Tüm hücre yama-kelepçe kayıtları için bir hedef olarak hipotalamik kisspeptin nöronları

Özet

Burada, gonadotropin salgılayan hormon (GnRH) hücrelerinin birincil modülatörü olan kisspeptin nöronlarını içeren beyin dilimleri üzerinde tüm hücre yama kelepçesini gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Kisspeptin nöron aktivitesi hakkında bilgi ekleyerek, bu elektrofizyolojik araç son 20 yılda nöroendokrinoloji alanındaki önemli gelişmelerin temelini oluşturmuştur.

Özet

Kisspeptinler, hipotalamik-hipofiz-gonadal (HPG) ekseninin olgunlaşması ve doğurganlık için gereklidir. Anteroventral periventriküler çekirdekte ve rostral periventriküler çekirdekte bulunan hipotalamik kisspeptin nöronlarının yanı sıra hipotalamusun kavisli çekirdeği, diğer hücrelerin yanı sıra gonadotrofin salgılayan hormon (GnRH) nöronlarına yansır. Önceki çalışmalar, kisspeptin sinyallemesinin Kiss1 reseptörü (Kiss1r) aracılığıyla gerçekleştiğini ve sonuçta heyecan verici GnRH nöron aktivitesini ortaya çıkardığını göstermiştir. İnsanlarda ve deneysel hayvan modellerinde, kisspeptinler GnRH sekresyonunu ve sonuç olarak luteinize edici hormon (LH) ve folikül uyarıcı hormon (FSH) salınımını indüklemek için yeterlidir. Kisspeptinler üreme fonksiyonlarında önemli bir rol oynadığından, araştırmacılar hipotalamik kisspeptin nöronlarının içsel aktivitesinin üreme ile ilgili eylemlere nasıl katkıda bulunduğunu değerlendirmek ve bu özellikleri değiştirebilen birincil nörotransmiterleri / nöromodülatörleri tanımlamak için çalışıyorlar. Tüm hücre yama-kelepçe tekniği, kemirgen hücrelerinde kisspeptin nöron aktivitesini araştırmak için değerli bir araç haline gelmiştir. Bu deneysel teknik, araştırmacıların spontan uyarıcı ve inhibitör iyonik akımları, dinlenme zarı potansiyelini, aksiyon potansiyeli ateşlemesini ve hücre zarlarının diğer elektrofizyolojik özelliklerini kaydetmelerini ve ölçmelerini sağlar. Bu çalışmada, hipotalamik kisspeptin nöronlarını tanımlayan elektrofizyolojik ölçümler olarak bilinen tüm hücre yama-kelepçe tekniğinin önemli yönleri ve teknikle ilgili konuların tartışılması gözden geçirilmiştir.

Giriş

Hodgkin ve Huxley, çeşitli bilimsel çalışmalarda tanımlanan bir aksiyon potansiyelinin ilk hücre içi kaydını yaptılar. Bu kayıt, aksonun içine bir mikroelektrodun yerleştirilmesine izin veren büyük bir çapa (~ 500 μm) sahip kalamar aksonu üzerinde gerçekleştirildi. Bu çalışma, bilimsel araştırmalar için büyük olanaklar sağladı ve daha sonra aksiyon potansiyeli üretimi 1,2,3,4,5,6,7,8'in iyonik temelini incelemek için kullanılan voltaj-kelepçe modunun oluşturulmasıyla sonuçlandı. Yıllar geçtikçe, teknik geliştirildi ve bilimsel araştırmalarda yaygın olarak uygulandı ^6,9. 1970'lerin sonlarında Erwin Neher ve Bert Sakmann tarafından başlatılan çalışmalarla gerçekleşen yama-kelepçe tekniğinin icadı, araştırmacıların sadece tek bir elektrot kullanarak hemen hemen her hücre tipinde tek iyon kanallarını ve hücre içi zar potansiyellerini veya akımlarını kaydetmelerine izin verdi 9,10,11,12. Yama-kelepçe kayıtları, kültürlü hücreler veya doku dilimleri gibi çeşitli doku preparatları üzerinde, voltaj-kelepçe modunda (hücre zarını belirli bir voltajda tutarak, örneğin voltaja bağlı akımların ve sinaptik akımların kaydedilmesine izin veren) veya akım-kelepçe modunda (örneğin, iyon akımlarının neden olduğu dinlenme zarı potansiyelindeki değişikliklerin kaydedilmesine izin veren) yapılabilir. aksiyon potansiyelleri ve postsinaptik potansiyel frekans).

Yama-kelepçe tekniğinin kullanılması, birkaç önemli keşfi mümkün kıldı. Gerçekten de, üçüncü ventrikülün (RP3V) rostral periventriküler alanı olarak da bilinen anteroventral periventriküler ve rostral periventriküler çekirdeklerde (AVPV / PeN Kisspeptin) bulunan hipotalamik kisspeptin nöronlarının elektrofizyolojik özellikleri ve hipotalamusun (ARH^kisspeptin) kavisli çekirdeği üzerine seminal ^{bulgular13,14,15} özellikle ilgi çekicidir. 2010 yılında Ducret ve ark., başka bir elektrofizyolojik araç olan gevşek hücreli yama-kelepçe tekniğini kullanarak farelerde AVPV / PeN^Kisspeptinnöronlarının ilk kayıtlarını gerçekleştirdi. Bu çalışmalar, AVPV / PeN^Kisspeptin nöronlarının elektriksel bir tanımını sağladı ve ateşleme modellerinin östrus döngüsüne bağlı olduğunu gösterdi¹⁶. 2011 yılında, Qiu ve ark., ARH^kisspeptin nöronlarının endojen kalp pili akımlarını eksprese ettiğini göstermek için tüm hücre yama-kelepçe tekniğini kullandılar¹⁷. Daha sonra, Gottsch ve ark., kisspeptin nöronlarının spontan aktivite sergilediğini ve hem h-tipi (kalp pili) hem de T-tipi kalsiyum akımlarını eksprese ettiğini gösterdi, bu da ARH^kisspeptin nöronlarının elektrofizyolojik özellikleri diğer merkezi sinir sistemi kalp pili nöronlarıyla paylaştığını düşündürmektedir¹⁸. Ek olarak, ARH kisspeptin nöronlarının cinsel olarak dimorfik ateşleme hızları sergilediği ve AVPV / PeN^Kisspeptin nöronlarının ATP'ye duyarlı potasyum kanallarından (K ATP) etkilenen bimodal dinlenme zarı potansiyeli (_RMP) sergilediği ^{gösterilmiştir19,20}. Ayrıca, gonadal steroidlerin farelerde kisspeptin nöronlarının spontan elektriksel aktivitesini olumlu yönde etkilediği tespit edilmiştir 19,20,21. Kisspeptin nöronlarının elektrofizyolojik özelliklerini inceleyen ilk çalışmalardan 16,17,18,19,20 bahsedilmektedir. O zamandan beri, birçok çalışma, kisspeptin nöronlarının elektriksel aktivitesini modüle etmek için hangi faktörlerin / nöromodülatörlerin yeterli olduğunu göstermek için tüm hücre yama-kelepçe tekniğini kullanmıştır (Şekil 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,^31,32.

Bu tekniğin, burada ele alınmayan diğer hücre tiplerinin yanı sıra, üreme için gerekli olan nöronların incelenmesi için önemi göz önüne alındığında, bu makalede, çözeltilerin hazırlanması, beynin diseksiyonu ve dilimlenmesi ve kayıtlar için hücre zarının mühürlenmesi gibi tüm hücre yama-kelepçe tekniğinin geliştirilmesi için temel adımlar açıklanmaktadır. Ayrıca, teknikle ilgili avantajları, teknik sınırlamaları ve optimum deneysel performans için kontrol edilmesi gereken önemli değişkenler gibi ilgili konular tartışılmaktadır.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Hayvanlar Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Brezilya Hayvan Deneyleri Koleji tarafından kabul edilen etik kurallara göre gerçekleştirildi.

1. Çözümlerin hazırlanması

1. İç çözümün hazırlanması
   NOT: Dahili çözelti yama kelepçeli mikropipeti doldurur ve hücrenin iç kısmına temas eder ( Şekil 2'deki bir örneğe bakın). Dahili çözümler, ölçülecek faaliyet türüne bağlı olarak değişebilir³³.
   1. Deneysel amacını ve uygun kayıt türünü göz önünde bulundurarak dahili çözümü seçin. Akım kelepçesi modunda membran potansiyelini kaydetmek için, 120 mM K-glukonat, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl₂, 3 mM KOH, 10 mM KCl ve 4 mM (Mg)-ATP'den oluşan dahili çözeltiyi kullanın. Tüm tuzları Tablo 1'de verildiği gibi istenen son hacme göre tartın.
   2. Çözeltinin nihai hacminin% 90'ına ulaşmak için yeterli miktarda deiyonize su kullanın. Bu hacim, pH ve ozmolariteyi ayarlamak için yeterli alan sağlayacaktır.
   3. Tüm malzemeleri iyice ekleyip karıştırdıktan sonra, bir pH metre kullanarak pH'ı 5 M KOH ile 7.2-7.3'e ayarlayın. 275-280 mOsm civarında olması gereken ozmolariteyi kontrol etmek için bir ozmometre kullanın (gerekirse sadece aşağı doğru ayarlayın).
   4. Dahili çözeltiyi önceden hazırlayın ve 8 ° C'de saklayın. ATP'yi deneme gününe ekleyin. ATP içeren dahili çözeltiyi -20 ° C'de (1 mL aliquots) 3-4 ay boyunca saklayın.
2. Dilimleme çözeltisinin hazırlanması
   1. 238 mM sakaroz, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 1.0 mM NaH 2 PO₄, 10 mM glikoz, 1.0 mM CaCl 2 ve 5.0 mM MgCl₂ içeren dilimleme çözeltisi hazırlayın. Tüm tuzları Tablo 2'de gösterildiği gibi istenen son hacme göre tartın. Hazırlanacak bu çözeltinin tam hacmi, kesme odasının boyutuna bağlı olacaktır.
   2. Tüm tuzları deiyonize suda karıştırırken, sürekli olarak karbogen ile doyurun (% 95 O2 ve% 5_CO2). Dilimleme çözeltisine karbojen sağlamak için polietilen boruyu (1,57 mm dış çap [OD] x 1,14 mm iç çap [ID]) bir karbogen silindirine takın. Tüpün açık ucunu dilimleme çözeltisini içeren kabın içinde tutun.
   3. Tüm malzemeleri iyice karıştırdıktan sonra, bir pH metre kullanarak pH'ı% 10 nitrik asit ile 7.3'e ayarlayın. 290-295 mOsm olması gereken ozmolariteyi kontrol etmek için bir ozmometre kullanın (gerekirse yalnızca aşağı doğru ayarlayın). Daha sonra, çözeltiyi 0-2 ° C'ye soğutun.
3. Kayıtlar için aCSF çözümü hazırlama
   1. 124 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO₄, 5 mM glikoz ve 2,5 mM CaCl₂ içerenkayıtlar için yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) çözeltisi hazırlayın. Tüm tuzları Tablo 3'te verilen istenen son hacme göre tartın.
   2. Tüm tuzları deiyonize suda karıştırırken, adım 1.2.2'de açıklandığı gibi sürekli olarak karbogen (% 95_O2 ve% 5 CO₂) ile doyurun.
   3. Tüm bileşenleri ekleyip karıştırdıktan sonra, bir pH metre kullanarak pH'ı 7.3'e (% 10 nitrik asit kullanılabilir) ayarlayın. 290-300 mOsm olması gereken ozmolariteyi kontrol etmek için bir ozmometre kullanın. Daha sonra, aCSF'yi bir beher içine dökün ve 30 ° C'de bir su banyosunda tutun.

2. Beyin diseksiyonu ve dilimleme

NOT: Farklı beyin yapıları farklı düzlemlerde (koronal, sagital veya yatay dilimler) kesmeyi gerektirebileceğinden, dilimleri elde etmek için kesin yaklaşım ilgilenilen beyin bölgesine bağlıdır. Tipik olarak, AVPV / PeN ve ARH'deki Kiss1 eksprese eden hücreleri incelemek için (burada AVPV / PeN Kisspeptin nöronları ve ARH^kisspeptin nöronları olarak adlandırılır; Şekil 2A,B), koronal beyin dilimleri (200-300 μm) genellikle 17,19,20,21,34 yapılır. AVPV / PeN Kisspeptin nöronları bregmadan yaklaşık 0.5 ila -0.22 mm uzaklıkta bulunurken, ARH^kisspeptin nöronları -1.22 ila -2.70 mm'dir. Çekirdeklerin konumu, stereotaksik fare beyni atlası³⁵ veya Allen Fare Beyni Referans Atlası (http://mouse.brain-map.org/) kullanılarak belirlenebilir. Bu çalışmada yetişkin Kiss1-Cre/GFP dişi (diestrus-evre) ve erkek fareler³⁶ kullanılmıştır.

1. Beyin çıkarılması
   1. Diseksiyon bölgesini ve beyni çıkarmak için gereken araçları hazırlayın: kafa kesme makası, iris makası, Castroviejo kavisli makas, osteotom, cımbız, spatula, filtre kağıdı, Petri kabı, tıraş bıçağı ve siyanoakrilat yapıştırıcı.
   2. Dilimleri yapmadan önce, sonraki tüm prosedürlerin hızlı bir şekilde yapılması gerektiğinden, diseksiyonun yapılacağı tezgahı hazırlayın. Vibratom gibi bir dilimleme cihazına erişebildiğinizden emin olun.
   3. Dokuyu dilimlemeden önce beyin dilimlerini korumak için bir kayıt odası hazırlayın. Ticari bir markadan (Malzeme Tablosu) 24 mm x 15 mm x 2 mm (U x G x Y) banyo boyutlarında bir kayıt odası edinin veya şirket içinde bir tane yapın.
      NOT: Şirket içi bir geri kazanım odası aşağıdaki gibi imal edilebilir: 24 delikli bir plakayı dokuz kuyu mevcut olacak şekilde kesin. Dokuz kuyucuğun tabanına naylon bir elek yapıştırın. Kuyu plakasının geri kalanıyla, naylonun alt kısmı serbest kalacak şekilde bir taban yapın. Bu uyarlanmış taban, aCSF içeren 500 mL'lik bir beherin içine yerleştirilebilir (Ek Şekil 1).
   4. Her şeyi hazırladıktan sonra,% 4 -% 5 izofluran kullanarak hayvanı inhale anestezi ile uyuşturun. Anestezi, etik kurul tarafından onaylanmış bir protokole uygun olmalıdır. Hayvan hareketsiz kaldıktan kısa bir süre sonra, hayvanın derinlemesine uyuşturulmasını sağlamak için kuyruk ve pençe çimdik testleri yapın.
   5. Hücre canlılığını arttırmak için kalp hala aktifken farelerin kafasını hızla kesin. Beyni dekapitasyondan sonra hızlı bir şekilde toplayın.
   6. Cerrahi makasla hayvanın kafatasının tepesindeki deride, kaudalden rostral'e kadar bir kesi yapın ve kafa derisini hayvanın kafasından çıkarın. Daha sonra, interparietal plakayı iris makası ile sagital sütür boyunca kesin ve oksipital kemiği çıkarın. Osteotomu parietal kemiğin altına kaydırın ve beyin açığa çıkana kadar yavaşça dışarı çekin.
   7. Beyni açığa çıkardıktan sonra, başını baş aşağı çevirin, her iki taraftaki trigeminal siniri görselleştirmek için beyni yavaşça indirin, ardından Castroviejo kavisli makas kullanarak trigeminal siniri kesin. Hipotalamusu görselleştirdikten sonra, optik siniri tanımlayın ve yavaşça kesin.
      NOT: Optik siniri keserken dikkatli olun, çünkü onu çekmek AVPV / PeN çekirdeğini içeren bitişik hipotalamik alanı yırtacaktır.
   8. Frontal lobun en ön kısmını kesin ve beyni tamamen çıkarın. Dilimleri elde edene kadar beyni hemen dilimleme çözeltisine daldırın.
2. Beyin örneklerinin dilimlenmesi
   1. Fazla çözeltiyi kurutmak için beyni filtre kağıdına (Petri kabında desteklenen) yerleştirin. Daha sonra, keskin bir kesme tıraş bıçağı ile, beyin sapını beyincik ile dokunun geri kalanından ayıran bir koronal kesim gerçekleştirin.
   2. Daha sonra, beynin kaudal kısmını vibratomun tabanına yapıştırın ve dilimleme cihazının odasını 0-2 ° C'ye soğutulmuş dilimleme / aCSF çözeltisi ile doldurun. İşlem sırasında, dilimleme çözeltisini soğuk tutmak için vibratom odasının etrafına kuru buz paketleyin.
   3. Tıraş bıçağını vibratoma yerleştirin ve cihazın uygun kesme parametrelerini ayarlayın: hız = 3, frekans = 9 ve besleme = 250 μm. Doku dilimleme prosedürü sırasında dilimleri geri kazanım odasına (adım 2.1.3'te açıklanmıştır) aktarmak için bir akrilik transfer pipeti (silikon meme ucuna tutturulmuş ters Pasteur cam pipet) kullanın. Dilim alımından sonra doku iyileşmesi için 60 dakika bekleyin.

3. Kayıt için hücre sızdırmazlığı

1. Kayda başlamadan önce tüm ekipman parçalarının (mikroskop, amplifikatör, sayısallaştırıcı, mikromanipülatör ve diğerleri) açık olduğundan emin olun.
2. Mikroskopa bağlı ticari bir markadan (Malzeme Tablosu) kayıt odasını, kayıtlar için aCSF çözümü ile doldurun. aCSF'yi sürekli olarak 2 mL/dak hızında perfüze etmek için bir perfüzyon pompası kullanın.
3. İlgilendiğiniz bir beyin dilimini (birer birer birer) kayıt odasına aktarın. Hipotalamik dilimleri odaya aktarmak için bir akrilik transfer pipeti (silikon meme ucuna tutturulmuş ters Pasteur cam pipet) kullanın. Dilimi aCSF perfüzyonu sırasında hareket etmeyecek şekilde tutmak için bir dilim ankrajı (Malzeme Tablosu) kullanın.
4. Mikroskopa bağlı kayıt odasının ortasına bir dilim yerleştirin. Dilim konumu, mikroskop altında istenen bölgenin iyi bir şekilde görülebilmesi ve kayıt mikropipetine mükemmel bir şekilde ulaşılabilmesi için kritik öneme sahiptir.
5. Dilimi konumlandırmaya ve ilgi alanını bulmaya yardımcı olmak için daldırma mikroskobunun düşük güçlü objektif lensini (10x veya 20x) kullanın.
6. İlgilenilen bölgeyi bulduktan sonra, objektif lensi yüksek güçlü lense (63x) geçirin ve doku seviyesine odaklanın, endojen floresan proteinini ve hedef bölgedeki hücrelerin şekillerini gözlemleyerek kisspeptin hücrelerini beyin dilimi^20'nin yüzeyinde konumlandırın.
7. Olası bir hedef hücre bulunduğunda, bilgisayar ekranında fare imleciyle veya ilgi alanının üzerine kare gibi bir biçim çizerek işaretleyin. Bilgisayar ekran işareti, kayıt mikropipetinin konumunu hücreye yönlendirmeye yardımcı olur.
8. Hedef hücrenin tam yerini belirledikten sonra, hedefi kaldırın ve dahili çözelti ile doldurulmuş kayıt mikropipetini tanıtın. Mikropipeti elektrot tutucuya yerleştirirken, dahili çözeltinin gümüş elektrot ile temas halinde olduğundan emin olun.
   NOT: Mikropipet hazırlama, elektrot tutucu üzerine yerleştirme ve konumlandırma için lütfen^33'e bakın.
9. Mikropipet tutucusuna bir polietilen boru (≈130 cm daha uzun) ile bağlanan 1-3 mL hava dolu bir şırınga kullanarak, döküntülerin mikropipete girmesini önlemek için mikropipeti aCSF çözeltisine batırmadan önce pozitif basınç uygulayın; yaklaşık 100-200 μL hava uygulayın.
10. Mikromanipülatörü kullanarak, mikropipeti hedefin merkezinin altına yönlendirin. X-Y-Z eksenindeki mikropipeti ilgilenilen hücreye doğru yönlendirmek için mikromanipülatör üzerindeki düğmeleri hareket ettirin.
11. Mikropipetin ucunu görmek için odağı ayarlayın ve odağı dilime yaklaştırın, ancak çok yakın değil. Mikromanipülatörün hızını azaltın ve mikropipeti yavaşça odak düzlemine indirin. Mikropipet ucunun dilime aniden nüfuz etmediğinden, hücrenin/hedef bölgenin yüzeyine dokunana kadar yavaşça alçaldığından emin olun.
12. Yaklaşma yolundaki kalıntıları temizlemek için mikropipet tutucuya bağlı 1-3 mL hava dolu şırınga ile hafif pozitif basınç (≈100 μL) uygulayın.
13. Hedef hücreye odaklanın ve mikropipeti hedef hücreye yaklaştırmak için mikromanipülatörü X-Y-Z ekseninde yavaşça hareket ettirin. Mikropipet hücreye dokunulduğunda, mikropipet ucundan uygulanan basıncın neden olduğu bir çukur gözlenecektir (Şekil 2C).
14. Çukuru oluşturduktan sonra, mikropipetin hücreye yakınlığı nedeniyle, mikropipet ile hücre arasındaki sızdırmazlığı oluşturmak için mikropipet tutucuya bağlı tüpten ağızdan (1-2 s) zayıf, kısa süreli emme uygulayın (gigaohm conta veya gigaseal >1 GΩ; Şekil 2D). Contayı oluşturmak için, yazılım üzerindeki voltaj kelepçesi modunu kullanın. Mühür oluşumu detayları için lütfen^33'e bakınız.
15. Conta sabit kalırsa (gigaohm conta mekanik olarak kararlı olmalı ve yaklaşık 1 dakika boyunca gözlemle belirlenen gürültü paraziti olmamalıdır), tutma voltajını ilgili hücrenin en yakın fizyolojik dinlenme potansiyeline ayarlayın. Kisspeptin hipotalamik nöronlar için -50 mV önerilir.
16. Plazma zarını kırmak için hücreye kapatılmış mikropipet ile ağızdan kısa süreli emme (negatif basınç) uygulayın (Şekil 2E). Emiş yeterli kuvvetle gerçekleştirildiğinde, yırtılmış membranın mikropipeti tıkamaması ve membranın büyük bir bölümünü veya hatta hücreyi çekmemesi için yeterli tam hücre konfigürasyonu elde edilir.
17. Kullanılan sistem ayarları kılavuzunu kontrol edin. Seri direncini (SR) ve tüm hücre kapasitansını (wcc) dijital olarak kontrol etmek ve hesaplamak için yazılımı kullanın (bkz.
18. Voltaj kelepçesi modunda, hücre zarını kırdıktan sonra, tüm hücre seçeneğini etkinleştirin ve tüm hücre sekmesine atıfta bulunan Otomatik komutuna tıklayın. Hücrenin SR ve wcc'si otomatik olarak hesaplanacak ve yazılım tarafından anında görüntülenecektir. Bu parametreler, Malzeme Tablosu^33'te belirtilen yükselteç ile membran testi yapılarak da kontrol edilebilir.
19. Hücre canlılığı parametrelerini kontrol ettiğinizden emin olun. Kisspeptin nöronları için, elektrofizyolojik ölçümlerin şunlar olduğunu kontrol edin: SR < 25 mΩ, giriş direnci 0.3 GΩ > ve mevcut mutlak değeri 30 pA< tutmak (kişisel gözlemler ve referans²¹). AVPV / PeN Kisspeptin veya ARH^kisspeptin nöronlarının wcc'sinin ortalama değeri, gonad bozulmamış farelerde ≈ 10-12 pF'dir²⁰.
20. Deneyler sırasında SR ve hücre kararlı durum kapasitansını izleyin. Kayıt sırasında SR'nin %20'den fazla değişmediğinden ve membran kapasitansının sabit olduğundan emin olun.
21. Yazılım ayarlarını kontrol edin. Deneme türüne göre kayıtlar için özel protokoller oluşturun. Akım kelepçesi modunda membran potansiyelini kaydetmek için, Malzeme Tablosunda belirtilen ekipmanla, alçak geçirgen elektrofizyolojik sinyalleri 2-4 kHz'de filtreler ve sonuçları bir yazılımda çevrimdışı olarak analiz eder (yazılım bilgileri için Malzeme Tablosuna bakın).
22. Tüm hücre konfigürasyonu düzgün bir şekilde sağlandıktan sonra, voltaj-kelepçe modunda sinaptik akımları ölçün (Şekil 2G). Dinlenme membranı potansiyelindeki (RMP) değişiklikleri ve akım kelepçesi modunda indüklenen RMP varyasyonlarını kaydedin (Şekil 2H). Hücre zarının depolarizasyonu gibi RMP'deki değişiklikler, Şekil 1'de gösterildiği gibi, banyoya bilinen bir ilaç / nörotransmitter uygulanarak (adım 3.2'de açıklanmıştır) indüklenebilir.
    NOT: Akım-kelepçe modunda, membran voltajını istenen voltajda tutmak için pozitif veya negatif akım enjekte edilebilir. Kisspeptin nöronları için, membran potansiyelinin kendiliğinden varyasyonunu kaydetmek için genellikle sıfır akım enjeksiyonu (I = 0) ayarlarız.

Sonuçlar

İnsan rekombinant büyüme hormonunun (hGH) hipotalamik kisspeptin nöronlarının aktivitesi üzerindeki olası etkilerini incelemek için, beyin dilimlerinde tüm hücre yama-kelepçe kayıtları gerçekleştirdik ve bu hormonun AVPV / PeN Kisspeptin ve ARH^kisspeptin nöronlarının aktivitesinde akut değişikliklere neden olup olmadığını değerlendirdik. Bu çalışmada yetişkin Kiss1-Cre/GFP dişi (diestrus-evre) ve erkek fareler³⁶ kullanılmıştır. Deneyler iç...

Tartışmalar

Tüm hücre yama-kelepçe tekniğinin geliştirilmesi, bilimsel araştırma geliştirmek ve çeşitli keşiflere olanak sağlamak için büyük önem taşıyan bilimsel topluluk üzerinde önemli bir etkiye sahipti. Bilim üzerindeki etkisi, 1991'de Nobel Tıp Ödülü ile sonuçlanmak için yeterliydi, çünkü bu keşif, iyon kanallarının fizyolojik ve patolojik koşullar altında nasıl işlediğinin daha iyi anlaşılmasına ve terapötik ajanlar için potansiyel hedeflerin belirlenmesine kapı açtı 11,39,40,41

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP	Sigma Aldrich/various	A9187
CaCl2	Sigma Aldrich/various	C7902
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich/various	G7021
EGTA	Sigma Aldrich/various	O3777
HEPES	Sigma Aldrich/various	H3375
KCL	Sigma Aldrich/various	P5405
K-gluconate	Sigma Aldrich/various	G4500
KOH	Sigma Aldrich/various	P5958
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M9272
MgSO4	Sigma Aldrich/various	230391
NaCl	Sigma Aldrich/various	S5886
NaH2PO4	Sigma Aldrich/various	S5011
NaHCO3	Sigma Aldrich/various	S5761
nitric acid	Sigma Aldrich/various	225711	CAUTION
Sucrose	Sigma Aldrich/various	S1888
Equipments
Air table	TMC	63-534
Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Computer	various	-
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM	Molecular Devices	DD1440
Digital peristaltic pump	Ismatec	ISM833C
Faraday cage	TMC	81-333-03
Imaging Camera	Leica	DFC 365 FX
Micromanipulator	Sutter Instruments	Roe-200
Micropipette Puller	Narishige	PC-10
Microscope	Leica	DM6000 FS
Osteotome	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	128
Recovery chamber	Warner Instruments/Harvard apparatus	-	can be made in-house
Recording chamber	Warner Instruments	640277
Spatula	Fisher Scientific /various	FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome	Leica	VT1000 S
Water Bath	Fisher Scientific /various	Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software	Molecular Devices	-	Commander Software
LAS X wide field system	Leica	-	Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B	Molecular Devices	MULTICLAMP 700B	Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS	Molecular Devices	Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm	Warner Instruments	64-1309
Curved hemostatic forcep	various	-
cyanoacrylate glue	LOCTITE/various	-
Decapitation scissors	various	-
Filter paper	various	-
Glass capillaries (micropipette)	World Precision Instruments, Inc	TW150F-4
Iris scissors	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	65-66
Pasteur glass pipette	Sigma Aldrich/various	CLS7095B9-1000EA
Petri dish	various	-
Polyethylene tubing	Warner Instruments	64-0756
Razor blade for brain dissection	TED PELLA	TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome	TED PELLA	TEDP-121-9
Scissors	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	71-72, 48,49;
silicone teat	various	-
Slice Anchor	Warner Instruments	64-0246
Syringe filters	Merck Millipore Ltda	SLGVR13SL	Millex-GV 0.22 μm
Tweezers	Bonther equipamentos & Tecnologia/various	131, 1518