Neuroni ipotalamici di kisspeptina come bersaglio per le registrazioni di patch-clamp a cellule intere

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un patch-clamp a cellule intere su fette di cervello contenenti neuroni kisspeptina, il modulatore primario delle cellule dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH). Aggiungendo conoscenze sull'attività dei neuroni kisspeptina, questo strumento elettrofisiologico è servito come base per progressi significativi nel campo della neuroendocrinologia negli ultimi 20 anni.

Abstract

Le kisspeptine sono essenziali per la maturazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-gonadia (HPG) e la fertilità. I neuroni kisspeptina ipotalamici situati nel nucleo periventricolare anteroventrale e nel nucleo periventricolare rostrale, così come il nucleo arcuato dell'ipotalamo, proiettano i neuroni dell'ormone di rilascio della gonadotropina (GnRH), tra le altre cellule. Studi precedenti hanno dimostrato che la segnalazione della kisspeptina avviene attraverso il recettore Kiss1 (Kiss1r), in ultima analisi, eccitando l'attività dei neuroni GnRH. Nell'uomo e nei modelli animali sperimentali, le kisspeptine sono sufficienti per indurre la secrezione di GnRH e, di conseguenza, il rilascio di ormone luteinizzante (LH) e ormone follicolo-stimolante (FSH). Poiché le kisspeptine svolgono un ruolo essenziale nelle funzioni riproduttive, i ricercatori stanno lavorando per valutare come l'attività intrinseca dei neuroni ipotalamici della kisspeptina contribuisca alle azioni correlate alla riproduzione e identificare i neurotrasmettitori primari / neuromodulatori in grado di modificare queste proprietà. La tecnica patch-clamp dell'intera cellula è diventata uno strumento prezioso per studiare l'attività dei neuroni kisspeptina nelle cellule dei roditori. Questa tecnica sperimentale consente ai ricercatori di registrare e misurare le correnti ioniche eccitatorie e inibitorie spontanee, il potenziale di membrana a riposo, il potenziale d'azione e altre proprietà elettrofisiologiche delle membrane cellulari. Nel presente studio, vengono esaminati aspetti cruciali della tecnica patch-clamp dell'intera cellula, nota come misurazioni elettrofisiologiche che definiscono i neuroni kisspeptin ipotalamici e una discussione di questioni rilevanti sulla tecnica.

Introduzione

Hodgkin e Huxley hanno fatto la prima registrazione intracellulare di un potenziale d'azione descritto in diversi studi scientifici. Questa registrazione è stata eseguita sull'assone del calamaro, che ha un grande diametro (~ 500 μm), consentendo di posizionare un microelettrodo all'interno dell'assone. Questo lavoro ha fornito grandi possibilità per la ricerca scientifica, culminando in seguito nella creazione del modo di morsetto di tensione, che è stato utilizzato per studiare la base ionica della generazione del potenziale d'azione 1,2,3,4,5,6,7,8. Nel corso degli anni, la tecnica è stata migliorata ed è diventata ampiamente applicata nella ricerca scientifica ^6,9. L'invenzione della tecnica patch-clamp, avvenuta alla fine del 1970 attraverso studi avviati da Erwin Neher e Bert Sakmann, ha permesso ai ricercatori di registrare singoli canali ionici e potenziali o correnti di membrana intracellulare praticamente in ogni tipo di cellula utilizzando un solo elettrodo 9,10,11,12. Le registrazioni patch-clamp possono essere effettuate su una varietà di preparati tissutali, come cellule coltivate o fette di tessuto, in modalità tension-clamp (mantenendo la membrana cellulare a una tensione impostata che consente la registrazione, ad esempio, di correnti dipendenti dalla tensione e correnti sinaptiche) o in modalità current-clamp (consentendo la registrazione, ad esempio, delle variazioni del potenziale di membrana a riposo indotte da correnti ioniche, potenziali d'azione e frequenza del potenziale postsinaptico).

L'uso della tecnica patch-clamp ha reso possibili diverse scoperte degne di nota. Infatti, i risultati seminali sulle proprietà elettrofisiologiche dei neuroni ipotalamici kisspeptin situati nei nuclei periventricolare anteroventrale e periventricolare rostrale (AVPV / PeN Kisspeptin), noto anche come area periventricolare rostrale del terzo ventricolo (RP3V), e il nucleo arcuato dell'ipotalamo (ARH^kisspeptin)^13,14,15 sono di particolare interesse. Nel 2010, Ducret et al. hanno eseguito le prime registrazioni di neuroni AVPV / PeN^Kisspeptinnei topi utilizzando un altro strumento elettrofisiologico, la tecnica patch-clamp a cellule sciolte. Questi studi hanno fornito una descrizione elettrica dei neuroni AVPV/PeN^Kisspeptin e hanno dimostrato che i loro schemi di attivazione sono estrali dipendenti dal ciclo¹⁶. Nel 2011, Qiu et al. hanno utilizzato la tecnica dell'intero patch-clamp cellulare per dimostrare che i neuroni ARH^kisspeptin esprimono correnti pacemaker endogene¹⁷. Successivamente, Gottsch et al. hanno dimostrato che i neuroni kisspeptin mostrano attività spontanea ed esprimono sia correnti di calcio di tipo H (pacemaker) che di tipo T, suggerendo che i neuroni ARH^kisspeptin condividono proprietà elettrofisiologiche con altri neuroni pacemaker del sistema nervoso centrale¹⁸. Inoltre, è stato dimostrato che i neuroni ARH kisspeptin mostrano velocità di attivazione sessualmente dimorfiche e che i neuroni AVPV/PeN^Kisspeptin mostrano un potenziale di membrana a riposo bimodale (RMP) influenzato dai canali del potassio sensibili all'ATP (K_ATP)^19,20. Inoltre, è stato stabilito che gli steroidi gonadici influenzano positivamente l'attività elettrica spontanea dei neuroni kisspeptina nei topi 19,20,21. I primi lavori che studiano le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni kisspeptina sono menzionati 16,17,18,19,20. Da allora, molti studi hanno utilizzato la tecnica patch-clamp dell'intera cellula per dimostrare quali fattori/neuromodulatori sono sufficienti a modulare l'attività elettrica dei neuroni kisspeptina (Figura 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,^31,32.

Data l'importanza di questa tecnica per lo studio dei neuroni necessari per la riproduzione, tra gli altri tipi di cellule non trattati qui, questo articolo descrive i passaggi fondamentali per lo sviluppo della tecnica patch-clamp dell'intera cellula, come la preparazione delle soluzioni, la dissezione e il taglio del cervello e l'esecuzione del sigillo della membrana cellulare per le registrazioni. Inoltre, vengono discusse questioni rilevanti sulla tecnica, come i suoi vantaggi, i limiti tecnici e le variabili importanti che devono essere controllate per prestazioni sperimentali ottimali.

Protocollo

Tutte le procedure animali sono state approvate dal Comitato Etico degli Animali dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo e sono state eseguite secondo le linee guida etiche adottate dal Collegio brasiliano di sperimentazione animale.

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparazione della soluzione interna
   NOTA: La soluzione interna riempie la micropipetta patch-clamp e contatterà l'interno della cella (vedere un esempio nella Figura 2). Le soluzioni interne possono variare a seconda del tipo di attività da misurare³³.
   1. Scegliere la soluzione interna considerando il suo scopo sperimentale e il tipo di record appropriato. Per registrare il potenziale di membrana in modalità corrente-mors, utilizzare la soluzione interna composta da 120 mM K-gluconato, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl₂, 3 mM KOH, 10 mM KCl e 4 mM (Mg)-ATP. Pesare tutti i sali secondo il volume finale desiderato, come indicato nel prospetto 1.
   2. Utilizzare abbastanza acqua deionizzata per raggiungere il 90% del volume finale della soluzione. Questo volume garantirà spazio sufficiente per regolare il pH e l'osmolarità.
   3. Dopo aver aggiunto e mescolato accuratamente tutti gli ingredienti, regolare il pH a 7,2-7,3 con 5 M KOH utilizzando un pHmetro. Utilizzare un osmometro per controllare l'osmolarità, che dovrebbe essere di circa 275-280 mOsm (regolare, se necessario, solo verso il basso).
   4. Preparare preventivamente la soluzione interna e conservare a 8 °C. Aggiungi l'ATP il giorno dell'esperimento. Conservare la soluzione interna contenente ATP a -20 °C (1 mL di aliquote) per 3-4 mesi.
2. Preparazione della soluzione di affettatura
   1. Preparare una soluzione affettante contenente 238 mM di saccarosio, 2,5 mM KCl, 26 mM di NaHCO₃, 1,0 mM di NaH 2 PO₄, 10 mM di glucosio, 1,0 mM di CaCl 2 e 5,0 mM di MgCl ₂. Pesare tutti i sali secondo il volume finale desiderato, come mostrato nella tabella 2. Il volume esatto di questa soluzione da preparare dipenderà dalle dimensioni della camera di taglio.
   2. Mescolando tutti i sali in acqua deionizzata, saturare costantemente con carbogeno (95% O 2 e 5% CO₂). Collegare tubi in polietilene (diametro esterno 1,57 mm [OD] x 1,14 mm diametro interno [ID]) a un cilindro di carbogeno per fornire carbogeno alla soluzione di affettatura. Tenere l'estremità aperta del tubo all'interno del becher contenente la soluzione affettata.
   3. Dopo aver mescolato bene tutti gli ingredienti, regolare il pH a 7,3 con acido nitrico al 10% utilizzando un pHmetro. Utilizzare un osmometro per controllare l'osmolarità, che dovrebbe essere 290-295 mOsm (regolare, se necessario, solo verso il basso). Successivamente raffreddare la soluzione a 0-2 °C.
3. Preparare la soluzione aCSF per le registrazioni
   1. Preparare la soluzione di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) per registrazioni contenenti 124 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO₄, 5 mM glucosio e 2,5 mM CaCl₂. Pesare tutti i sali secondo il volume finale desiderato, indicato nella tabella 3.
   2. Mescolando tutti i sali in acqua deionizzata, saturare costantemente con carbogeno (95% O 2 e 5% CO 2), come descritto al punto 1.2.2.
   3. Dopo aver aggiunto e mescolato tutti gli ingredienti, regolare il pH a 7,3 (è possibile utilizzare acido nitrico al 10%) utilizzando un pHmetro. Utilizzare un osmometro per controllare l'osmolarità, che dovrebbe essere 290-300 mOsm. Successivamente, versare l'aCSF in un becher e mantenerlo a bagnomaria a 30 °C.

2. Dissezione del cervello e affettamento

NOTA: Poiché diverse strutture cerebrali possono richiedere il taglio su piani diversi (fette coronali, sagittali o orizzontali), l'approccio esatto per ottenere le fette dipende dalla regione cerebrale di interesse. Tipicamente, per studiare le cellule che esprimono Kiss1 in AVPV / PeN e ARH (qui denominati come neuroni di^kisspeptina AVPV / PeN e neuroni di^kisspeptina ARH; Figura 2A,B), le fette di cervello coronale (200-300 μm) sono solitamente fatte 17,19,20,21,34. I neuroni AVPV/PeN^Kisspeptin si trovano a circa 0,5-0,22 mm dal bregma, mentre i neuroni ARH^kisspeptin sono compresi tra -1,22 e -2,70 mm. La posizione dei nuclei può essere determinata utilizzando un atlante stereotassico del cervello di topo³⁵ o l'Allen Mouse Brain Reference Atlas (http://mouse.brain-map.org/). In questo studio sono stati utilizzati topi adulti Kiss1-Cre/GFP femmina (stadio di diestro) e topi maschi³⁶.

1. Rimozione del cervello
   1. Preparare il sito di dissezione e gli strumenti necessari per estrarre il cervello: forbici da decapitazione, forbici per iride, forbici curve Castroviejo, osteotomo, pinzette, spatola, carta da filtro, piastra di Petri, lama di rasoio e colla cianoacrilica.
   2. Prima di fare le fette, preparare il banco su cui verrà eseguita la dissezione, poiché tutte le procedure successive devono essere eseguite rapidamente. Assicurati di avere accesso a un dispositivo di affettatura come un vibratomo.
   3. Preparare una camera di registrazione per mantenere le fette di cervello prima di tagliare il tessuto. Acquista una camera di registrazione, dimensioni del bagno di 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x L x A), da un marchio commerciale (Table of Materials) o creane uno in-house.
      NOTA: Una camera di recupero interna può essere fabbricata come segue: tagliare una piastra da 24 pozzetti in modo che siano disponibili nove pozzi. Incollare uno schermo di nylon alla base dei nove pozzetti. Con il resto della piastra del pozzo, fare una base in modo che la parte inferiore del nylon sia libera. Questa base adattata può essere collocata all'interno di un becher da 500 mL contenente l'aCSF (Figura supplementare 1).
   4. Dopo aver preparato tutto, anestetizzare l'animale con anestetico inalato usando isoflurano al 4% -5%. L'anestesia deve essere conforme a un protocollo approvato dal comitato etico. Poco dopo che l'animale è immobile, eseguire test di pizzicamento della coda e della zampa per assicurarsi che l'animale sia profondamente anestetizzato.
   5. Decapitare rapidamente i topi mentre il cuore è ancora attivo per aumentare la vitalità cellulare. Raccogli il cervello rapidamente dopo la decapitazione.
   6. Con le forbici chirurgiche, praticare un'incisione nella pelle nella parte superiore del cranio dell'animale, dal caudale al rostrale, e rimuovere il cuoio capelluto dalla testa dell'animale. Quindi, tagliare la piastra interparietale lungo la sutura sagittale con le forbici dell'iride e rimuovere l'osso occipitale. Far scorrere l'osteotomo sotto l'osso parietale e tirarlo delicatamente fuori fino a quando il cervello è esposto.
   7. Dopo aver esposto il cervello, capovolgere la testa, abbassare delicatamente il cervello per visualizzare il nervo trigemino su ciascun lato, quindi tagliare il nervo trigemino usando le forbici curve Castroviejo. Dopo aver visualizzato l'ipotalamo, identificare il nervo ottico e tagliarlo delicatamente.
      NOTA: Fare attenzione quando si taglia il nervo ottico, poiché tirandolo si strappa l'area ipotalamica adiacente contenente il nucleo AVPV / PeN.
   8. Tagliare la porzione più anteriore del lobo frontale e rimuovere completamente il cervello. Immergere immediatamente il cervello nella soluzione di affettatura fino ad acquisire le fette.
2. Affettare campioni di cervello
   1. Posizionare il cervello su carta da filtro (supportata su una capsula di Petri) per asciugare la soluzione in eccesso. Quindi, con una lama di rasoio tagliente, eseguire un taglio coronale separando il tronco cerebrale con il cervelletto dal resto del tessuto.
   2. Quindi, incollare la porzione caudale del cervello alla base del vibratomo e riempire la camera del dispositivo di affettatura con la soluzione di affettatura / aCSF raffreddata a 0-2 °C. Durante la procedura, imballare ghiaccio secco intorno alla camera di vibratomo per mantenere fredda la soluzione affettante.
   3. Inserire la lametta nel vibratomo e impostare i parametri di taglio appropriati del dispositivo: velocità = 3, frequenza = 9 e avanzamento = 250 μm. Utilizzare una pipetta di trasferimento acrilico (pipetta di vetro Pasteur rovesciata attaccata a una tettarella di silicone) per trasferire le fette nella camera di recupero (descritta al punto 2.1.3) durante la procedura di affettatura del tessuto. Attendere 60 minuti per il recupero dei tessuti dopo l'acquisizione della fetta.

3. Sigillatura delle celle per la registrazione

1. Assicurarsi che tutte le apparecchiature (microscopio, amplificatore, digitalizzatore, micromanipolatore e altri) siano accese prima di iniziare la registrazione.
2. Riempire la camera di registrazione, da un marchio commerciale (Table of Materials), attaccata al microscopio con la soluzione aCSF per le registrazioni. Utilizzare una pompa di perfusione per perfondere costantemente l'aCSF ad una velocità di 2 ml / min.
3. Trasferire una fetta di cervello di interesse (una alla volta) nella camera di registrazione. Utilizzare una pipetta di trasferimento acrilico (pipetta di vetro Pasteur invertita attaccata a una tettarella di silicone) per trasferire le fette ipotalamiche nella camera. Utilizzate un ancoraggio di fetta (Table of Materials) per tenere la fetta in modo che non si muova durante la perfusione di aCSF.
4. Posizionare una fetta al centro della camera di registrazione collegata al microscopio. La posizione della fetta è fondamentale per consentire una buona visione della regione desiderata al microscopio e per una perfetta portata della micropipetta di registrazione.
5. Utilizzare la lente a bassa potenza di un microscopio ad immersione (10x o 20x) per aiutare a posizionare la fetta e localizzare la regione di interesse.
6. Dopo aver individuato la regione di interesse, passare la lente dell'obiettivo alla lente ad alta potenza (63x) e concentrarsi sul livello del tessuto, osservando la proteina fluorescente endogena e le forme delle cellule nella regione target per localizzare le cellule kisspeptin sulla superficie della fetta cerebrale²⁰.
7. Quando viene individuata una possibile cella di destinazione, contrassegnarla sullo schermo del computer con il cursore del mouse o disegnando un formato, come un quadrato, sull'area di interesse. Il segno dello schermo del computer aiuta a guidare la posizione della micropipetta di registrazione verso la cella.
8. Dopo aver determinato la posizione esatta della cella target, sollevare l'obiettivo e introdurre la micropipetta di registrazione riempita con la soluzione interna. Quando si posiziona la micropipetta nel supporto dell'elettrodo, assicurarsi che la soluzione interna sia a contatto con l'elettrodo d'argento.
   NOTA: Per la preparazione, il posizionamento e il posizionamento delle micropipette sul supporto dell'elettrodo, fare riferimento al^{punto 33}.
9. Applicare una pressione positiva prima di immergere la micropipetta nella soluzione aCSF, per evitare che i detriti entrino nella micropipetta, utilizzando una siringa riempita d'aria da 1-3 ml collegata al supporto della micropipetta attraverso un tubo di polietilene (≈130 cm più lungo); applicare quasi 100-200 μL di aria.
10. Utilizzando il micromanipolatore, guidare la micropipetta sotto il centro dell'obiettivo. Spostare i pulsanti sul micromanipolatore per guidare la micropipetta sull'asse X-Y-Z verso la cella di interesse.
11. Regolare la messa a fuoco per vedere la punta della micropipetta e avvicinare la messa a fuoco, ma non troppo, alla fetta. Ridurre la velocità del micromanipolatore e abbassare lentamente la micropipetta sul piano di messa a fuoco. Assicurarsi che la punta della micropipetta non penetri bruscamente nella fetta, ma piuttosto scenda lentamente fino a toccare la superficie della cellula/regione target.
12. Applicare una leggera pressione positiva (≈100 μL) con la siringa riempita d'aria da 1-3 mL attaccata al supporto della micropipetta per rimuovere eventuali detriti dal percorso di avvicinamento.
13. Concentrarsi sulla cellula bersaglio e spostare lentamente il micromanipolatore sull'asse X-Y-Z per avvicinare la micropipetta alla cellula bersaglio. Quando si tocca la micropipetta alla cella, si osserva una fossetta causata dalla pressione applicata attraverso la punta della micropipetta (Figura 2C).
14. Dopo aver formato la fossetta, a causa della vicinanza della micropipetta alla cellula, applicare una debole, breve aspirazione per bocca (1-2 s) attraverso il tubo collegato al supporto della micropipetta per generare la tenuta tra la micropipetta alla cellula (sigillo gigaohm o gigaseal >1 GΩ; Figura 2D). Per formare il sigillo, utilizzare la modalità tension-clamp sul software. Per i dettagli sulla formazione delle guarnizioni, fare riferimento al^{punto 33}.
15. Se la tenuta rimane stabile (la guarnizione gigaohm deve essere meccanicamente stabile e senza interferenze di rumore, determinate dall'osservazione per circa 1 minuto), impostare la tensione di mantenimento al potenziale di riposo fisiologico più vicino della cella di interesse. Per i neuroni ipotalamici kisspeptina, si raccomanda -50 mV.
16. Applicare una breve aspirazione per bocca (pressione negativa) con la micropipetta sigillata alla cellula per rompere la membrana plasmatica (Figura 2E). Un'adeguata configurazione dell'intera cellula si ottiene quando l'aspirazione viene eseguita con forza sufficiente in modo che la membrana rotta non ostruisca la micropipetta e non attragga una porzione considerevole della membrana o addirittura della cellula.
17. Controllare il manuale delle impostazioni di sistema utilizzato. Utilizzare il software (vedere Tabella dei materiali) per controllare e calcolare digitalmente la resistenza in serie (SR) e la capacità dell'intera cella (wcc).
18. In modalità tension-clamp , dopo aver rotto la membrana della cella, abilitare l'opzione dell'intera cella e fare clic sul comando Auto che fa riferimento all'intera scheda cella. L'SR e il wcc della cella verranno calcolati automaticamente e visualizzati istantaneamente dal software. Questi parametri possono anche essere verificati eseguendo il test della membrana con l'amplificatore menzionato nella Tabella dei Materiali³³.
19. Assicurati di controllare i parametri di vitalità cellulare. Per i neuroni kisspeptina, controllare che le misurazioni elettrofisiologiche siano: SR < 25 mΩ, resistenza di ingresso > 0,3 GΩ e mantenimento del valore assoluto < 30 pA (osservazioni personali e riferimento²¹). Il valore medio del wcc dei neuroni AVPV/PeN kisspeptin o ARH^kisspeptin è ≈ 10-12 pF nei topi gonadi-intatti²⁰.
20. Monitorare l'SR e la capacità stazionaria della cella durante gli esperimenti. Assicurarsi che l'SR non cambi più del 20% durante una registrazione e che la capacità della membrana sia stabile.
21. Controllare le impostazioni del software. Creare protocolli specifici per le registrazioni in base al tipo di esperimento. Per registrare il potenziale di membrana in modalità corrente-morsetto, con apparecchiature menzionate nella Tabella dei materiali, filtrare passa-basso i segnali elettrofisiologici a 2-4 kHz e analizzare i risultati offline in un software (vedere la Tabella dei materiali per informazioni sul software).
22. Una volta ottenuta correttamente la configurazione dell'intera cella, misurare le correnti sinaptiche in modalità tension-clamp (Figura 2G). Registrare le variazioni del potenziale di membrana a riposo (RMP) e le variazioni RMP indotte nella modalità di morsetto di corrente (Figura 2H). Cambiamenti nella RMP, come la depolarizzazione della membrana cellulare, possono essere indotti somministrando un farmaco/neurotrasmettitore noto al bagno (descritto nella fase 3.2), come illustrato nella Figura 1.
    NOTA: In modalità corrente-morsetto, è possibile iniettare corrente positiva o negativa per mantenere la tensione della membrana alla tensione desiderata. Per i neuroni kisspeptina, di solito impostiamo l'iniezione di corrente zero (I = 0) per registrare la variazione spontanea del potenziale di membrana.

Risultati

Per studiare i possibili effetti dell'ormone della crescita umano ricombinante (hGH) sull'attività dei neuroni ipotalamici kisspeptina, abbiamo eseguito registrazioni patch-clamp di intere cellule in fette di cervello e valutato se questo ormone provoca cambiamenti acuti nell'attività dei neuroni AVPV / PeN^kisspeptin e ARH^kisspeptin. In questo studio sono stati utilizzati topi adulti Kiss1-Cre/GFP femmina (stadio di diestro) e topi maschi³⁶. Per gli esperimenti sono stati ...

Discussione

Lo sviluppo della tecnica patch-clamp a cellule intere ha avuto un impatto significativo sulla comunità scientifica, essendo considerato di fondamentale importanza per lo sviluppo della ricerca scientifica e consentendo diverse scoperte. Il suo impatto sulla scienza è stato sufficiente per culminare nel premio Nobel per la medicina nel 1991, poiché questa scoperta ha aperto la porta a una migliore comprensione di come funzionano i canali ionici in condizioni fisiologiche e patologiche, nonché all'identificazione

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP	Sigma Aldrich/various	A9187
CaCl2	Sigma Aldrich/various	C7902
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich/various	G7021
EGTA	Sigma Aldrich/various	O3777
HEPES	Sigma Aldrich/various	H3375
KCL	Sigma Aldrich/various	P5405
K-gluconate	Sigma Aldrich/various	G4500
KOH	Sigma Aldrich/various	P5958
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M9272
MgSO4	Sigma Aldrich/various	230391
NaCl	Sigma Aldrich/various	S5886
NaH2PO4	Sigma Aldrich/various	S5011
NaHCO3	Sigma Aldrich/various	S5761
nitric acid	Sigma Aldrich/various	225711	CAUTION
Sucrose	Sigma Aldrich/various	S1888
Equipments
Air table	TMC	63-534
Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Computer	various	-
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM	Molecular Devices	DD1440
Digital peristaltic pump	Ismatec	ISM833C
Faraday cage	TMC	81-333-03
Imaging Camera	Leica	DFC 365 FX
Micromanipulator	Sutter Instruments	Roe-200
Micropipette Puller	Narishige	PC-10
Microscope	Leica	DM6000 FS
Osteotome	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	128
Recovery chamber	Warner Instruments/Harvard apparatus	-	can be made in-house
Recording chamber	Warner Instruments	640277
Spatula	Fisher Scientific /various	FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome	Leica	VT1000 S
Water Bath	Fisher Scientific /various	Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software	Molecular Devices	-	Commander Software
LAS X wide field system	Leica	-	Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B	Molecular Devices	MULTICLAMP 700B	Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS	Molecular Devices	Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm	Warner Instruments	64-1309
Curved hemostatic forcep	various	-
cyanoacrylate glue	LOCTITE/various	-
Decapitation scissors	various	-
Filter paper	various	-
Glass capillaries (micropipette)	World Precision Instruments, Inc	TW150F-4
Iris scissors	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	65-66
Pasteur glass pipette	Sigma Aldrich/various	CLS7095B9-1000EA
Petri dish	various	-
Polyethylene tubing	Warner Instruments	64-0756
Razor blade for brain dissection	TED PELLA	TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome	TED PELLA	TEDP-121-9
Scissors	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	71-72, 48,49;
silicone teat	various	-
Slice Anchor	Warner Instruments	64-0246
Syringe filters	Merck Millipore Ltda	SLGVR13SL	Millex-GV 0.22 μm
Tweezers	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	131, 1518