пластинку вдоль сагиттального шва и удалите затылочную кость. Проденьте остеотом под теменную кость и осторожно вытащите его, пока мозг не обнажится.
    7. Обнажив мозг, переверните голову вверх ногами, осторожно опустите мозг, чтобы визуализировать тройничный нерв с каждой стороны, затем разрежьте тройничный нерв с помощью изогнутых ножниц Кастровьехо. Визуализировав гипоталамус, определите зрительный нерв и аккуратно разрежьте его.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при разрезании зрительного нерва, так как его вытягивание разорвет соседнюю область гипоталамуса, содержащую ядро AVPV / PeN.
    8. Отрежьте самую переднюю часть лобной доли и удалите мозг полностью. Немедленно погрузите мозг в раствор для нарезки до получения срезов.
  2. Нарезка образцов мозга
    1. Поместите мозг на фильтровальную бумагу (поддерживаемую чашкой Петри), чтобы высушить излишки раствора. Затем острым режущим лезвием бритвы выполните коронковый разрез, отделяющий ствол мозга с мозжечком от остальной ткани.
    2. Затем приклейте каудальную часть мозга к основанию вибратома и заполните камеру нарезочного устройства раствором для нарезки / ликвора, охлажденным до 0-2 ° C. Во время процедуры уплотните сухой лед вокруг вибратомной камеры, чтобы раствор для нарезки оставался холодным.
    3. Вставьте лезвие бритвы в вибратом и установите соответствующие параметры резки устройства: скорость = 3, частота = 9 и подача = 250 мкм. Используйте акриловую пипетку для переноса (перевернутую стеклянную пипетку Пастера, прикрепленную к силиконовой соске) для переноса срезов в камеру восстановления (описанную на шаге 2.1.3) во время процедуры нарезки ткани. Подождите 60 минут для восстановления тканей после получения среза.

3. Герметизация ячеек для записи

  1. Перед началом записи убедитесь, что все элементы оборудования (микроскоп, усилитель, дигитайзер, микроманипулятор и другие) включены.
  2. Заполните записывающую камеру коммерческой марки (Таблица материалов), прикрепленную к микроскопу, раствором aCSF для записей. Используйте перфузионный насос для постоянной перфузии aCSF со скоростью 2 мл / мин.
  3. Перенесите интересующий срез мозга (по одному) в записывающую камеру. Используйте акриловую пипетку для переноса (перевернутую стеклянную пипетку Пастера, прикрепленную к силиконовому соску), чтобы перенести ломтики гипоталамуса в камеру. Используйте якорь среза (Таблица материалов), чтобы удерживать срез, чтобы он не двигался во время перфузии aCSF.
  4. Поместите срез в центр записывающей камеры, прикрепленной к микроскопу. Положение среза имеет решающее значение для хорошего обзора нужной области под микроскопом и для идеального охвата записывающей микропипетки.
  5. Используйте маломощную линзу объектива иммерсионного микроскопа (10-кратную или 20-кратную), чтобы помочь расположить срез и определить интересующую область.
  6. После определения интересующей области переключите линзу объектива на мощную линзу (63x) и сфокусируйтесь на тканевом уровне, наблюдая за эндогенным флуоресцентным белком и формами клеток в целевой области, чтобы найти клетки кисспептина на поверхности срезамозга 20.
  7. Когда возможная целевая ячейка будет найдена, отметьте ее на экране компьютера с помощью курсора мыши или нарисовав формат, например квадрат, над интересующей областью. Метка экрана компьютера помогает направлять положение записывающей микропипетки к клетке.
  8. После определения точного местоположения клетки-мишени поднимите объектив и введите записывающую микропипетку, заполненную внутренним раствором. При помещении микропипетки в электрододержатель убедитесь, что внутренний раствор соприкасается с серебряным электродом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки, размещения и размещения микропипетки на электрододержателе см.33.
  9. Перед погружением микропипетки в раствор ликвора приложите положительное давление, чтобы предотвратить попадание мусора в микропипетку, используя заполненный воздухом шприц объемом 1-3 мл, соединенный с держателем микропипетки через полиэтиленовую трубку (≈на 130 см длиннее); нанесите около 100-200 мкл воздуха.
  10. Используя микроманипулятор, направьте микропипетку ниже центра объектива. Перемещайте кнопки на микроманипуляторе, чтобы направить микропипетку по оси X-Y-Z к интересующей ячейке.
  11. Отрегулируйте фокус так, чтобы увидеть кончик микропипетки, и поднесите фокус ближе, но не слишком близко к срезу. Уменьшите скорость микроманипулятора и медленно опустите микропипетку в плоскость фокуса. Убедитесь, что наконечник микропипетки не проникает резко в срез, а медленно опускается до тех пор, пока не коснется поверхности клетки/области-мишени.
  12. Приложите легкое положительное давление (≈100 мкл) с помощью шприца, наполненного воздухом объемом 1-3 мл, прикрепленного к держателю микропипетки, чтобы очистить путь подхода от мусора.
  13. Сфокусируйтесь на клетке-мишени и медленно переместите микроманипулятор по оси X-Y-Z, чтобы приблизить микропипетку к клетке-мишени. При прикосновении микропипетки к клетке будет наблюдаться ямочка, вызванная давлением, приложенным через наконечник микропипетки (рис. 2C).
  14. После формирования ямочки, из-за близости микропипетки к клетке, подайте слабое, короткое всасывание через рот (1-2 с) через трубку, соединенную с держателем микропипетки, чтобы создать уплотнение между микропипеткой и клеткой (гигаомное уплотнение или гигаомное уплотнение >1 ГОм; Рисунок 2D). Для формирования уплотнения используйте режим зажима напряжения в программном обеспечении. Для получения подробной информации о формировании печати, пожалуйста, обратитесь к33.
  15. Если уплотнение остается стабильным (гигаомное уплотнение должно быть механически стабильным и без шумовых помех, определяемых наблюдением в течение примерно 1 мин), установите удерживающее напряжение на ближайшем физиологическом потенциале покоя интересующей ячейки. Для кисспептиновых нейронов гипоталамуса рекомендуется -50 мВ.
  16. Нанесите короткое отсасывание внутрь (отрицательное давление) с микропипеткой, запечатанной в клетке, чтобы разорвать плазматическую мембрану (рис. 2E). Адекватная цельноклеточная конфигурация достигается, когда всасывание выполняется с достаточной силой, чтобы разорванная мембрана не закупоривала микропипетку и не притягивала значительную часть мембраны или даже клетку.
  17. Проверьте используемые системные настройки. Используйте программное обеспечение (см. Таблицу материалов) для цифровой проверки и расчета последовательного сопротивления (SR) и емкости целого элемента (wcc).
  18. В режиме зажима напряжения после разрыва клеточной мембраны включите опцию «Вся ячейка» и нажмите на команду «Авто», относящуюся ко вкладке всей ячейки. SR и wcc ячейки будут автоматически рассчитаны и мгновенно отображены программным обеспечением. Эти параметры также можно проверить, выполнив испытание мембраны с усилителем, упомянутым в таблице материалов33.
  19. Обязательно проверьте параметры жизнеспособности клеток. Для нейронов кисспептина убедитесь, что электрофизиологические измерения составляют: SR < 25 мОм, входное сопротивление > 0,3 ГОм и абсолютное значение удерживаемого тока < 30 пА (личные наблюдения и ссылка21). Среднее значение wcc нейронов AVPV / PeN Kisspeptin илиARH kisspeptin составляет ≈ 10-12 pF у мышей с интактными гонадами20.
  20. Контролируйте SR и стационарную емкость ячейки во время экспериментов. Убедитесь, что SR не изменяется более чем на 20% во время записи и что емкость мембраны стабильна.
  21. Проверьте настройки программного обеспечения. Создайте специальные протоколы для записей в соответствии с типом эксперимента. Для регистрации мембранного потенциала в режиме токового зажима с помощью оборудования, указанного в Таблице материалов, фильтруйте электрофизиологические сигналы нижних частот на частоте 2-4 кГц и анализируйте результаты в автономном режиме в программном обеспечении (информацию о программном обеспечении см. в Таблице материалов).
  22. После того, как конфигурация целой ячейки будет достигнута должным образом, измерьте синаптические токи в режиме зажима напряжения (рис. 2G). Регистрируйте изменения мембранного потенциала покоя (RMP) и индуцированные вариации RMP в режиме токового зажима (рис. 2H). Изменения в RMP, такие как деполяризация клеточной мембраны, могут быть вызваны введением известного лекарственного средства/нейротрансмиттера в ванну (описано на шаге 3.2), как показано на рисунке 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В режиме токового зажима можно вводить положительный или отрицательный ток для поддержания напряжения мембраны на желаемом напряжении. Для нейронов кисспептина мы обычно устанавливаем инжекцию нулевого тока (I = 0) для регистрации спонтанного изменения мембранного потенциала.

Результаты

Для изучения возможного влияния человеческого рекомбинантного гормона роста (hGH) на активность гипоталамических кисспептиновых нейронов мы провели запись цельноклеточного пластыря в срезах мозга и оценили, вызывает ли этот гормон острые изменения активности нейронов AVPV/PeN Kisspeptin и ARH

Обсуждение

Развитие метода цельноклеточного пластыря оказало значительное влияние на научное сообщество, считаясь чрезвычайно важным для развития научных исследований и создания нескольких открытий. Его влияния на науку было достаточно, чтобы кульминацией стала Нобелевская премия по медицине...

Раскрытие информации

Отсутствие конфликтов интересов, подлежащих декларированию.

Благодарности

Это исследование было поддержано Исследовательским фондом Сан-Паулу [номера грантов FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Финансовый кодекс 001» (HRV).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATPSigma Aldrich/variousA9187
CaCl2Sigma Aldrich/variousC7902
D-(+)-GlucoseSigma Aldrich/variousG7021
EGTASigma Aldrich/variousO3777
HEPESSigma Aldrich/variousH3375
KCLSigma Aldrich/variousP5405
K-gluconateSigma Aldrich/variousG4500
KOHSigma Aldrich/variousP5958
MgCl2Sigma Aldrich/variousM9272
MgSO4Sigma Aldrich/various230391
NaClSigma Aldrich/variousS5886
NaH2PO4 Sigma Aldrich/variousS5011
NaHCO3Sigma Aldrich/variousS5761
nitric acidSigma Aldrich/various225711CAUTION
SucroseSigma Aldrich/variousS1888
Equipments
Air tableTMC63-534
AmplifierMolecular DevicesMulticlamp 700B
Computervarious-
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEMMolecular DevicesDD1440
Digital peristaltic pumpIsmatecISM833C 
Faraday cageTMC81-333-03
Imaging CameraLeicaDFC 365 FX
MicromanipulatorSutter InstrumentsRoe-200
Micropipette PullerNarishigePC-10
MicroscopeLeicaDM6000 FS
OsteotomeBonther equipamentos & Tecnologia/various128
Recovery chamberWarner Instruments/Harvard apparatus-can be made in-house
Recording chamberWarner Instruments640277
SpatulaFisher Scientific /variousFISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome LeicaVT1000 S
Water Bath Fisher Scientific /variousIsotemp
Software and systems
AxoScope 10 softwareMolecular Devices-Commander Software
LAS X wide field systemLeica-Image acquisition and analysis
MultiClamp 700BMolecular DevicesMULTICLAMP 700BCommander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWSMolecular DevicesPclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mmWarner Instruments64-1309
Curved hemostatic forcepvarious-
cyanoacrylate glueLOCTITE/various-
Decapitation scissorsvarious-
Filter papervarious-
Glass capillaries (micropipette)World Precision Instruments, IncTW150F-4
Iris scissorsBonther equipamentos & Tecnologia/various65-66
Pasteur glass pipette Sigma Aldrich/variousCLS7095B9-1000EA
Petri dishvarious-
Polyethylene tubing Warner Instruments64-0756
Razor blade for brain dissectionTED PELLATEDP-121-1
Razor blade for the vibratomeTED PELLATEDP-121-9
ScissorsBonther equipamentos & Tecnologia/various71-72, 48,49; 
silicone teatvarious-
Slice Anchor Warner Instruments64-0246
Syringe filtersMerck Millipore LtdaSLGVR13SLMillex-GV 0.22 μm
TweezersBonther equipamentos & Tecnologia/various131, 1518

Ссылки

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
  3. Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
  4. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  5. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  6. Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357 (2019).
  7. Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  8. Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
  11. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  12. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  13. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  14. Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
  15. Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
  16. Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
  17. Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
  18. Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
  19. de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
  20. Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
  21. DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
  22. Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532 (2022).
  23. Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006 (2022).
  24. Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
  25. Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
  26. Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698 (2013).
  27. Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
  28. Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
  29. de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
  30. Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
  31. True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
  32. Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
  33. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  34. Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
  35. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , (2001).
  36. Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neuroscience. 173, 37-56 (2011).
  37. Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
  38. Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
  39. Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380 (1991).
  40. Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449 (1991).
  41. Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
  42. Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
  43. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
  44. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  45. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
  46. Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
  47. Dallas, M., Bell, D. . Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
  48. Robinson, R. A., Stokes, R. H. . Electrolyte Solutions. 2nd edition. , (1959).
  49. de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
  50. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  51. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  52. Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
  53. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
  54. Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
  55. Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246 (2016).
  56. Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928 (2020).
  57. Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045 (2022).
  58. Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957 (2021).
  59. Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
  60. Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425 (2020).
  61. Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE193Kiss1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены