JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ריכוז הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים הוא משימה מאתגרת, המתבצעת בעיקר לזיהוי וכימות נגיפים. בעוד מספר שיטות ריכוז וירוסים פותחו ונבדקו, אנו מדגימים כאן את היעילות של ultrafiltration ו flocculation חלב דל שומן עבור וירוסים RNA עם סוגי דגימה שונים.

Abstract

אפידמיולוגיה מבוססת מים ושפכים התפתחה כשיטות חלופיות לניטור וחיזוי מהלך ההתפרצויות בקהילות. ההתאוששות של שברים מיקרוביאליים, כולל וירוסים, חיידקים ומיקרו-איקריוטים מדגימות שפכים ומים סביבתיים היא אחד הצעדים המאתגרים בגישות אלה. במחקר זה, התמקדנו ביעילות ההתאוששות של שיטות אולטרה-סינון רציפות ופלוקולציית חלב דל שומן (SMF) באמצעות RNA משוריין כנגיף בדיקה, המשמש גם כבקרה על ידי כמה מחקרים אחרים. סינון מקדים עם מסנני דיסק ממברנות 0.45 מיקרומטר ו- 0.2 מיקרומטר יושמו כדי לחסל חלקיקים מוצקים לפני אולטרה-סינון כדי למנוע סתימה של מכשירי אולטרה-סינון. דגימות הבדיקה, שעובדו בשיטת אולטרה-סינון רציף, צוננו בשתי מהירויות שונות. מהירות מוגברת הביאה לשיעורי התאוששות וחיוביות נמוכים יותר של RNA משוריין. מצד שני, SMF הביא להתאוששות עקבית יחסית ושיעורי חיוביות של RNA משוריין. בדיקות נוספות שנערכו עם דגימות מים סביבתיות הדגימו את התועלת של SMF לריכוז שברים מיקרוביאליים אחרים. חלוקת הנגיפים לחלקיקים מוצקים עשויה להשפיע על שיעורי ההתאוששות הכוללים, בהתחשב בשלב הסינון המוקדם המיושם לפני אולטרה-סינון של דגימות שפכים. SMF עם קדם-סינון הפגין ביצועים טובים יותר כאשר יושם על דגימות מים סביבתיים עקב ריכוזים מוצקים נמוכים יותר בדגימות ולכן שיעורי חלוקה נמוכים יותר למוצקים. במחקר הנוכחי עלה הרעיון להשתמש בשיטת אולטרה-סינון רציפה מתוך הצורך להקטין את הנפח הסופי של תרכיזי הנגיפים בתקופת הקורונה, כאשר אספקת מכשירי האולטרה-סינון הנפוצים הייתה מוגבלת, והיה צורך בפיתוח שיטות חלופיות לריכוז הנגיף.

Introduction

קביעת הריכוז האפקטיבי של מיקרואורגניזמים בדגימות פני השטח והשפכים לצורך ניתוח קהילות מיקרוביאליות ומחקרים אפידמיולוגיים, היא אחד הצעדים החשובים לניטור וחיזוי מהלך ההתפרצויות בקהילות 1,2. מגפת הקורונה, גילתה את החשיבות של שיפור שיטות הריכוז. נגיף הקורונה פרץ בסוף 2019 ונכון למרץ 2023 עדיין מהווה איום על בריאות האדם, חיי החברה והכלכלה. אסטרטגיות מעקב ובקרה יעילות להקלת ההשפעות של התפרצויות COVID-19 בקהילות הפכו לנושא מחקר חשוב, שכן גלים ווריאנטים חדשים של COVID-19 צצים בנוסף להעברה והתפשטות המהירה של הנגיף, כמו גם מקרים אסימפטומטיים לא מדווחים ולא מאובחנים 3,4,5. השימוש באפידמיולוגיה מבוססת שפכים עבור COVID-19 על ידי ארגוני חברה אזרחית, סוכנויות ממשלתיות ושירותים ציבוריים או פרטיים סייע לספק מידע מהיר הקשור להתפרצות ולמתן את ההשפעות של התפרצויות COVID-19 6,7,8,9. עם זאת, ריכוז SARS-CoV-2, נגיף RNA עטוף, בדגימות שפכים עדיין מציב אתגרים10. לדוגמה, אחד האתגרים האלה הוא חלוקה של SARS-CoV-2 במוצקי שפכים, אשר עשוי להשפיע על התאוששות כאשר מוצקים מסולקים במהלך ריכוז11. אם זה המקרה, מוקד הכימות/הערכה צריך להיות הן בפאזה מוצקה והן בפאזה מימית של דגימות מים סביבתיות, ולא בפאזה המימית בלבד. יתר על כן, ניתן לשנות את בחירת שיטת הריכוז בהתבסס על בדיקות וניתוחים במורד הזרם. ריכוז חלקיקי הנגיף והפתוגנים מדגימות סביבתיות הפך לנושא מחקר דחוף עם התפתחויות בתחומי הריצוף והמיקרוביום.

שיטות שונות לריכוז וירוסים יושמו בתחום ריכוז הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים. כמה שיטות נפוצות הן סינון, חלב דל שומן flocculation (SMF), ספיחה / elution, ופוליאתילן גליקול משקעים12-17. ביניהם, SMF נחשב שיטה זולה ויעילה, נבדק בהצלחה ויישם עבור שחזור וירוסים, כולל SARS-CoV-2, משפכים ומים עיליים12,15,16,18. נוהל SMF הוא גישה חדשה יחסית שזכתה להכרה גוברת בקרב מחקרים סביבתיים רבים כמתודולוגיה מתאימה לשחזור בו זמנית של מגוון רחב של מיקרואורגניזמים כגון וירוסים, חיידקים ופרוטוזואנים מכל סוגי דגימות המים, כלומר דגימות בוצה, שפכים גולמיים, שפכים וקולחים19. בהשוואה למתודולוגיות ידועות אחרות לשחזור וירוסים מדגימות סביבתיות כגון אולטרה-סינון והדבקת גליצין-אלקליין, גישה מבוססת ליופיליזציה, או אולטרה-צנטריפוגה ופליטת גליצין-אלקליין, SMF דווח כשיטה היעילה ביותר עם שיעורי התאוששות וזיהוי נגיפיים גבוהים יותר18,20. במחקר הנוכחי, השתמשנו ב-RNA משוריין כנגיף בדיקה כדי להעריך את יעילות ההתאוששות של שיטות ריכוז הנגיף, כולל בדיקות להערכת התאוששות SARS-CoV-221,22.

כאן, בדקנו דגימות שפכים ומים סביבתיים כדי להדגים את התועלת של SMF ושיטת אולטרה-סינון רציפה לריכוז שברים מיקרוביאליים עבור תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR), מטגנומיקה מבוססת רצפים וריצוף אמפליקון עמוק. SMF היא שיטה זולה יחסית ואופטימלית לנפח גדול יותר של דגימות בהשוואה לשיטות אולטרה-סינון. הרעיון להשתמש בשיטת אולטרה-סינון רציפה נבע מהצורך להקטין את הנפח הסופי של תרכיזי הנגיפים בתקופת הקורונה, כאשר אספקת מכשירי האולטרה-סינון הנפוצים הייתה מוגבלת, והיה צורך בפיתוח שיטות חלופיות לריכוז הנגיף.

Protocol

1. השוואה בין אולטרה-סינון סדרתי לבין פלוקולציית חלב דל שומן לריכוז וירוסים בדגימות שפכים

  1. הכנת דוגמאות
    1. יש לאסוף 2 ליטר של דגימות שפכים מרוכבים (משפיעים) ביחס זרימה של 24 שעות. דגימות נאספו משלושת מתקני טיהור השפכים הגדולים בוויניפג, קנדה, במהלך הקיץ והסתיו של 2020 (טבלה 1).
    2. העבירו את הדגימות למעבדה בבקבוקים חסיני אור בארגז קרח ועבדו אותן תוך 24 שעות. איסוף נתונים פיסיקליים-כימיים וביולוגיים של שפכים.
  2. בדיקות ריכוז וירוסים
    הערה: שיטת אולטרה-סינון רציפה ושיטת פלוקולציה אורגנית, כלומר פלוקולציית חלב דל שומן (SMF), יושמו כדי להעריך את יעילות ההתאוששות הכוללת של כל שיטה באמצעות RNA משוריין כוירוס בדיקה23. חוקרים אחרים השתמשו גם ב-RNA משוריין כנגיף בקרה להערכת התאוששות שיטות ריכוז לנגיפים עוטפים, כמו המשפחה Coronaviridae22,24,25,26.
    1. להוספת RNA משוריין, הגדר את נפחי בדיקת השפכים לשיטות אולטרה-סינון ו-SMF כ-140 מ"ל ו-500 מ"ל, בהתאמה. באמצעות פיפטור, ספייק 5 x 104 עותקים של RNA משוריין לשש דגימות שפכים מתוקים שנאספו בתאריך אחד ושש דגימות שפכים מתוקים בתאריך אחר, עבור כל שיטת אולטרה-סינון; יתר על כן, ספייק שש דגימות שפכים מאוחסנות (ב -4 מעלות צלזיוס) שנאספו בתאריך שלישי, מאוחר יותר, ועובדו ימים לאחר מכן עבור SMF.
      הערה: כל אחת משש ערכות הדגימות שנאספו בתאריכים שונים הורכבה משתי דגימות מכל אחד משלושת WWTPs. במחקר שלנו, הקבוצה הראשונה של דגימות שפכים מתוקים נאספה ב-8 ביולי 2020, השנייה ב-30 בספטמבר 2020, ודגימות השפכים יאוחסנו עבור SMF ב-14 באוקטובר 2020.
    2. יש לערבב במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי לחסן וליצור הומוגניות של הרנ"א המשוריין בדגימות באמצעות מערבל מגנטי.
    3. הסר את כל החלקיקים או התאים הגדולים מ- 0.2 מיקרומטר ובצע אולטרה-סינון.
      1. סננו את דגימות השפכים הקוצניים (120 מ"ל מכל דגימה של 140 מ"ל) דרך בד גבינה וקשירה דלת חלבון, 0.45 מיקרומטר ו-0.2 מיקרומטר, מסנני דיסק ממברנות בקוטר 47 מ"מ, בהתאמה, כדי להסיר חלקיקים גדולים, משקעים, איקריוטים וחיידקים27. עבד את הדגימות המסוננות באמצעות שיטות אולטרה-סינון המתוארות להלן.
        הערה: דגימות השפכים שנאספו ב-8ביולי וב-30 בספטמבר שימשו לשיטותאולטרה-סינון עם 3,000 x g ו-7,500 x g, בהתאמה.
      2. עבור אולטרה-סינון רציף ב-3,000 x g (UF-3k x g), רכז סך של 120 מ"ל של דגימת הבדיקה שנאספה בתאריך הראשון ב-3,000 x g למשך 30 דקות על-ידי טעינת 60 מ"ל של הדגימה פעמיים לכ-5 מ"ל באמצעות התקן צנטריפוגלי מסוג A, 30-kDa. לאחר מכן, רכז את נפח 5 מ"ל ב- 3,000 x גרם למשך 30 דקות באמצעות התקן צנטריפוגלי מסוג B, 30-kDa, ל- 500-1,200 μL.
      3. עבור אולטרה-סינון רציף ב-7,500 x גרם (UF-7.5k x g), שנה את מהירות הצנטריפוגה עבור המכשיר הצנטריפוגלי של המותג B מ-3,000 x g ל-7,500 x g כדי לקבל נפחים סופיים קטנים יותר, בהתאם להמלצות היצרן, ולשמור על מהירות הצנטריפוגה של המכשיר הצנטריפוגלי של המותג A זהה.
        הערה: הבדיקות בוצעו עם הדגימות שנאספו ב-30 בספטמבר.
    4. עבור SMF, בצע את השלבים המפורטים להלן.
    5. יש להקפיץ את דגימות השפכים (500 מ"ל כל אחת) לריכוז ישיר באמצעות פרוטוקול SMF16,18, ללא סינון מוקדם עם בד גבינה ומסנני דיסק קשירה דלת חלבון, כמתואר להלן.
    6. יש להמיס 0.5 גרם אבקת חלב דל שומן ב-50 מ"ל מי ים סינתטיים לקבלת תמיסת חלב דל שומן במינון 1% (w/v) ולהתאים בזהירות את רמת החומציות של התמיסה ל-3.5 באמצעות 1 N HCl.
      הערה: החמצה גורמת לנגיפים להצטבר ולזרז מחוץ למים עקב השינוי בנקודה האיזואלקטרית שלהם16 ומשפרת את המסיסות של אבקת חלב28.
    7. הוסף 5 מ"ל של תמיסת חלב דל שומן ל 500 מ"ל של דגימות שפכים גולמיים כדי לקבל ריכוז סופי של חלב דל שומן של 0.01% (w / v).
    8. מערבבים את הדגימות במשך 8 שעות במהירות בינונית ומאפשרים לפלוקים שנוצרו להסתפק בעוד 8 שעות בטמפרטורת החדר.
    9. הסר את supernatants בזהירות באמצעות פיפטות סרולוגיות מבלי להפריע flocs התיישבו. העבר נפח סופי של 50 מ"ל המכיל את flocs לצינורות צנטריפוגות וצנטריפוגות ב 8,000 x גרם במשך 30 דקות ב 8 ° C.
    10. יש לגרד בזהירות את הכדוריות באמצעות מרית מעוקרת, ולהשהות מחדש את הכדוריות הנותרות בצינורות ב-250 μL של חיץ נתרן פוספט 0.2 M (pH 7.5) לאחר הסרת הסופרנאטנט. העבירו את הכדוריות המרוטשות והתלויות מחדש לאותם צינורות מיני-צנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל.
  3. ביצוע מיצוי RNA נגיפי מתרכיזים נגיפיים של דגימות שפכים ומבחני יעילות התאוששות באמצעות ערכת מיצוי RNA עם יחס של 25:24:1 של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל ו-β-מרקפטואתנול, בהתאם להוראות היצרן, כדי לשפר את יעילות המיצוי. לבסוף, לטשטש את הרנ"א ב 50 μL של חיץ אלוציה.
  4. ניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RT-qPCR)
    1. כימות RNA משוריין באמצעות דילול פי עשרה (7.8 x 10,4 עד 7.8 עותקי גנים) של DNA סינתטי חד-גדילי או מבנה gBlock. ראו טבלה 2 עבור הפריימרים וערכות הגשושיות המזהות ומכמתות את הרנ"א המשוריין.
    2. תכננו ערכות פריימר וגשושית באמצעות כלי תכנון פריימר29 וכוונו לאזור של 95 bp (מבנה gBlock) בתוך גנום ה-RNA המשוריין.
    3. השג עקומות כיול עבור כל ריצת RT-qPCR. כלול בקרות שליליות בכל הפעלת qPCR. הפעל תקנים, דוגמאות ופקדים שאינם פקדים שאינם תבניות בשלושה שולשים.
    4. הכינו כל תערובת RT-qPCR של 10 μL בסדר הבא: 2.5 μL של תערובת מאסטר 4x, 400 ננומטר של כל פריימר, בדיקה של 200 ננומטר ו-2.5 מיקרוליטר של תבנית, כמו גם מים מזוקקים טהורים במיוחד ללא DNAse/RNAse.
    5. בצע תגובות מחזור תרמיות ב- 50 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן 45 מחזורים של 95 ° C עבור 10 שניות ו- 60 ° C במשך 30 שניות במערכת PCR בזמן אמת. אם ה- CT היה <40, שקול את הדגימה RNA משוריין חיובי.
    6. בצע בדיקות qPCR ו- RT-qPCR באמצעות אלבומין בסרום בקר עם דגימות ביוב גולמיות כדי להעריך את האפשרות של מעכבים או מזהמים כגון חומצות הומיות24. לא נצפו הבדלים משמעותיים בין דגימות עם ובלי האנזים.
  5. חישוב הריכוזים מהעקומה הסטנדרטית. חשב את אחוז יעילות ההתאוששות על ידי חלוקת הריכוז המשוחזר בריכוז הקוצני.
  6. שנה מספרי העתקי גנים באמצעות הפונקציה log10 לניתוח. הפעל מודל ליניארי כללי באמצעות כלי ניתוח סטטיסטי על נתוני qPCR. יישם את הבדיקה של טוקי כדי לזהות הבדלים בין השיטות והטיפולים. קח ערך p של 0.05 כדי להיות רמת מובהקות מינימלית עבור המבחן.

2. סינון וריכוז נגיפי DNA ו-RNA לאפידמיולוגיה מבוססת מים

  1. לאיסוף מים עיליים סביבתיים, אספו 10 ליטר של דגימות מים עיליים סביבתיים והשתמשו ב-10 ליטר של דגימות מים שעברו דה-יוניזציה לבקרת רקע. אחסנו את כל הדגימות בחדר בטמפרטורה של 4°C עד לעיבוד תוך 24 שעות לאחר איסוף הדגימות.
  2. בצע ריכוז של וירוסים מדגימות סביבתיות עם SMF באמצעות השלבים המתוארים להלן.
    1. בצע סינון קפסולות ואקום באמצעות קפסולות דגימת מי תהום בקיבולת גבוהה ומסנני דיסק ממברנה בגדלים 0.45 מיקרומטר, 0.2 מיקרומטר ו- 0.1 מיקרומטר כדי למזער רעש במהלך ריצוף מטאגנומי, משברים גדולים יותר כגון מיקרו-איקריוטים וחיידקים ועד קטנים יותר כגון וירוסים.
    2. הכינו תמיסת חלב דל שומן בנפח 1% לפי נפח ב-1.32 ליטר מי ים סינתטיים עם 13.2 גרם אבקת חלב דל שומן. התאם את ה- pH של מתלה זה ל- 3.5 באמצעות 1 N HCl.
  3. התאימו את רמת החומציות של דגימות המים העיליים הסביבתיים ל-3.5 באמצעות 1 N HCl.
  4. העבירו 100 מ"ל של תמיסת חלב דל שומן חומצי מראש לדגימות מים סביבתיות של 10 ליטר חומצה (pH 3.5) (ריכוז חלב דל שומן סופי של 0.01% [w/v]).
  5. בעזרת מערבל מגנטי ומוט ערבוב מגנטי, ערבבו את הדגימות במשך 8 שעות בטמפרטורת החדר ואפשרו לפלוקים לשקוע על ידי כוח הכבידה במשך 8 שעות נוספות. מבלי להפריע לפלוקים, הסירו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות משאבת ואקום.
  6. Aliquot ולאזן את שאר flocs על פי המשקל בצינורות צנטריפוגות 50 מ"ל ולסובב אותם למטה ב 8,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
  7. השליכו את הסופרנאטנט והמיסו את הגלולה המתקבלת (המכילה באופן תיאורטי וירוסים בעלי עניין) ב-200 מיקרוליטר של חיץ נתרן פוספט 0.2 M.
  8. טפל בכדורית המומסת עם DNase I ו- RNase A, בהתאם להוראות היצרן, כדי לסלק DNA ו- RNA חופשיים נוכחים שעשויים להיות מואצים יחד בגלל הערכה המשמשת למיצוי חומצות גרעין. בטל את ההפעלה של DNase I ו- RNase A בהתאם להוראות היצרן.
  9. יש לחלץ את סך חומצות הגרעין מהגלולה המומסת באמצעות ערכת מיצוי DNA/RNA, בהתאם להוראות היצרן.
  10. כמת את הכמות הכוללת של DNA ו- RNA שחולצו מדגימות קולחים באמצעות פלואורומטר. דגימות עם ריכוזים >1 ng/μL נחשבות אופטימליות לכימות וריצוף DNA.
  11. בצע ניתוח qPCR כדי להתמקד וירוסים אנטריים מעניינים וריצוף תפוקה גבוהה כדי לזהות את מבנה הקהילה הנגיפית.

3. משקעים ישירים וריכוז של שברים מיקרוביאליים לאפידמיולוגיה מבוססת מים

  1. אספו 2 ליטר דגימות מים מנתיבי מים מוגנים ומושפעים. אם הדגימה מכילה כמות ניכרת של פסולת, השתמש בבד גבינה כדי להסיר אותם.
    הערה: מומלץ מאוד לאסוף עותק ביולוגי לכל דגימה.
  2. הכינו תמיסת חלב דל שומן 1% (w/v) על ידי המסת 4.4 גרם אבקת חלב דל שומן ב-440 מ"ל מי ים סינתטיים. כוונן את ה- pH של מתלה זה ל- 3.5 עם 1 N HCl.
  3. התאימו את רמת החומציות של דגימות המים המתוקים ל-3.5 באמצעות 1 N HCl.
  4. הוסף 20 מ"ל של תמיסת חלב דל שומן לדגימות 2 ליטר מים מתוקים שהותאמו בעבר ל- pH (ריכוז חלב דל שומן סופי של 0.01% [w/v]). ערבבו את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 8 שעות.
  5. אפשרו לפלוקים לשקוע בכוח הכבידה למשך 8 שעות נוספות. בזהירות להסיר את supernatants עם משאבה פריסטלטית. מעבירים את הפלוקים המשוקעים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ומסובבים אותם במהירות של 8,000 x גרם למשך 30 דקות.
  6. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הכדוריות עם 200 μL של חיץ נתרן פוספט 0.2 M. אחסן את הדגימות ב -20 ° C או המשך לבחור ~ 0.5 גרם של floc עבור מיצוי DNA מיקרוביאלי באמצעות ערכת בידוד חומצות גרעין לפי בחירה, בהתאם להוראות היצרן.
  7. לקבוע את ריכוז חומצת הגרעין DNA ואת טוהר עם פלואורומטר רגישות גבוהה. דגימות עם ריכוזים >1 ng/μL צריכות להיות אופטימליות לכימות וריצוף DNA.

תוצאות

הערכת שיטות ריכוז RNA נגיפי
כל שש הדגימות שעובדו עם UF-3k x g היו חיוביות והביאו להתאוששות של 13.38% ± 8.14% (איור 1). רק דגימה אחת הייתה חיובית כאשר הדגימות עובדו עם UF-7.5k x g. כל הדגימות שעובדו עם SMF היו חיוביות והביאו להתאוששות של 15.27% ± 2.65% (איור 1). שיע?...

Discussion

אחד השלבים הקריטיים במחקר זה הוא חיסול חלקיקים מוצקים על ידי יישום שלב סינון מקדים עם מסנני קרום 0.2 מיקרומטר ו- 0.45 מיקרומטר. בהתחשב בחלוקה של וירוסים לחלקיקים מוצקים, במיוחד וירוסים עטופים, סינון מוקדם יכול לגרום לאובדן משמעותי בהתאוששות הנגיפים30. בעוד שלב טרום סינון עבור שיט?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NSERC Alliance Covid-19 Grant (פרס מס '431401363, 2020-2021, ד"ר יואן ואויגווארי-דיאז). MUD רוצה להודות לתוכנית מענקי המחקר של האוניברסיטה (פרס מס '325201). הן JF והן JZA נתמכים על ידי תוכנית ההכשרה לתואר שני בניתוח מחלות חזותי ואוטומטי (VADA). KY ו-JF קיבלו שניהם מלגות מתוכנית Mitacs Accelerate. MUD וחברי המעבדה שלו (KY, JF, JZA) נתמכים על ידי NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) ומענק החוקר החדש של מחקר מניטובה (No 5385). תודה מיוחדת לעיר ויניפג, מניטובה. מחקר זה נערך באוניברסיטת מניטובה. ברצוננו להכיר בכך שהקמפוסים של אוניברסיטת מניטובה ממוקמים על האדמות המקוריות של עמי אנישינבג, קרי, אוג'י-קרי, דקוטה ודיין ועל מולדת אומת מטיס.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5Alfa AesarJ62041APFisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filtersVWR66234Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filtersVWR60043Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master MixThermo Fisher Scientific4444432Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing ControlAsuragen49650Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDaPall OD030C65Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDaPallMCP010C46Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml) Nalgene3119-0050PKThermo Fisher Scientific
DNAse IInvitrogen18047019Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2Invitrogen12027Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µmPall12179Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solutionThermo Fisher ScientificAC124210025Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation KitApplied biosystemsA42358Thermo Fisher Scientific
Nuclease free waterPromegaP1197Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pumpMasterflex, Cole-Parmer instrument7553-20Thermo Fisher Scientific
pH meter Denver instrumentRK-59503-25Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1Invitrogen15593031Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe setsIDTIntegrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kitQiagenQiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR SystemThermo Fisher ScientificA34322Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kitInvitrogenQ33231Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFiInvitrogenQ33238Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kitInvitrogenQ32855Thermo Fisher Scientific
RNAse AInvitrogenEN0531Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome KitQiagen26000-50Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powderDifco (BD Life Sciences)DF0032173Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate bufferAlfa AesarAlfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawaterVWR RC8363-1RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlockIDTIntegrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiatedPall4621Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiatedPall4622Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanolGibco21985023Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

References

  1. Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
  2. Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
  3. Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
  4. Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
  5. Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
  6. Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
  7. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  8. Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
  9. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
  10. Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
  11. Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
  12. Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
  13. Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
  14. Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
  15. Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
  16. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  17. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
  18. Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
  20. Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
  21. Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
  22. Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
  23. Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
  24. Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
  25. Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
  26. Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
  27. Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
  28. Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), 3526-3537 (2018).
  29. . Geneious Available from: https://www.geneious.com (2021)
  30. Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
  31. Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
  32. Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
  33. Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved