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要約

ここでは、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)細胞の主要なモジュレーターであるキスペプチンニューロンを含む脳スライスに対して全細胞パッチクランプを実行するためのプロトコルを提示します。キスペプチンニューロンの活動に関する知識を加えることにより、この電気生理学的ツールは、過去20年間に神経内分泌学分野の重要な進歩の基礎として機能してきました。

要約

キスペプチンは、視床下部-下垂体-性腺(HPG)軸の成熟と生殖能力に不可欠です。視床下部のキスペプチンニューロンは、視床下部の弓状核と同様に、前腹側脳室周囲核および吻側脳室周囲核に位置し、他の細胞の中でもとりわけゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)ニューロンに投射する。以前の研究では、キスペプチンシグナル伝達がKiss1受容体(Kiss1r)を介して発生し、最終的にGnRHニューロン活性を刺激することが示されています。ヒトおよび実験動物モデルでは、キスペプチンはGnRH分泌を誘導するのに十分であり、その結果、黄体形成ホルモン(LH)および卵胞刺激ホルモン(FSH)の放出を誘導するのに十分である。キスペプチンは生殖機能に不可欠な役割を果たすため、視床下部キスペプチンニューロンの固有の活動が生殖関連の行動にどのように寄与するかを評価し、これらの特性を変化させることができる主要な神経伝達物質/神経調節物質を特定するために取り組んでいます。全細胞パッチクランプ技術は、げっ歯類細胞におけるキスペプチンニューロン活性を調査するための貴重なツールとなっています。この実験技術により、研究者は自発的な興奮性および抑制性のイオン電流、静止膜電位、活動電位の発火、および細胞膜の他の電気生理学的特性を記録および測定できます。本研究では、視床下部キスペプチンニューロンを定義する電気生理学的測定として知られる全細胞パッチクランプ法の重要な側面と、その技術に関する関連する問題の議論をレビューします。

概要

ホジキンとハクスリーは、いくつかの科学的研究で説明されている活動電位の最初の細胞内記録を作成しました。この記録は、大きな直径(~500μm)を持つイカ軸索で行われ、軸索の内側に微小電極を配置することができました。この研究は科学研究に大きな可能性を提供し、後に活動電位発生1,2,3,4,5,6,7,8のイオン基盤を研究するために使用された電圧クランプモードの作成に至りました。何年にもわたって、技術は改善され、科学研究に広く適用されるようになりました6,9。Erwin NeherとBert Sakmannによって開始された研究を通じて1970年代後半に行われたパッチクランプ技術の発明により、研究者は単一の電極のみを使用して、ほぼすべてのタイプの細胞における単一のイオンチャネルと細胞内膜電位または電流を記録することができました9,10,11,12.パッチクランプ記録は、培養細胞または組織スライスなどの様々な組織調製物に対して、電圧クランプモード(例えば、電圧依存性電流およびシナプス電流の記録を可能にする)または電流クランプモード(例えば、イオン電流によって誘発される休止膜電位の変化の記録を可能にする)のいずれかで行うことができる。 活動電位、およびシナプス後電位頻度)。

パッチクランプ技術の使用は、いくつかの注目すべき発見を可能にしました。実際、視床下部のキスペプチンニューロンは、第3脳室の吻側脳室周囲領域(RP3V)としても知られる前腹側脳室周囲および吻側脳室周囲核(AVPV/PeNKisspeptin)および視床下部の弓状核(ARHキスペプチン)に位置する視床下部キスペプチンニューロンの電気生理学的特性に関する独創的な発見13,14,15特に興味深いものです。2010年、Ducretらは、別の電気生理学的ツールであるルーズセルパッチクランプ技術を使用して、マウスのAVPV / PeNキスペプチンニューロンの最初の記録を行いました。これらの研究は、AVPV/PeNキスペプチンニューロンの電気的記述を提供し、それらの発火パターンが発情周期依存性であることを示しました16。2011年、Qiuらは全細胞パッチクランプ技術を用いて、ARHキスペプチンニューロンが内因性ペースメーカー電流を発現することを実証した17。続いて、Gottschらは、キスペプチンニューロンが自発的な活動を示し、h型(ペースメーカー)およびT型カルシウム電流の両方を発現することを示し、ARHキスペプチンニューロンが他の中枢神経系ペースメーカーニューロンと電気生理学的特性を共有することを示唆している18。さらに、ARHキスペプチンニューロンは性的に二形性の発火率を示し、AVPV / PeNキスペプチンニューロンはATP感受性カリウムチャネル(KATP)の影響を受ける二峰性の静止膜電位(RMP)を示すことが実証されています19,20。さらに、性腺ステロイドがマウスのキスペプチンニューロンの自発的な電気的活動にプラスの影響を与えることが確立された19,20,21。キスペプチンニューロンの電気生理学的特性を研究した最初の作品は、16,17,18,19,20に言及されています。それ以来、多くの研究が全細胞パッチクランプ技術を使用して、キスペプチンニューロンの電気的活動を調節するのにどの因子/神経調節物質が十分であるかを実証してきました(図1)17、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31,32。

本稿では、再生に必要な神経細胞の研究におけるこの技術の重要性を踏まえ、本稿では、溶液の調製、脳の解剖とスライス、記録のための細胞膜の封印など、全細胞パッチクランプ技術の開発のための基本的な手順について説明します。さらに、その利点、技術的な限界、最適な実験性能のために制御しなければならない重要な変数など、この技術に関する関連する問題が議論されています。

プロトコル

すべての動物の手順は、サンパウロ大学の生物医科学研究所の動物倫理委員会によって承認され、ブラジル動物実験大学によって採用された倫理ガイドラインに従って実施されました。

1.溶液の調製

  1. 内部溶液の調製
    注意: 内部溶液はパッチクランプマイクロピペットを満たし、細胞の内部に接触します( 図2の例を参照)。内部溶液は、測定される活性のタイプに応じて変化し得る33。
    1. 実験目的と適切なレコードタイプを考慮して内部ソリューションを選択します。電流クランプモードで膜電位を記録するには、120 mM K-グルコン酸塩、1 mM NaCl、5 mM EGTA、10 mM HEPES、1 mM MgCl 2、1 mM CaCl2、3 mM KOH、10 mM KCl、および4 mM(Mg)-ATPで構成される内部溶液を使用します。表1に示すように、所望の最終容量に従ってすべての塩を秤量する。
    2. 溶液の最終体積の90%に達するのに十分な脱イオン水を使用してください。この容量は、pHと浸透圧を調整するのに十分なスペースを確保します。
    3. すべての成分を完全に添加して混合した後、pHメーターを使用して5 M KOHでpHを7.2〜7.3に調整します。浸透圧計を使用して、約275〜280 mOsmの浸透圧を確認します(必要に応じて、ダウンのみを調整します)。
    4. 内部溶液を事前に調製し、8°Cで保存してください。 実験当日にATPを追加します。ATP含有内部溶液を-20°C(1 mLアリコート)で3〜4か月間保存します。.
  2. スライス液の調製
    1. 238 mM スクロース、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO3、1.0 mM NaH 2 PO4、10 mM グルコース、1.0 mM CaCl 2、および5.0 mM MgCl2を含むスライス溶液を調製します。表2に示すように、所望の最終容量に従ってすべての塩を秤量する。調製するこの溶液の正確な量は、切断チャンバのサイズによって異なります。
    2. 脱イオン水中ですべての塩を混合しながら、常にカルボゲン(95%O 2および5%CO2)で飽和させる。ポリエチレンチューブ(外径1.57 mm[OD] x 内径1.14 mm[ID])をカルボゲンシリンダーに取り付けて、スライス溶液にカルボゲンを供給します。スライス液を含むビーカーの内側にチューブの開放端を保持します。
    3. すべての成分をよく混ぜた後、pHメーターを使用して10%硝酸でpHを7.3に調整します。浸透圧計を使用して、290〜295 mOsmの浸透圧を確認します(必要に応じて、下方向にのみ調整します)。その後、溶液を0〜2°Cに冷却する。
  3. 録画用の CSF ソリューションを準備する
    1. 124 mM NaCl、2.8 mM KCl、26 mM NaHCO3、1.25 mM NaH 2 PO 4、1.2 mM MgSO4、5 mM グルコース、および2.5 mM CaCl2を含む記録用の人工脳脊髄液(aCSF)溶液を調製します。表3に示す所望の最終容量に従って全ての塩を秤量する。
    2. 脱イオン水中で全ての塩を混合しながら、ステップ1.2.2で説明したように、カルボゲン(95%O2および5%CO2)で絶えず飽和させる。
    3. すべての成分を加えて混合した後、pHメーターを使用してpHを7.3に調整します(10%硝酸を使用できます)。浸透圧計を使用して、290〜300 mOsmの浸透圧を確認します。その後、aCSFをビーカーに注ぎ、30°Cの水浴中に維持する。

2.脳の解剖とスライス

注:異なる脳構造は異なる平面(冠状、矢状、または水平スライス)での切断を必要とする場合があるため、スライスを取得するための正確なアプローチは、関心のある脳領域によって異なります。典型的には、AVPV/PeNおよびARH(ここではAVPV/PeNキスペプチンニューロンおよびARHキスペプチンニューロンと呼ばれる)におけるKiss1発現細胞を研究する。図2A、B)、冠状脳スライス(200〜300μm)は、通常、17、19、20、21、34で作られる。AVPV / PeNキスペプチンニューロンはブレグマから約0.5〜-0.22 mmに位置し、ARHキスペプチンニューロンは-1.22〜-2.70 mmに位置しています。核位置は、定位固定装置マウス脳アトラス35またはアレンマウス脳参照アトラス(http://mouse.brain-map.org/)を用いて決定することができる。この研究では、成体のKiss1-Cre / GFP雌(発情期)および雄マウス36を使用しました。

  1. 脳の除去
    1. 解剖部位と脳の抽出に必要なツールを準備します:断頭ハサミ、アイリスハサミ、カストロビエホ湾曲ハサミ、骨切り、ピンセット、ヘラ、ろ紙、ペトリ皿、かみそりの刃、シアノアクリレート接着剤。
    2. スライスを作成する前に、その後のすべての手順を迅速に実行する必要があるため、解剖が実行されるベンチを準備します。ビブラトームなどのスライス装置にアクセスできることを確認してください。
    3. 組織をスライスする前に、脳スライスを維持するための記録チャンバーを準備します。市販ブランド(材料表)から、浴寸法24 mm x 15 mm x 2 mm(長さ x 幅 x 高さ)の記録室を入手するか、社内で作成します。
      注:社内回収チャンバーは次のように製造できます:9つのウェルが利用可能になるように24ウェルプレートをカットします。ナイロンスクリーンを9つのウェルのベースに接着します。ウェルプレートの残りの部分で、ナイロンの下部が自由になるようにベースを作ります。この適合ベースは、aCSFを含む500mLビーカーの中に入れることができます(補足図1)。
    4. すべてを準備した後、4%〜5%イソフルランを使用して吸入麻酔薬で動物を麻酔します。麻酔は、倫理委員会によって承認されたプロトコルに従っていなければなりません。動物が動かなくなった直後に、尾と足のピンチテストを実行して、動物が深く麻酔をかけられていることを確認します。
    5. 心臓がまだ活動している間にマウスをすばやく斬首して、細胞の生存率を高めます。斬首後すぐに脳を収穫します。
    6. 外科用ハサミで、動物の頭蓋骨の上部、尾側から吻側まで皮膚を切開し、動物の頭から頭皮を取り除きます。次に、虹彩ハサミで矢状縫合糸に沿って頭頂間板を切り、後頭骨を取り除きます。骨切りを頭頂骨の下にスライドさせ、脳が露出するまでそっと引き出します。
    7. 脳を露出させた後、頭を逆さまにし、脳をそっと下げて両側の三叉神経を視覚化し、カストロビエホ湾曲ハサミを使用して三叉神経を切ります。視床下部を視覚化した後、視神経を特定し、穏やかに切断します。
      注:視神経を切断するときは、視神経を引っ張るとAVPV / PeN核を含む隣接する視床下部領域が裂けるため、注意してください。
    8. 前頭葉の最も前部を切断し、脳を完全に切除します。スライスを取得するまで、すぐに脳をスライス溶液に浸します。
  2. 脳サンプルのスライス
    1. 脳をろ紙(ペトリ皿で支えられている)の上に置き、余分な溶液を乾燥させます。次に、鋭い切断かみそりの刃で、脳幹と小脳を残りの組織から分離する冠状切断を実行します。
    2. 次に、脳の尾部をビブラトームの基部に接着し、スライス装置のチャンバーに0〜2°Cに冷却したスライス/ aCSF溶液を満たします。 手順の間、ビブラトームチャンバーの周りにドライアイスを詰めて、スライス液を冷たく保ちます。
    3. かみそりの刃をビブラトームに挿入し、デバイスの適切な切断パラメータを設定します:速度= 3、周波数= 9、および送り= 250μm。アクリルトランスファーピペット(シリコン乳首に取り付けられた逆パスツールガラスピペット)を使用して、組織スライス手順中にスライスを回収チャンバーに移します(ステップ2.1.3で説明)。スライス取得後の組織回復を60分待ちます。

3.記録のためのセルシーリング

  1. 記録を開始する前に、すべての機器(顕微鏡、アンプ、デジタイザー、マイクロマニピュレーターなど)がオンになっていることを確認してください。
  2. 顕微鏡に取り付けられた市販ブランド(材料表)の記録室に、記録用のaCSF溶液を充填します。灌流ポンプを使用して、aCSFを2 mL / minの速度で常に灌流します。
  3. 目的の脳スライスを(一度に1つずつ)記録チャンバーに移します。アクリルトランスファーピペット(シリコン乳首に取り付けられた逆パスツールガラスピペット)を使用して、視床下部スライスをチャンバーに移します。スライスアンカー(材料表)を使用してスライスを保持し、aCSF灌流中にスライスが動かないようにします。
  4. 顕微鏡に取り付けられた記録室の中央にスライスを置きます。スライス位置は、顕微鏡下で目的の領域をよく観察し、記録マイクロピペットに完全に到達させるために重要です。
  5. 液浸顕微鏡の低倍率対物レンズ(10倍または20倍)を使用して、スライスの位置決めと関心領域の位置決めを支援します。
  6. 関心領域を特定した後、対物レンズを高倍率レンズ(63倍)に切り替えて組織レベルに焦点を合わせ、内因性蛍光タンパク質および標的領域内の細胞の形状を観察して、脳スライス20の表面上のキスペプチン細胞を見つける。
  7. 可能なターゲットセルが見つかったら、マウスカーソルを使用するか、関心のある領域に正方形などのフォーマットを描画して、コンピューター画面上でマークします。コンピューターのスクリーンマークは、記録マイクロピペットの位置をセルに導くのに役立ちます。
  8. ターゲットセルの正確な位置を決定したら、対物レンズを持ち上げ、内部溶液で満たされた記録マイクロピペットを導入します。マイクロピペットを電極ホルダーに入れるときは、内部溶液が銀電極に接触していることを確認してください。
    注意: マイクロピペットの準備、配置、および電極ホルダーへの位置決めについては、33を参照してください。
  9. マイクロピペットをaCSF溶液に浸す前に陽圧をかけ、破片がマイクロピペットに入るのを防ぐために、ポリエチレンチューブ(≈130 cm長い)を介してマイクロピペットホルダーに接続された1〜3 mLの空気充填シリンジを使用します。約100〜200μLの空気を塗布します。
  10. マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットを対物レンズの中央の下にガイドします。マイクロマニピュレーターのボタンを動かして、X-Y-Z軸上のマイクロピペットを目的のセルに向かってガイドします。
  11. マイクロピペットの先端が見えるようにフォーカスを調整し、フォーカスをスライスに近づけすぎないようにします。マイクロマニピュレーターの速度を落とし、マイクロピペットを焦点面までゆっくりと下げます。マイクロピペットチップがスライスに突然浸透するのではなく、細胞/標的領域の表面に触れるまでゆっくりと下降することを確認してください。
  12. マイクロピペットホルダーに取り付けられた1〜3 mLの空気充填シリンジを使用して、軽い陽圧(≈100 μL)を適用して、アプローチパスから破片を取り除きます。
  13. ターゲットセルに焦点を合わせ、マイクロマニピュレーターをX-Y-Z軸上でゆっくりと動かして、マイクロピペットをターゲットセルに近づけます。マイクロピペットを細胞に触れると、マイクロピペットチップに加えられる圧力によって引き起こされるディンプルが観察されます(図2C)。
  14. ディンプルを形成した後、マイクロピペットが細胞に近接しているため、マイクロピペットホルダーに接続されたチューブを介して口から弱く短時間吸引し(1〜2秒)、マイクロピペットとセルの間にシールを生成します(ギガオームシールまたはギガシール>1GΩ; 図2D)。シールを形成するには、ソフトウェアの電圧クランプモードを使用します。シール形成の詳細については、33を参照してください。
  15. シールが安定している場合(ギガオームシールは機械的に安定しており、ノイズ干渉がなく、約1分間の観察によって決定される)、保持電圧を目的のセルの最も近い生理学的静止電位に設定します。キスペプチン視床下部ニューロンの場合、-50mVが推奨されます。
  16. 細胞に密封されたマイクロピペットで口から短時間吸引(陰圧)を加え、原形質膜を破壊します(図2E)。破裂したメンブレンがマイクロピペットを詰まらせず、メンブレンのかなりの部分またはセルを引き付けないように、十分な力で吸引が行われると、適切な全セル構成が達成されます。
  17. 使用しているシステム設定マニュアルを確認してください。ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、直列抵抗(SR)とセル全体の容量(wcc)をデジタルで確認および計算します。
  18. 電圧クランプモードでは、細胞膜を破壊した後、セル全体オプションを有効にし、セルタブ全体を参照して自動コマンドをクリックします。セルのSRとwccは自動的に計算され、ソフトウェアによって即座に表示されます。これらのパラメータは、 材料表33に記載されている増幅器で膜試験を行うことによっても確認することができる。
  19. 細胞生存率パラメータを必ず確認してください。キスペプチンニューロンの場合、電気生理学的測定値がSR < 25 mΩ、入力抵抗>0.3 GΩ、および保持電流絶対値が30 pA<であることを確認します(個人的な観察および参考文献21)。AVPV/PeNキスペ プチンまたはARHキスペプチン ニューロンのwccの平均値は、生殖腺インタクトマウスでは10-12pF≈20である。
  20. 実験中にSRとセルの定常静電容量を監視します。記録中にSRが20%を超えて変化せず、膜静電容量が安定していることを確認してください。
  21. ソフトウェアの設定を確認してください。実験の種類に応じて、録音用の特定のプロトコルを作成します。 材料表に記載されている機器を使用して、電流クランプモードで膜電位を記録するには、2〜4 kHzで電気生理学的信号をローパスフィルタリングし、ソフトウェアでオフラインで結果を分析します(ソフトウェア情報については、 材料の表 を参照してください)。
  22. セル全体の構成が適切に達成されたら、電圧クランプモードでシナプス電流を測定します(図2G)。静止膜電位(RMP)の変化と電流クランプモードでの誘導RMP変動を記録します(図2H)。細胞膜の脱分極などのRMPの変化は、 図1に示すように、既知の薬物/神経伝達物質を浴に投与することによって誘発できます(ステップ3.2に記載)。
    注意: 電流クランプモードでは、正または負の電流を注入して、膜電圧を目的の電圧に保持できます。キスペプチンニューロンの場合、通常、膜電位の自発的な変化を記録するためにゼロ電流注入(I = 0)を設定します。

結果

視床下部キスペプチンニューロンの活動に対するヒト組換え成長ホルモン(hGH)の可能な影響を研究するために、脳スライスで全細胞パッチクランプ記録を行い、このホルモンがAVPV / PeNキスペプチンおよびARHキスペプチンニューロンの活性に急性変化を引き起こすかどうかを評価しました。この研究では、成体のKiss1-Cre / GFP雌(発情期)および雄マウス36を使用?...

ディスカッション

全細胞パッチクランプ技術の開発は科学界に大きな影響を与え、科学研究を発展させ、いくつかの発見を可能にするために最も重要であると考えられていました。科学への影響は、1991年にノーベル医学賞を受賞するのに十分であり、この発見は、生理学的および病理学的条件下でイオンチャネルがどのように機能するかについてのより良い理解と、治療薬の潜在的な標的の特定への扉を開い...

開示事項

宣言される利益相反はありません。

謝辞

本研究は、サンパウロ研究財団[FAPESP助成金番号:2021/11551-4(JNS)、2015/20198-5(TTZ)、2019/21707/1(RF)、およびCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001" (HRV)の支援を受けた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATPSigma Aldrich/variousA9187
CaCl2Sigma Aldrich/variousC7902
D-(+)-GlucoseSigma Aldrich/variousG7021
EGTASigma Aldrich/variousO3777
HEPESSigma Aldrich/variousH3375
KCLSigma Aldrich/variousP5405
K-gluconateSigma Aldrich/variousG4500
KOHSigma Aldrich/variousP5958
MgCl2Sigma Aldrich/variousM9272
MgSO4Sigma Aldrich/various230391
NaClSigma Aldrich/variousS5886
NaH2PO4 Sigma Aldrich/variousS5011
NaHCO3Sigma Aldrich/variousS5761
nitric acidSigma Aldrich/various225711CAUTION
SucroseSigma Aldrich/variousS1888
Equipments
Air tableTMC63-534
AmplifierMolecular DevicesMulticlamp 700B
Computervarious-
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEMMolecular DevicesDD1440
Digital peristaltic pumpIsmatecISM833C 
Faraday cageTMC81-333-03
Imaging CameraLeicaDFC 365 FX
MicromanipulatorSutter InstrumentsRoe-200
Micropipette PullerNarishigePC-10
MicroscopeLeicaDM6000 FS
OsteotomeBonther equipamentos & Tecnologia/various128
Recovery chamberWarner Instruments/Harvard apparatus-can be made in-house
Recording chamberWarner Instruments640277
SpatulaFisher Scientific /variousFISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome LeicaVT1000 S
Water Bath Fisher Scientific /variousIsotemp
Software and systems
AxoScope 10 softwareMolecular Devices-Commander Software
LAS X wide field systemLeica-Image acquisition and analysis
MultiClamp 700BMolecular DevicesMULTICLAMP 700BCommander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWSMolecular DevicesPclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mmWarner Instruments64-1309
Curved hemostatic forcepvarious-
cyanoacrylate glueLOCTITE/various-
Decapitation scissorsvarious-
Filter papervarious-
Glass capillaries (micropipette)World Precision Instruments, IncTW150F-4
Iris scissorsBonther equipamentos & Tecnologia/various65-66
Pasteur glass pipette Sigma Aldrich/variousCLS7095B9-1000EA
Petri dishvarious-
Polyethylene tubing Warner Instruments64-0756
Razor blade for brain dissectionTED PELLATEDP-121-1
Razor blade for the vibratomeTED PELLATEDP-121-9
ScissorsBonther equipamentos & Tecnologia/various71-72, 48,49; 
silicone teatvarious-
Slice Anchor Warner Instruments64-0246
Syringe filtersMerck Millipore LtdaSLGVR13SLMillex-GV 0.22 μm
TweezersBonther equipamentos & Tecnologia/various131, 1518

参考文献

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