JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يعد تركيز الفيروس من عينات المياه البيئية ومياه الصرف الصحي مهمة صعبة ، يتم تنفيذها في المقام الأول لتحديد الفيروسات وقياسها. بينما تم تطوير واختبار العديد من طرق تركيز الفيروس ، فإننا نوضح هنا فعالية الترشيح الفائق وتلبد الحليب منزوع الدسم لفيروسات الحمض النووي الريبي بأنواع مختلفة من العينات.

Abstract

وقد برزت الوبائيات القائمة على المياه ومياه الصرف الصحي كطرق بديلة لرصد مسار الفاشيات في المجتمعات المحلية والتنبؤ به. يعد استرداد الكسور الميكروبية ، بما في ذلك الفيروسات والبكتيريا وحقيقيات النوى الدقيقة من عينات مياه الصرف الصحي والمياه البيئية ، إحدى الخطوات الصعبة في هذه الأساليب. في هذه الدراسة ، ركزنا على كفاءة استرداد طرق الترشيح الفائق المتسلسل وتلبد الحليب منزوع الدسم (SMF) باستخدام الحمض النووي الريبي المدرع كفيروس اختبار ، والذي يستخدم أيضا كعنصر تحكم من قبل بعض الدراسات الأخرى. تم تطبيق الترشيح المسبق باستخدام مرشحات قرصية غشائية 0.45 ميكرومتر و 0.2 ميكرومتر للتخلص من الجسيمات الصلبة قبل الترشيح الفائق لمنع انسداد أجهزة الترشيح الفائق. تم طرد عينات الاختبار ، التي تمت معالجتها بطريقة الترشيح الفائق المتسلسل ، بسرعتين مختلفتين. أدت السرعة المتزايدة إلى انخفاض معدلات الاسترداد والإيجابية للحمض النووي الريبي المدرع. من ناحية أخرى ، أدى SMF إلى معدلات استرداد وإيجابية متسقة نسبيا للحمض النووي الريبي المدرع. أظهرت الاختبارات الإضافية التي أجريت على عينات المياه البيئية فائدة SMF لتركيز الأجزاء الميكروبية الأخرى. قد يكون لتقسيم الفيروسات إلى جزيئات صلبة تأثير على معدلات الاسترداد الإجمالية ، مع الأخذ في الاعتبار خطوة الترشيح المسبق المطبقة قبل الترشيح الفائق لعينات مياه الصرف الصحي. كان أداء SMF مع الترشيح المسبق أفضل عند تطبيقه على عينات المياه البيئية بسبب انخفاض تركيزات المواد الصلبة في العينات وبالتالي انخفاض معدلات التقسيم إلى المواد الصلبة. في الدراسة الحالية ، نشأت فكرة استخدام طريقة الترشيح الفائق المتسلسل من ضرورة تقليل الحجم النهائي للمركزات الفيروسية أثناء جائحة COVID-19 ، عندما كان المعروض من أجهزة الترشيح الفائق شائعة الاستخدام محدودا ، وكانت هناك حاجة لتطوير طرق تركيز فيروسية بديلة.

Introduction

يعد تحديد التركيز الفعال للكائنات الحية الدقيقة في عينات المياه السطحية ومياه الصرف الصحي لتحليل المجتمع الميكروبي ودراسات علم الأوبئة ، إحدى الخطوات المهمة لرصد مسار الفاشيات في المجتمعات 1,2 والتنبؤ بها. كشفت جائحة COVID-19 عن أهمية تحسين طرق التركيز. ظهر COVID-19 في أواخر عام 2019 ، وحتى مارس 2023 ، لا يزال يشكل تهديدا لصحة الإنسان والحياة الاجتماعية والاقتصاد. أصبحت استراتيجيات الترصد والمكافحة الفعالة للتخفيف من آثار تفشي COVID-19 في المجتمعات موضوعا بحثيا مهما ، حيث ظهرت موجات ومتغيرات جديدة من COVID-19 بالإضافة إلى الانتقال السريع للفيروس وانتشاره ، وكذلك الحالات التي لا تظهر عليها أعراض والتي لم يتم الإبلاغ عنها وغير المشخصة3،4،5. كان استخدام علم الأوبئة القائم على مياه الصرف الصحي ل COVID-19 من قبل منظمات المجتمع المدني والوكالات الحكومية والمرافق العامة أو الخاصة مفيدا في توفير المعلومات السريعة المتعلقة بالتفشي والتخفيف من آثار تفشي COVID-196،7،8،9. ومع ذلك ، فإن تركيز SARS-CoV-2 ، وهو فيروس RNA مغلف ، في عينات مياه الصرف الصحي لا يزال يشكل تحديات10. على سبيل المثال ، يتمثل أحد هذه التحديات في تقسيم SARS-CoV-2 في المواد الصلبة لمياه الصرف الصحي ، مما قد يؤثر على الاسترداد عندما يتم التخلص من المواد الصلبة أثناء التركيز11. وإذا كان هذا هو الحال، ينبغي أن يكون تركيز القياس الكمي/التقييم على كل من المراحل الصلبة والمائية لعينات المياه البيئية، بدلا من المرحلة المائية فقط. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل اختيار طريقة التركيز بناء على الاختبارات والتحليلات النهائية. أصبح تركيز جزيئات الفيروس ومسببات الأمراض من العينات البيئية موضوعا بحثيا عاجلا مع التطورات في مجالات التسلسل والميكروبيوم.

تم تطبيق طرق تركيز الفيروسات المختلفة في مجال تركيز الفيروس من عينات المياه البيئية ومياه الصرف الصحي. بعض الطرق الشائعة الاستخدام هي الترشيح ، تلبد الحليب منزوع الدسم (SMF) ، الامتزاز / الشطف ، وترسيب البولي إيثيلين جلايكول12-17. من بينها ، تم اعتبار SMF طريقة رخيصة وفعالة ، وتم اختبارها بنجاح ، وتطبيقها لاستعادة الفيروسات ، بما في ذلك SARS-CoV-2 ، من مياه الصرف الصحي والمياه السطحية12،15،16،18. يعد إجراء SMF نهجا جديدا نسبيا اكتسب اعترافا متزايدا بين العديد من الدراسات البيئية كمنهجية مناسبة لاستعادة مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة في وقت واحد مثل الفيروسات والبكتيريا والأوليات من جميع أنواع عينات المياه ، وهي الحمأة ومياه الصرف الصحي الخام ومياه الصرف الصحي وعينات النفايات السائلة19. عند مقارنتها بالمنهجيات الأخرى المعروفة لاستعادة الفيروسات من العينات البيئية مثل الترشيح الفائق وشطف الجلايسين القلوي ، أو النهج القائم على التجفيد ، أو الطرد المركزي الفائق وشطف الجلايسين القلوي ، تم الإبلاغ عن SMF باعتبارها الطريقة الأكثر فعالية مع ارتفاع معدلات التعافي والكشف الفيروسي18,20. في هذه الدراسة ، استخدمنا الحمض النووي الريبي المدرع كفيروس اختبار لتقييم كفاءة استرداد طرق تركيز الفيروس ، بما في ذلك اختبارات تقييم استرداد SARS-CoV-221,22.

هنا ، اختبرنا عينات مياه الصرف الصحي والمياه البيئية لإثبات فائدة SMF وطريقة الترشيح الفائق المتسلسل لتركيز الكسور الميكروبية لتفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) ، والميتاجينوميات القائمة على التسلسل ، وتسلسل الأمبليكون العميق. SMF هي طريقة أرخص نسبيا ومثالية لحجم أكبر من العينات مقارنة بطرق الترشيح الفائق. نشأت فكرة استخدام طريقة الترشيح الفائق المتسلسل من ضرورة تقليل الحجم النهائي للمركزات الفيروسية أثناء جائحة COVID-19 ، عندما كان المعروض من أجهزة الترشيح الفائق شائعة الاستخدام محدودا ، وكانت هناك حاجة لتطوير طرق تركيز فيروسية بديلة.

Protocol

1. مقارنة الترشيح الفائق التسلسلي وتلبد الحليب منزوع الدسم لتركيز الفيروسات في عينات مياه الصرف الصحي

  1. إعداد العينة
    1. اجمع 2 لتر من عينات مياه الصرف الصحي المركبة (المؤثرة) المتناسبة مع التدفق لمدة 24 ساعة. تم جمع عينات من محطات معالجة مياه الصرف الصحي الرئيسية الثلاث (WWTPs) في وينيبيغ ، كندا ، خلال صيف وخريف عام 2020 (الجدول 1).
    2. نقل العينات إلى المختبر في زجاجات واقية من الضوء في صندوق ثلج ومعالجتها في غضون 24 ساعة. جمع بيانات الخصائص الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية لمياه الصرف الصحي.
  2. فحوصات تركيز الفيروس
    ملاحظة: تم تطبيق طريقة الترشيح الفائق المتسلسل وطريقة التلبد العضوي ، وهي تلبد الحليب منزوع الدسم (SMF) ، لتقييم كفاءة الاسترداد الكلية لكل طريقة باستخدام الحمض النووي الريبي المدرع كفيروس اختبار23. كما استخدم باحثون آخرون الحمض النووي الريبي المدرع كفيروس تحكم لتقييم استعادة طرق التركيز للفيروسات المغلفة ، مثل العائلة. Coronaviridae22,24,25,26.
    1. لإضافة الحمض النووي الريبي المدرع ، اضبط أحجام اختبار مياه الصرف الصحي لطرق الترشيح الفائق و SMF على 140 مل و 500 مل على التوالي. باستخدام الماصة ، قم برفع 5 × 104 نسخ من الحمض النووي الريبي المدرع إلى ست عينات من مياه الصرف الصحي العذبة تم جمعها في تاريخ واحد وست عينات من مياه الصرف الصحي العذبة في تاريخ آخر ، لكل طريقة ترشيح فائق ؛ علاوة على ذلك ، تم تخزين ستة عينات من مياه الصرف الصحي (عند 4 درجات مئوية) في تاريخ ثالث لاحق ومعالجتها بعد أيام من أجل SMF.
      ملاحظة: تألفت كل مجموعة من مجموعات العينات الست التي تم جمعها في تواريخ مختلفة من عينتين من كل من محطات معالجة محطات معالجة المياه الثلاثة. في دراستنا ، تم جمع المجموعة الأولى من عينات مياه الصرف الصحي العذبة في 8 يوليو 2020 ، والثانية في 30 سبتمبر 2020 ، وعينات مياه الصرف الصحي التي سيتم تخزينها ل SMF في 14 أكتوبر 2020.
    2. يقلب لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتلقيح وتجانس الحمض النووي الريبي المدرع في العينات باستخدام محرك مغناطيسي.
    3. قم بإزالة جميع الجسيمات أو الخلايا التي يزيد حجمها عن 0.2 ميكرومتر وقم بإجراء الترشيح الفائق.
      1. قم بتصفية عينات مياه الصرف الصحي المسننة (120 مل من كل عينة مسننة سعة 140 مل) من خلال القماش القطني والربط منخفض البروتين ، 0.45 ميكرومتر و 0.2 ميكرومتر ، مرشحات القرص الغشائي 47 مم ، على التوالي ، لإزالة الجسيمات الكبيرة والرواسب وحقيقيات النوى والبكتيريا27. قم بمعالجة العينات التي تمت تصفيتها باستخدام طرق الترشيح الفائق الموضحة أدناه.
        ملاحظة: تم استخدام عينات مياه الصرف الصحيالتي تم جمعها في 8 يوليو و 30 سبتمبر لطرق الترشيح الفائق مع 3000 ×جم و 7500 × جم على التوالي.
      2. للترشيح الفائق المتسلسل عند 3000 × جم (UF-3k x g) ، ركز ما مجموعه 120 مل من عينة الاختبار التي تم جمعها في التاريخ الأول عند 3000 × جم لمدة 30 دقيقة عن طريق تحميل 60 مل من العينة مرتين إلى حوالي 5 مل باستخدام جهاز طرد مركزي من العلامة التجارية A ، 30 كيلو دالتون. بعد ذلك ، ركز على حجم 5 مل عند 3,000 × جم لمدة 30 دقيقة باستخدام جهاز طرد مركزي من العلامة التجارية B ، 30-kDa ، إلى 500-1,200 μL.
      3. بالنسبة للترشيح الفائق المتسلسل عند 7,500 × جم (UF-7.5k x g) ، قم بتغيير سرعة الطرد المركزي لجهاز الطرد المركزي للعلامة التجارية B من 3,000 × g إلى 7,500 x g للحصول على أحجام نهائية أصغر ، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة ، والحفاظ على سرعة الطرد المركزي لجهاز الطرد المركزي للعلامة التجارية A كما هي.
        ملاحظة: تم إجراء الاختبارات مع العينات التي تم جمعها في 30سبتمبر.
    4. بالنسبة إلى SMF ، قم بتنفيذ الخطوات الموضحة أدناه.
    5. قم برفع عينات مياه الصرف الصحي (500 مل لكل منها) للتركيز مباشرة باستخدام بروتوكول SMF16,18 ، دون الترشيح المسبق باستخدام القماش القطني ومرشحات قرص غشاء الربط منخفض البروتين ، كما هو موضح أدناه.
    6. قم بإذابة 0.5 جم من مسحوق الحليب منزوع الدسم في 50 مل من مياه البحر الاصطناعية للحصول على محلول حليب منزوع الدسم بنسبة 1٪ (وزن / حجم) واضبط درجة حموضة المحلول بعناية على 3.5 باستخدام 1 N HCl.
      ملاحظة: التحمض يجعل الفيروسات تتجمع وتترسب خارج الماء بسبب التغير في نقطة تساوي الكهرباء16 ويحسن قابلية ذوبان مسحوق الحليب28.
    7. أضف 5 مل من محلول الحليب منزوع الدسم إلى 500 مل من عينات مياه الصرف الصحي الخام للحصول على تركيز نهائي من الحليب منزوع الدسم بنسبة 0.01٪ (وزن / حجم).
    8. حرك العينات لمدة 8 ساعات بسرعة متوسطة واترك الكتل المشكلة تستقر لمدة 8 ساعات أخرى في درجة حرارة الغرفة.
    9. قم بإزالة المواد الطافية بعناية باستخدام الماصات المصلية دون إزعاج الكتل المستقرة. نقل حجم نهائي قدره 50 مل يحتوي على الكتل إلى أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 8 درجات مئوية.
    10. تخلص من الكريات بعناية باستخدام ملعقة معقمة, وأعد تعليق الكريات المتبقية في الأنابيب في 250 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم 0.2 M (درجة الحموضة 7.5) بعد إزالة المادة الطافية. انقل الكريات المكشطة والمعاد تعليقها إلى نفس أنابيب الطرد المركزي الصغيرة سعة 1.5 مل.
  3. إجراء استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي من المركزات الفيروسية لعينات مياه الصرف الصحي ومقايسات كفاءة الاسترداد باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي بنسبة 25: 24: 1 من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل و β-ميركابتوإيثانول ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، لتحسين كفاءة الاستخراج. أخيرا ، قم بإزالة الحمض النووي الريبي في 50 ميكرولتر من محلول الشفط.
  4. تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)
    1. قم بقياس الحمض النووي الريبي المدرع باستخدام تخفيفات عشرة أضعاف (7.8 × 104 إلى 7.8 نسخ جينية) من الحمض النووي الاصطناعي أحادي الشريط أو بناء gBlock. انظر الجدول 2 للاطلاع على البادئات ومجموعات المسبار التي تكتشف وتحدد كمية الحمض النووي الريبي المدرع.
    2. صمم مجموعات التمهيدي والمسبار باستخدام أداة تصميم التمهيدي29 واستهدف منطقة 95 نقطة أساس (بناء gBlock) داخل جينوم الحمض النووي الريبي المدرع.
    3. احصل على منحنيات المعايرة لكل تشغيل RT-qPCR. قم بتضمين عناصر تحكم سلبية في كل تشغيل qPCR. قم بتشغيل المعايير والعينات وعناصر التحكم غير القوالب في ثلاث نسخ.
    4. قم بإعداد كل خليط RT-qPCR سعة 10 ميكرولتر بالترتيب التالي: 2.5 ميكرولتر من 4x مزيج رئيسي ، 400 نانومتر لكل برايمر ، مسبار 200 نانومتر ، و 2.5 ميكرولتر من القالب ، بالإضافة إلى ماء مقطر عالي النقاء خال من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي.
    5. قم بإجراء تفاعلات الدورة الحرارية عند 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، تليها 45 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية على نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. إذا كان التصوير المقطعي المحوسب <40 ، فاعتبر عينة الحمض النووي الريبي المدرعة إيجابية.
    6. إجراء اختبارات qPCR و RT-qPCR باستخدام ألبومين مصل الأبقار مع عينات مياه الصرف الصحي الخام لتقييم إمكانية وجود مثبطات أو ملوثات مثل الأحماض الدبالية24. لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية بين العينات مع الإنزيم وبدونه.
  5. احسب التركيزات من المنحنى القياسي. احسب النسبة المئوية لكفاءة الاسترداد بقسمة التركيز المستعاد على التركيز المسننة.
  6. تحويل أرقام نسخ الجينات باستخدام الدالة log10 للتحليل. تشغيل نموذج خطي عام باستخدام أداة التحليل الإحصائي على بيانات qPCR. قم بتطبيق اختبار Tukey للكشف عن الاختلافات بين الطرق والعلاجات. خذ قيمة p 0.05 لتكون الحد الأدنى من مستوى الأهمية للاختبار.

2. ترشيح وتركيز فيروسات الحمض النووي والحمض النووي الريبي لعلم الأوبئة المائي

  1. لجمع المياه السطحية البيئية ، اجمع 10 لتر من عينات المياه السطحية البيئية واستخدم 10 لتر من عينات المياه منزوعة الأيونات للتحكم في الخلفية. قم بتخزين جميع العينات في غرفة 4 درجات مئوية حتى تتم معالجتها في غضون 24 ساعة بعد جمع العينات.
  2. قم بإجراء تركيز الفيروسات من العينات البيئية باستخدام SMF باستخدام الخطوات الموضحة أدناه.
    1. قم بإجراء ترشيح الكبسولة والفراغ باستخدام كبسولات أخذ عينات المياه الجوفية عالية السعة ومرشحات قرص الغشاء بأحجام 0.45 ميكرومتر و 0.2 ميكرومتر و 0.1 ميكرومتر لتقليل الضوضاء أثناء التسلسل الميتاجينومي ، من الكسور الأكبر مثل حقيقيات النوى الدقيقة والبكتيريا إلى الأجزاء الأصغر مثل الفيروسات.
    2. قم بإعداد محلول حليب منزوع الدسم مسبق التلبد بنسبة 1٪ من الوزن بالحجم في 1.32 لتر من مياه البحر الاصطناعية مع 13.2 جم من مسحوق الحليب منزوع الدسم. اضبط الرقم الهيدروجيني لهذا التعليق على 3.5 باستخدام 1 N HCl.
  3. اضبط الرقم الهيدروجيني لعينات المياه السطحية البيئية إلى 3.5 باستخدام 1 N HCl.
  4. انقل 100 مل من محلول الحليب منزوع الدسم المحمض قبل التلبد إلى 10 لتر من عينات المياه البيئية المحمضة (درجة الحموضة 3.5) (تركيز الحليب منزوع الدسم النهائي 0.01٪ [وزن / حجم]).
  5. باستخدام محرك مغناطيسي وقضيب تحريك مغناطيسي ، قم بتحريك العينات لمدة 8 ساعات في درجة حرارة الغرفة واترك الكتل تترسب عن طريق الجاذبية لمدة 8 ساعات إضافية. دون إزعاج الكتل ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام مضخة تفريغ.
  6. قم بقسمة وموازنة الكتل المتبقية وفقا للوزن في أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل وقم بتدويرها عند 8000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  7. تخلص من المادة الطافية وقم بإذابة الحبيبات الناتجة (التي تحتوي نظريا على فيروسات ذات أهمية) في 200 ميكرولتر من 0.2 متر عازلة لفوسفات الصوديوم.
  8. عالج الحبيبات المذابة باستخدام DNase I و RNase A ، باتباع تعليمات الشركة الصانعة ، للتخلص من الحمض النووي الحر والحمض النووي الريبي الموجود الذي قد يترسب بشكل مشترك بسبب المجموعة المستخدمة لاستخراج الحمض النووي. قم بإلغاء تنشيط DNase I و RNase A باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  9. استخرج الأحماض النووية الكلية من الحبيبات الذائبة باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  10. تحديد الكمية الإجمالية للحمض النووي والحمض النووي الريبي المستخرج من عينات النفايات السائلة باستخدام مقياس الفلور. تعتبر العينات ذات التركيزات >1 نانوغرام / ميكرولتر مثالية لتحديد كمية الحمض النووي وتسلسله.
  11. إجراء تحليل qPCR لاستهداف الفيروسات المعوية ذات الأهمية والتسلسل عالي الإنتاجية لتحديد بنية المجتمع الفيروسي.

3. الترسيب المباشر وتركيز الكسور الميكروبية لعلم الأوبئة المائي

  1. اجمع 2 لتر من عينات المياه من المجاري المائية المحمية والمتأثرة. إذا كانت العينة تحتوي على كمية كبيرة من الحطام ، فاستخدم القماش القطني لإزالتها.
    ملاحظة: يوصى بشدة بجمع نسخة بيولوجية مكررة لكل عينة.
  2. قم بإعداد محلول حليب منزوع الدسم بنسبة 1٪ (وزن / حجم) عن طريق إذابة 4.4 جم من مسحوق الحليب منزوع الدسم في 440 مل من مياه البحر الاصطناعية. اضبط الرقم الهيدروجيني لهذا التعليق على 3.5 مع 1 N HCl.
  3. اضبط الرقم الهيدروجيني لعينات المياه العذبة إلى 3.5 باستخدام 1 N HCl.
  4. أضف 20 مل من محلول الحليب منزوع الدسم إلى عينات المياه العذبة 2 لتر المعدلة مسبقا (تركيز الحليب منزوع الدسم النهائي 0.01٪ [وزن / حجم]). حرك العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 ساعات.
  5. اسمح للكتل بالترسبات عن طريق الجاذبية لمدة 8 ساعات أخرى. قم بإزالة المواد الطافية بعناية باستخدام مضخة تمعجية. انقل الكتل المترسبة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بتدويرها بسرعة 8000 × جم لمدة 30 دقيقة.
  6. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات ب 200 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم 0.2 متر. قم بتخزين العينات في -20 درجة مئوية أو تابع تحديد ~ 0.5 جم من الكتل لاستخراج الحمض النووي الميكروبي باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي التي تختارها ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  7. تحديد تركيز الحمض النووي DNA ونقاوته باستخدام مقياس فلوري عالي الحساسية. يجب أن تكون العينات ذات التركيزات > 1 نانوغرام / ميكرولتر مثالية لقياس كمية الحمض النووي وتسلسله.

النتائج

تقييم طرق تركيز الحمض النووي الريبي الفيروسي
كانت جميع العينات الست التي تمت معالجتها باستخدام UF-3k x g إيجابية وأسفرت عن استرداد بنسبة 13.38٪ ± 8.14٪ (الشكل 1). كانت عينة واحدة فقط إيجابية عندما تمت معالجة العينات باستخدام UF-7.5k x g. كانت جميع العينات التي تمت مع...

Discussion

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذه الدراسة في التخلص من الجسيمات الصلبة من خلال تطبيق خطوة الترشيح المسبق مع مرشحات غشائية 0.2 ميكرومتر و 0.45 ميكرومتر. بالنظر إلى تقسيم الفيروسات إلى جزيئات صلبة ، وخاصة الفيروسات المغلفة ، يمكن أن يسبب الترشيح المسبق خسارة كبيرة في الانتعاش الفيروسي

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل المذكور في هذه الورقة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل NSERC Alliance Covid-19 Grant (الجائزة رقم 431401363 ، 2020-2021 ، Drs. Yuan و Uyaguari-Díaz). تود MUD أن تشكر برنامج المنح البحثية الجامعية (الجائزة رقم 325201). يتم دعم كل من JF و JZA من خلال برنامج تدريب الخريجين لتحليلات الأمراض البصرية والآلية (VADA). حصل كل من KY و JF على زمالات من برنامج Mitacs Accelerate. يتم دعم MUD وأعضاء مختبره (KY ، JF ، JZA) من قبل NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) ومنحة تشغيل الباحث الجديد في مانيتوبا (رقم 5385). شكر خاص لمدينة وينيبيغ ، مانيتوبا. تم إجراء هذا البحث في جامعة مانيتوبا. نود أن نعترف بأن حرم جامعة مانيتوبا يقع على الأراضي الأصلية لشعوب Anishinaabeg و Cree و Oji-Cree و Dakota و Dene وعلى موطن أمة Métis.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5Alfa AesarJ62041APFisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filtersVWR66234Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filtersVWR60043Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master MixThermo Fisher Scientific4444432Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing ControlAsuragen49650Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDaPall OD030C65Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDaPallMCP010C46Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml) Nalgene3119-0050PKThermo Fisher Scientific
DNAse IInvitrogen18047019Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2Invitrogen12027Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µmPall12179Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solutionThermo Fisher ScientificAC124210025Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation KitApplied biosystemsA42358Thermo Fisher Scientific
Nuclease free waterPromegaP1197Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pumpMasterflex, Cole-Parmer instrument7553-20Thermo Fisher Scientific
pH meter Denver instrumentRK-59503-25Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1Invitrogen15593031Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe setsIDTIntegrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kitQiagenQiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR SystemThermo Fisher ScientificA34322Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kitInvitrogenQ33231Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFiInvitrogenQ33238Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kitInvitrogenQ32855Thermo Fisher Scientific
RNAse AInvitrogenEN0531Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome KitQiagen26000-50Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powderDifco (BD Life Sciences)DF0032173Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate bufferAlfa AesarAlfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawaterVWR RC8363-1RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlockIDTIntegrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiatedPall4621Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiatedPall4622Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanolGibco21985023Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

References

  1. Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
  2. Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
  3. Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
  4. Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
  5. Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
  6. Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
  7. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  8. Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
  9. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
  10. Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
  11. Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
  12. Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
  13. Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
  14. Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
  15. Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
  16. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  17. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
  18. Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
  20. Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
  21. Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
  22. Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
  23. Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
  24. Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
  25. Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
  26. Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
  27. Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
  28. Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), 3526-3537 (2018).
  29. . Geneious Available from: https://www.geneious.com (2021)
  30. Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
  31. Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
  32. Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
  33. Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved