Neuronas de kisspeptina hipotalámicas como objetivo para grabaciones de pinza de parche de células enteras

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para realizar un parche de pinza de células enteras en cortes cerebrales que contienen neuronas kisspeptina, el modulador principal de las células de la hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH). Al agregar conocimiento sobre la actividad neuronal kisspeptina, esta herramienta electrofisiológica ha servido como base para avances significativos en el campo de la neuroendocrinología en los últimos 20 años.

Resumen

Las kisspeptinas son esenciales para la maduración del eje hipotalámico-pituitario-gonadal (HPG) y la fertilidad. Las neuronas kisspeptina hipotalámicas ubicadas en el núcleo periventricular anteroventral y el núcleo periventricular rostral, así como el núcleo arqueado del hipotálamo, se proyectan a las neuronas de la hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH), entre otras células. Estudios previos han demostrado que la señalización de kisspeptina se produce a través del receptor Kiss1 (Kiss1r), lo que en última instancia excita la actividad neuronal GnRH. En humanos y modelos animales experimentales, las kisspeptinas son suficientes para inducir la secreción de GnRH y, en consecuencia, la liberación de la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimulante del folículo (FSH). Dado que las kisspeptinas desempeñan un papel esencial en las funciones reproductivas, los investigadores están trabajando para evaluar cómo la actividad intrínseca de las neuronas hipotalámicas de kisspeptina contribuye a las acciones relacionadas con la reproducción e identificar los neurotransmisores / neuromoduladores primarios capaces de cambiar estas propiedades. La técnica de pinza de parche de células enteras se ha convertido en una herramienta valiosa para investigar la actividad de la neurona kisspeptina en células de roedores. Esta técnica experimental permite a los investigadores registrar y medir las corrientes iónicas excitatorias e inhibitorias espontáneas, el potencial de membrana en reposo, el disparo del potencial de acción y otras propiedades electrofisiológicas de las membranas celulares. En el presente estudio, se revisan aspectos cruciales de la técnica de pinza de parche de células enteras, conocidas como mediciones electrofisiológicas que definen las neuronas kisspeptina hipotalámicas, y una discusión de temas relevantes sobre la técnica.

Introducción

Hodgkin y Huxley hicieron el primer registro intracelular de un potencial de acción descrito en varios estudios científicos. Este registro se realizó en el axón del calamar, que tiene un gran diámetro (~ 500 μm), lo que permite colocar un microelectrodo dentro del axón. Este trabajo proporcionó grandes posibilidades para la investigación científica, culminando más tarde en la creación del modo de pinza de voltaje, que se utilizó para estudiar la base iónica de la generación de potencial de acción 1,2,3,4,5,6,7,8. A lo largo de los años, la técnica ha sido mejorada y se ha aplicado ampliamente en la investigación científica ^6,9. La invención de la técnica patch-clamp, que tuvo lugar a finales de la década de 1970 a través de estudios iniciados por Erwin Neher y Bert Sakmann, permitió a los investigadores registrar canales iónicos individuales y potenciales o corrientes de membrana intracelular en prácticamente todos los tipos de células utilizando un solo electrodo 9,10,11,12 . Las grabaciones de patch-clamp pueden realizarse en una variedad de preparaciones tisulares, como células cultivadas o cortes de tejido, ya sea en modo de pinza de voltaje (sosteniendo la membrana celular a una tensión establecida que permita el registro de, por ejemplo, corrientes dependientes de voltaje y corrientes sinápticas) o en modo de abrazadera de corriente (que permite registrar, por ejemplo, cambios en el potencial de membrana en reposo inducidos por corrientes de iones, potenciales de acción, y frecuencia de potencial postsináptico).

El uso de la técnica patch-clamp hizo posible varios descubrimientos notables. De hecho, los hallazgos seminales sobre las propiedades electrofisiológicas de las neuronas kisspeptina hipotalámicas localizadas en los núcleos periventricular anteroventral y periventricular rostral (AVPV/PeN^Kisspeptin), también conocida como área periventricular rostral del tercer ventrículo (RP3V), y el núcleo arqueado del hipotálamo (ARH^kisspeptina)^13,14,15 son de particular interés. En 2010, Ducret et al. realizaron las primeras grabaciones de neuronas AVPV / PeN^Kisspeptinen ratones utilizando otra herramienta electrofisiológica, la técnica de pinza de parche de células sueltas. Estos estudios proporcionaron una descripción eléctrica de las neuronas AVPV/PeN^Kisspeptina y demostraron que sus patrones de disparo dependen del ciclo estral¹⁶. En 2011, Qiu et al. utilizaron la técnica de patch-clamp de células enteras para demostrar que las neuronas ARH^kisspeptina expresan corrientes endógenas de marcapasos¹⁷. Posteriormente, Gottsch et al. demostraron que las neuronas kisspeptina exhiben actividad espontánea y expresan corrientes de calcio tipo h (marcapasos) y tipo T, sugiriendo que las neuronas de^kisspeptina ARH comparten propiedades electrofisiológicas con otras neuronas marcapasos del sistema nervioso central¹⁸. Además, se ha demostrado que las neuronas de^kisspeptina ARH exhiben tasas de disparo sexualmente dimórficas y que las neuronas AVPV/PeN^Kisspeptina exhiben un potencial de membrana en reposo bimodal (RMP) influenciado por canales de potasio sensibles al ATP (_{K ATP})^19,20. Además, se estableció que los esteroides gonadales afectan positivamente la actividad eléctrica espontánea de las neuronas kisspeptina en ratones 19,20,21. Los primeros trabajos que estudian las propiedades electrofisiológicas de las neuronas kisspeptina se mencionan 16,17,18,19,20. Desde entonces, muchos estudios han utilizado la técnica de patch-clamp de células enteras para demostrar qué factores/neuromoduladores son suficientes para modular la actividad eléctrica de las neuronas kisspeptina (Figura 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,^31,32.

Dada la importancia de esta técnica para el estudio de las neuronas que se requieren para la reproducción, entre otros tipos de células no cubiertas aquí, este artículo describe los pasos básicos para el desarrollo de la técnica de pinza de parche de células completas, como preparar las soluciones, diseccionar y cortar el cerebro y realizar el sello de la membrana celular para las grabaciones. Además, se discuten cuestiones relevantes sobre la técnica, como sus ventajas, limitaciones técnicas y variables importantes que deben controlarse para un rendimiento experimental óptimo.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo y fueron realizados de acuerdo con las directrices éticas adoptadas por el Colegio Brasileño de Experimentación Animal.

1. Preparación de soluciones

1. Preparación de solución interna
   NOTA: La solución interna llena la micropipeta de la abrazadera de parche y entrará en contacto con el interior de la célula (ver un ejemplo en la Figura 2). Las soluciones internas pueden variar dependiendo del tipo de actividad a medir³³.
   1. Elija la solución interna teniendo en cuenta su propósito experimental y el tipo de registro apropiado. Para registrar el potencial de membrana en el modo de pinza de corriente, utilice la solución interna compuesta de 120 mM de K-gluconato, 1 mM de NaCl, 5 mM de EGTA, 10 mM de HEPES, 1 mM de MgCl 2, 1 mM de CaCl₂, 3 mM de KOH, 10 mM de KCl y 4 mM (Mg)-ATP. Pesar todas las sales de acuerdo con el volumen final deseado, como se indica en la Tabla 1.
   2. Use suficiente agua desionizada para alcanzar el 90% del volumen final de la solución. Este volumen asegurará suficiente espacio para ajustar el pH y la osmolaridad.
   3. Después de agregar y mezclar bien todos los ingredientes, ajuste el pH a 7.2-7.3 con 5 M KOH usando un medidor de pH. Use un osmómetro para verificar la osmolaridad, que debe ser de alrededor de 275-280 mOsm (ajuste, si es necesario, solo hacia abajo).
   4. Preparar la solución interna con antelación y conservar a 8 °C. Agregue el ATP el día del experimento. Conservar la solución interna que contiene ATP a -20 °C (1 ml de alícuotas) durante 3-4 meses.
2. Preparación de la solución de corte
   1. Prepare una solución de corte que contenga 238 mM de sacarosa, 2,5 mM de KCl, 26 mM de NaHCO₃, 1,0 mM de NaH 2 PO₄, 10 mM de glucosa, 1,0 mM de CaCl 2 y 5,0 mM de MgCl₂. Pesar todas las sales de acuerdo con el volumen final deseado, como se muestra en la Tabla 2. El volumen exacto de esta solución a preparar dependerá del tamaño de la cámara de corte.
   2. Mientras se mezclan todas las sales en agua desionizada, saturar constantemente con carbógeno (95% O2 y 5%_CO2). Conecte un tubo de polietileno (diámetro exterior [OD] de 1,57 mm x diámetro interior [ID] de 1,14 mm) a un cilindro de carbogen para suministrar carbogen a la solución de corte. Sostenga el extremo abierto del tubo dentro del vaso de precipitados que contiene la solución de corte.
   3. Después de mezclar bien todos los ingredientes, ajuste el pH a 7.3 con ácido nítrico al 10% usando un medidor de pH. Use un osmómetro para verificar la osmolaridad, que debe ser de 290-295 mOsm (ajuste, si es necesario, solo hacia abajo). Después, enfriar la solución a 0-2 °C.
3. Preparar la solución aCSF para grabaciones
   1. Preparar una solución artificial de líquido cefalorraquídeo (LCR) para grabaciones que contengan 124 mM de NaCl, 2,8 mM de KCl, 26 mM de NaHCO₃, 1,25 mM de_NaH2PO₄, 1,2 mM de MgSO4, 5 mM de glucosa y 2,5 mM de CaCl₂. Pesar todas las sales de acuerdo con el volumen final deseado, dado en la Tabla 3.
   2. Mientras se mezclan todas las sales en agua desionizada, saturar constantemente con carbógeno (95% O2 y 5%_CO2), como se describe en el paso 1.2.2.
   3. Después de agregar y mezclar todos los ingredientes, ajuste el pH a 7.3 (se puede usar ácido nítrico al 10%) usando un medidor de pH. Use un osmómetro para verificar la osmolaridad, que debe ser de 290-300 mOsm. Después, vierta el aCSF en un vaso de precipitados y mantenga en un baño de agua a 30 ° C.

2. Disección cerebral y corte

NOTA: Dado que diferentes estructuras cerebrales pueden requerir cortes en diferentes planos (cortes coronales, sagitales u horizontales), el enfoque exacto para obtener los cortes depende de la región del cerebro de interés. Típicamente, para estudiar las células que expresan Kiss1 en las neuronas AVPV / PeN y ARH (aquí denominadas neuronas^Kisspeptina AVPV / PeN y neuronas^kisspeptina ARH; Figura 2A,B), los cortes cerebrales coronales (200-300 μm) se hacen generalmente 17,19,20,21,34. Las neuronas AVPV/PeN^Kisspeptina se encuentran aproximadamente a 0,5 a -0,22 mm del bregma, mientras que las neuronas ARH^kisspeptina están en -1,22 a -2,70 mm. La ubicación de los núcleos se puede determinar mediante el uso de un atlas cerebral de ratón estereotáxico³⁵ o el Atlas de referencia del cerebro del ratón Allen (http://mouse.brain-map.org/). En este estudio se utilizaron ratones adultos Kiss1-Cre/GFP hembra (etapa diestral) y machos³⁶.

1. Extirpación del cerebro
   1. Prepare el sitio de disección y las herramientas necesarias para extraer el cerebro: tijeras de decapitación, tijeras de iris, tijeras curvas Castroviejo, osteotomo, pinzas, espátula, papel de filtro, placa de Petri, cuchilla de afeitar y pegamento de cianoacrilato.
   2. Antes de hacer las rodajas, prepare el banco en el que se realizará la disección, ya que todos los procedimientos posteriores deben realizarse rápidamente. Asegúrese de tener acceso a un dispositivo de corte como un vibratome.
   3. Prepare una cámara de grabación para mantener las rebanadas de cerebro antes de cortar el tejido. Adquiera una cámara de grabación, dimensiones de baño de 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x W x H), de una marca comercial (Tabla de materiales) o haga una internamente.
      NOTA: Una cámara de recuperación interna se puede fabricar de la siguiente manera: corte una placa de 24 pocillos para que haya nueve pozos disponibles. Pegue una pantalla de nylon a la base de los nueve pocillos. Con el resto de la placa del pozo, haz una base para que la parte inferior del nylon quede libre. Esta base adaptada se puede colocar dentro de un vaso de precipitados de 500 ml que contiene el aCSF (Figura complementaria 1).
   4. Después de preparar todo, anestesiar al animal con anestésico inhalado usando 4% -5% de isoflurano. La anestesia debe estar de acuerdo con un protocolo aprobado por el comité de ética. Poco después de que el animal esté inmóvil, realice pruebas de pellizco de cola y pata para asegurarse de que el animal esté profundamente anestesiado.
   5. Decapitar rápidamente a los ratones mientras el corazón todavía está activo para aumentar la viabilidad celular. Cosecha el cerebro rápidamente después de la decapitación.
   6. Con tijeras quirúrgicas, haga una incisión en la piel en la parte superior del cráneo del animal, desde caudal hasta rostral, y retire el cuero cabelludo de la cabeza del animal. A continuación, corte la placa interparietal a lo largo de la sutura sagital con las tijeras del iris y retire el hueso occipital. Deslice el osteotomo debajo del hueso parietal y sáquelo suavemente hasta que el cerebro esté expuesto.
   7. Después de exponer el cerebro, gire la cabeza boca abajo, baje suavemente el cerebro para visualizar el nervio trigémino a cada lado, luego corte el nervio trigémino con tijeras curvas Castroviejo. Después de visualizar el hipotálamo, identifique el nervio óptico y córtelo suavemente.
      NOTA: Tenga cuidado al cortar el nervio óptico, ya que tirar de él desgarrará el área hipotalámica adyacente que contiene el núcleo AVPV / PeN.
   8. Cortar la porción más anterior del lóbulo frontal y extirpar el cerebro por completo. Inmediatamente sumerja el cerebro en la solución de corte hasta adquirir las rodajas.
2. Cortar muestras de cerebro
   1. Coloque el cerebro en papel de filtro (apoyado en una placa de Petri) para secar el exceso de solución. Luego, con una cuchilla de afeitar de corte afilado, realice un corte coronal que separa el tronco encefálico con el cerebelo del resto del tejido.
   2. A continuación, pegue la porción caudal del cerebro a la base del vibratomo y llene la cámara del dispositivo de corte con la solución de corte / aCSF enfriada a 0-2 ° C. Durante el procedimiento, empaque hielo seco alrededor de la cámara de vibratomo para mantener fría la solución de corte.
   3. Inserte la cuchilla de afeitar en el vibratomo y ajuste los parámetros de corte apropiados del dispositivo: velocidad = 3, frecuencia = 9 y alimentación = 250 μm. Utilice una pipeta de transferencia de acrílico (pipeta de vidrio Pasteur invertida unida a una tetina de silicona) para transferir las rodajas a la cámara de recuperación (descrita en el paso 2.1.3) durante el procedimiento de corte de tejido. Espere 60 minutos para la recuperación del tejido después de la adquisición del corte.

3. Sellado de celdas para grabación

1. Asegúrese de que todos los equipos (microscopio, amplificador, digitalizador, micromanipulador y otros) estén encendidos antes de comenzar la grabación.
2. Llene la cámara de grabación, de una marca comercial (Tabla de materiales), unida al microscopio con la solución aCSF para grabaciones. Use una bomba de perfusión para perfundir constantemente el aCSF a una velocidad de 2 ml / min.
3. Transfiera una porción cerebral de interés (una a la vez) a la cámara de grabación. Utilice una pipeta de transferencia de acrílico (pipeta de vidrio Pasteur invertida unida a una tetina de silicona) para transferir las rodajas hipotalámicas a la cámara. Use un anclaje de corte (Tabla de materiales) para sostener el corte de modo que no se mueva durante la perfusión de aCSF.
4. Coloque una rebanada en el centro de la cámara de grabación conectada al microscopio. La posición del corte es crítica para permitir una buena visión de la región deseada bajo el microscopio y para un alcance perfecto de la micropipeta de registro.
5. Utilice la lente de objetivo de baja potencia de un microscopio de inmersión (10x o 20x) para ayudar a posicionar la rebanada y localizar la región de interés.
6. Después de localizar la región de interés, cambie la lente del objetivo a la lente de alta potencia (63x) y enfoque en el nivel del tejido, observando la proteína fluorescente endógena y las formas de las células en la región objetivo para localizar las células de kisspeptina en la superficie del corte cerebral²⁰.
7. Cuando se encuentre una posible celda de destino, márquela en la pantalla del ordenador con el cursor del ratón o dibujando un formato, como un cuadrado, sobre el área de interés. La marca de la pantalla de la computadora ayuda a guiar la posición de la micropipeta de grabación a la célula.
8. Después de determinar la ubicación exacta de la célula diana, levante el objetivo e introduzca la micropipeta registradora llena con la solución interna. Al colocar la micropipeta en el soporte del electrodo, asegúrese de que la solución interna esté en contacto con el electrodo de plata.
   NOTA: Para la preparación, colocación y posicionamiento de micropipetas en el soporte del electrodo, consulte³³.
9. Aplique presión positiva antes de sumergir la micropipeta en la solución de aCSF, para evitar que los residuos entren en la micropipeta, utilizando una jeringa llena de aire de 1-3 ml conectada al soporte de micropipeta a través de un tubo de polietileno (≈130 cm más); aplicar casi 100-200 μL de aire.
10. Usando el micromanipulador, guíe la micropipeta por debajo del centro del objetivo. Mueva los botones del micromanipulador para guiar la micropipeta del eje X-Y-Z hacia la celda de interés.
11. Ajuste el enfoque para ver la punta de la micropipeta y acerque el enfoque, pero no demasiado, a la rodaja. Reduzca la velocidad del micromanipulador y baje lentamente la micropipeta hasta el plano de enfoque. Asegúrese de que la punta de la micropipeta no penetre bruscamente en el corte, sino que descienda lentamente hasta que toque la superficie de la célula/región objetivo.
12. Aplique una ligera presión positiva (≈100 μL) con la jeringa llena de aire de 1-3 ml conectada al soporte de micropipeta para eliminar cualquier residuo de la trayectoria de aproximación.
13. Concéntrese en la célula diana y mueva lentamente el micromanipulador en el eje X-Y-Z para acercar la micropipeta a la célula diana. Al tocar la micropipeta con la célula, se observará un hoyuelo causado por la presión aplicada a través de la punta de la micropipeta (Figura 2C).
14. Después de formar el hoyuelo, debido a la proximidad de la micropipeta a la célula, aplique una succión débil y breve por vía oral (1-2 s) a través del tubo conectado al soporte de micropipeta para generar el sello entre la micropipeta y la célula (sello gigaohm o gigasello >1 GΩ; Figura 2D). Para formar el sello, utilice el modo de abrazadera de voltaje en el software. Para obtener detalles sobre la formación de focas, consulte³³.
15. Si el sello permanece estable (el sello gigaohm debe ser mecánicamente estable y sin interferencia de ruido, determinado por observación durante aproximadamente 1 min), ajuste el voltaje de retención en el potencial de reposo fisiológico más cercano de la celda de interés. Para las neuronas hipotalámicas de kisspeptina, se recomienda -50 mV.
16. Aplicar una breve succión por vía oral (presión negativa) con la micropipeta sellada a la célula para romper la membrana plasmática (Figura 2E). La configuración adecuada de toda la célula se logra cuando la succión se realiza con suficiente fuerza para que la membrana rota no obstruya la micropipeta y no atraiga una porción considerable de la membrana o incluso de la célula.
17. Consulte el manual de configuración del sistema utilizado. Utilice el software (consulte la Tabla de materiales) para verificar y calcular digitalmente la resistencia en serie (SR) y la capacitancia de celda completa (wcc).
18. En el modo de abrazadera de voltaje, después de romper la membrana celular, habilite la opción de celda completa y haga clic en el comando Auto que se refiere a la pestaña de toda la celda. El SR y el wcc de la célula se calcularán automáticamente y el software los mostrará instantáneamente. Estos parámetros también se pueden verificar realizando la prueba de membrana con el amplificador mencionado en la Tabla de materiales³³.
19. Asegúrese de verificar los parámetros de viabilidad celular. Para las neuronas kisspeptina, compruebe que las mediciones electrofisiológicas son: SR < 25 mΩ, resistencia de entrada > 0,3 GΩ y manteniendo el valor absoluto actual < 30 pA (observaciones personales y referencia²¹). El valor medio del wcc de las neuronas AVPV/PeN kisspeptina o^{ARH kisspeptina} es ≈ 10-12 pF en ratones con gónadas intactas²⁰.
20. Monitoree la RS y la capacitancia de estado estacionario de la celda durante los experimentos. Asegúrese de que el SR no cambie más del 20% durante una grabación y que la capacitancia de la membrana sea estable.
21. Compruebe la configuración del software. Crear protocolos específicos para las grabaciones según el tipo de experimento. Para registrar el potencial de membrana en el modo de abrazadera de corriente, con el equipo mencionado en la Tabla de materiales, el filtro de paso bajo filtra las señales electrofisiológicas a 2-4 kHz y analiza los resultados fuera de línea en un software (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el software).
22. Una vez que la configuración de toda la celda se haya logrado correctamente, mida las corrientes sinápticas en modo de abrazadera de voltaje (Figura 2G). Registrar los cambios en el potencial de membrana en reposo (RMP) y las variaciones de RMP inducidas en el modo de pinza de corriente (Figura 2H). Los cambios en la PMR, como la despolarización de la membrana celular, pueden ser inducidos mediante la administración de un fármaco/neurotransmisor conocido al baño (descrito en el paso 3.2), como se ilustra en la Figura 1.
    NOTA: En el modo de abrazadera de corriente, se puede inyectar corriente positiva o negativa para mantener el voltaje de la membrana a un voltaje deseado. Para las neuronas kisspeptina, generalmente establecemos una inyección de corriente cero (I = 0) para registrar la variación espontánea del potencial de membrana.

Resultados

Para estudiar los posibles efectos de la hormona de crecimiento recombinante humana (hGH) sobre la actividad de las neuronas kisspeptina hipotalámicas, realizamos registros de pinza de parche de células enteras en cortes cerebrales y evaluamos si esta hormona causa cambios agudos en la actividad de las neuronas AVPV / PeN kisspeptina y ARH^kisspeptina. En este estudio se utilizaron ratones adultos Kiss1-Cre/GFP hembra (etapa diestral) y machos³⁶. Se seleccionaron animales c...

Discusión

El desarrollo de la técnica de patch-clamp de células enteras tuvo un impacto significativo en la comunidad científica, siendo considerado de suma importancia para desarrollar la investigación científica y permitir varios descubrimientos. Su impacto en la ciencia fue suficiente para culminar en el Premio Nobel de Medicina en 1991, ya que este descubrimiento abrió la puerta a una mejor comprensión de cómo funcionan los canales iónicos en condiciones fisiológicas y patológicas, así como a la

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP	Sigma Aldrich/various	A9187
CaCl2	Sigma Aldrich/various	C7902
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich/various	G7021
EGTA	Sigma Aldrich/various	O3777
HEPES	Sigma Aldrich/various	H3375
KCL	Sigma Aldrich/various	P5405
K-gluconate	Sigma Aldrich/various	G4500
KOH	Sigma Aldrich/various	P5958
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M9272
MgSO4	Sigma Aldrich/various	230391
NaCl	Sigma Aldrich/various	S5886
NaH2PO4	Sigma Aldrich/various	S5011
NaHCO3	Sigma Aldrich/various	S5761
nitric acid	Sigma Aldrich/various	225711	CAUTION
Sucrose	Sigma Aldrich/various	S1888
Equipments
Air table	TMC	63-534
Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Computer	various	-
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM	Molecular Devices	DD1440
Digital peristaltic pump	Ismatec	ISM833C
Faraday cage	TMC	81-333-03
Imaging Camera	Leica	DFC 365 FX
Micromanipulator	Sutter Instruments	Roe-200
Micropipette Puller	Narishige	PC-10
Microscope	Leica	DM6000 FS
Osteotome	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	128
Recovery chamber	Warner Instruments/Harvard apparatus	-	can be made in-house
Recording chamber	Warner Instruments	640277
Spatula	Fisher Scientific /various	FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome	Leica	VT1000 S
Water Bath	Fisher Scientific /various	Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software	Molecular Devices	-	Commander Software
LAS X wide field system	Leica	-	Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B	Molecular Devices	MULTICLAMP 700B	Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS	Molecular Devices	Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm	Warner Instruments	64-1309
Curved hemostatic forcep	various	-
cyanoacrylate glue	LOCTITE/various	-
Decapitation scissors	various	-
Filter paper	various	-
Glass capillaries (micropipette)	World Precision Instruments, Inc	TW150F-4
Iris scissors	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	65-66
Pasteur glass pipette	Sigma Aldrich/various	CLS7095B9-1000EA
Petri dish	various	-
Polyethylene tubing	Warner Instruments	64-0756
Razor blade for brain dissection	TED PELLA	TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome	TED PELLA	TEDP-121-9
Scissors	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	71-72, 48,49;
silicone teat	various	-
Slice Anchor	Warner Instruments	64-0246
Syringe filters	Merck Millipore Ltda	SLGVR13SL	Millex-GV 0.22 μm
Tweezers	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	131, 1518