JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La concentration de virus à partir d’échantillons d’eau et d’eaux usées dans l’environnement est une tâche difficile, effectuée principalement pour l’identification et la quantification des virus. Bien que plusieurs méthodes de concentration virale aient été développées et testées, nous démontrons ici l’efficacité de l’ultrafiltration et de la floculation du lait écrémé pour les virus à ARN avec différents types d’échantillons.

Résumé

L’épidémiologie basée sur l’eau et les eaux usées est apparue comme des méthodes alternatives pour surveiller et prédire l’évolution des épidémies dans les communautés. La récupération des fractions microbiennes, y compris les virus, les bactéries et les microeucaryotes à partir d’échantillons d’eaux usées et d’eau environnementale est l’une des étapes difficiles de ces approches. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur l’efficacité de récupération de l’ultrafiltration séquentielle et des méthodes de floculation de lait écrémé (SMF) utilisant l’ARN blindé comme virus test, qui est également utilisé comme contrôle par d’autres études. Une préfiltration avec des filtres à disque à membrane de 0,45 μm et 0,2 μm a été appliquée pour éliminer les particules solides avant l’ultrafiltration afin d’éviter le colmatage des dispositifs d’ultrafiltration. Les échantillons d’essai, traités avec la méthode d’ultrafiltration séquentielle, ont été centrifugés à deux vitesses différentes. Une vitesse accrue a entraîné une baisse des taux de récupération et de positivité de l’ARN blindé. D’autre part, SMF a entraîné des taux de récupération et de positivité relativement constants de l’ARN blindé. Des tests supplémentaires effectués avec des échantillons d’eau environnementale ont démontré l’utilité de SMF pour concentrer d’autres fractions microbiennes. La répartition des virus en particules solides pourrait avoir un impact sur les taux de récupération globaux, compte tenu de l’étape de préfiltration appliquée avant l’ultrafiltration des échantillons d’eaux usées. SMF avec préfiltration a donné de meilleurs résultats lorsqu’il est appliqué à des échantillons d’eau environnementale en raison de concentrations solides plus faibles dans les échantillons et donc de taux de séparation plus faibles dans les solides. Dans la présente étude, l’idée d’utiliser une méthode d’ultrafiltration séquentielle est née de la nécessité de diminuer le volume final des concentrés viraux pendant la pandémie de COVID-19, lorsque l’approvisionnement en dispositifs d’ultrafiltration couramment utilisés était limité et qu’il était nécessaire de développer d’autres méthodes de concentration virale.

Introduction

La détermination de la concentration effective de microorganismes dans les échantillons de surface et d’eaux usées pour l’analyse des communautés microbiennes et les études épidémiologiques est l’une des étapes importantes pour surveiller et prévoir l’évolution des éclosions dans les communautés 1,2. La pandémie de COVID-19 a révélé l’importance d’améliorer les méthodes de concentration. La COVID-19 est apparue à la fin de 2019 et, en mars 2023, constitue toujours une menace pour la santé humaine, la vie sociale et l’économie. Les stratégies efficaces de surveillance et de contrôle visant à atténuer les répercussions des éclosions de COVID-19 dans les communautés sont devenues un sujet de recherche important, car de nouvelles vagues et variantes de la COVID-19 ont fait leur apparition en plus de la transmission et de la propagation rapides du virus, ainsi que des cas asymptomatiques non déclarés et non diagnostiqués 3,4,5. L’utilisation de l’épidémiologie basée sur les eaux usées pour la COVID-19 par les organisations de la société civile, les agences gouvernementales et les services publics ou privés a été utile pour fournir rapidement des informations liées à l’épidémie et atténuer les impacts des épidémies de COVID-19 6,7,8,9. Cependant, la concentration de SARS-CoV-2, un virus à ARN enveloppé, dans les échantillons d’eaux usées pose toujours des défis10. Par exemple, l’un de ces défis est la répartition du SRAS-CoV-2 dans les solides d’eaux usées, ce qui peut avoir une incidence sur la récupération lorsque les solides sont éliminés pendant la concentration11. Si tel est le cas, la quantification/évaluation devrait être axée sur les phases solide et aqueuse des échantillons d’eau environnementale, plutôt que sur la phase aqueuse seulement. En outre, le choix de la méthode de concentration peut être modifié en fonction des essais et des analyses en aval. La concentration de particules virales et d’agents pathogènes provenant d’échantillons environnementaux est devenue un sujet de recherche urgent avec les développements dans les domaines du séquençage et du microbiome.

Diverses méthodes de concentration virale ont été appliquées dans le domaine de la concentration virale à partir d’échantillons d’eau et d’eaux usées environnementales. Certaines méthodes couramment utilisées sont la filtration, la floculation de lait écrémé (SMF), l’adsorption/élution et la précipitation du polyéthylèneglycol12-17. Parmi eux, le SMF a été considéré comme une méthode peu coûteuse et efficace, testée avec succès et appliquée pour récupérer des virus, y compris le SARS-CoV-2, des eaux usées et des eaux de surface12,15,16,18. La procédure SMF est une approche relativement nouvelle qui est de plus en plus reconnue par de nombreuses études environnementales comme une méthodologie appropriée pour récupérer simultanément un large éventail de micro-organismes tels que des virus, des bactéries et des protozoaires à partir de tous les types d’échantillons d’eau, à savoir les échantillons de boues, d’eaux usées brutes, d’eaux usées et d’effluents19. Comparativement à d’autres méthodes connues de récupération de virus à partir d’échantillons environnementaux, comme l’ultrafiltration et l’élution glycine-alcaline, l’approche basée sur la lyophilisation ou l’ultracentrifugation et l’élution glycine-alcaline, la FMS a été signalée comme la méthode la plus efficace avec des taux de récupération et de détection virale plus élevés18,20. Dans la présente étude, nous avons utilisé l’ARN blindé comme virus test pour évaluer l’efficacité de récupération des méthodes de concentration virale, y compris les tests pour évaluer la récupération du SARS-CoV-221,22.

Ici, nous avons testé des échantillons d’eaux usées et d’eau environnementale pour démontrer l’utilité de la SMF et d’une méthode d’ultrafiltration séquentielle pour concentrer les fractions microbiennes pour la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR), la métagénomique basée sur les séquences et le séquençage à amplicon profond. La SMF est une méthode relativement moins chère et optimale pour un plus grand volume d’échantillons par rapport aux méthodes d’ultrafiltration. L’idée d’utiliser une méthode d’ultrafiltration séquentielle est née de la nécessité de diminuer le volume final des concentrés viraux pendant la pandémie de COVID-19, lorsque l’approvisionnement en dispositifs d’ultrafiltration couramment utilisés était limité et qu’il était nécessaire de développer d’autres méthodes de concentration virale.

Protocole

1. Comparaison de l’ultrafiltration en série et de la floculation du lait écrémé avec les virus concentrés dans les échantillons d’eaux usées

  1. Préparation des échantillons
    1. Prélever 2 L d’échantillons composites d’eaux usées brutes (influentes) proportionnels au débit sur 24 h. Des échantillons ont été prélevés dans les trois principales usines de traitement des eaux usées (STEP) de Winnipeg, au Canada, au cours de l’été et de l’automne 2020 (tableau 1).
    2. Transporter les échantillons au laboratoire dans des bouteilles résistantes à la lumière dans une glacière et les traiter dans les 24 heures. Recueillir des données sur les caractéristiques physico-chimiques et biologiques des eaux usées.
  2. Tests de concentration du virus
    NOTE: Une méthode d’ultrafiltration séquentielle et une méthode de floculation organique, à savoir la floculation de lait écrémé (SMF), ont été appliquées pour évaluer l’efficacité totale de récupération de chaque méthode en utilisant l’ARN blindé comme virus d’essai.23. D’autres chercheurs ont également utilisé l’ARN blindé comme virus de contrôle pour évaluer la récupération des méthodes de concentration pour les virus enveloppés, tels que la famille Coronaviridae22,24,25,26.
    1. Pour l’ajout d’ARN blindé, définissez les volumes d’analyse des eaux usées pour les méthodes d’ultrafiltration et de SMF à 140 mL et 500 mL, respectivement. À l’aide d’un pipeteur, piquer 5 x 104 copies d’ARN blindé dans six échantillons d’eaux usées fraîches prélevés à une date et six échantillons d’eaux usées fraîches à une autre date, pour chaque méthode d’ultrafiltration; en outre, six échantillons d’eaux usées stockés (à 4 °C) ont été prélevés à une troisième date ultérieure et traités quelques jours plus tard pour SMF.
      REMARQUE : Chacun des six ensembles d’échantillons prélevés à des dates différentes était composé de deux échantillons provenant de chacune des trois stations d’épuration. Dans notre étude, la première série d’échantillons d’eaux usées fraîches a été recueillie le 8 juillet 2020, la seconde le 30 septembre 2020 et les échantillons d’eaux usées seront stockés pour SMF le 14 octobre 2020.
    2. Remuer pendant 30 min à 4 °C pour inoculer et homogénéiser l’ARN blindé dans les échantillons à l’aide d’un agitateur magnétique.
    3. Retirez toutes les particules ou cellules de plus de 0,2 μm et effectuez l’ultrafiltration.
      1. Filtrer les échantillons d’eaux usées enrichies (120 mL de chaque échantillon enrichi de 140 mL) à travers une étamine et une liaison à faible teneur en protéines, des filtres à disque à membrane de 0,45 μm et 0,2 μm et 47 mm, respectivement, pour éliminer les grosses particules, les sédiments, les eucaryotes et les bactéries27. Traiter les échantillons filtrés en utilisant les méthodes d’ultrafiltration décrites ci-dessous.
        REMARQUE : Les échantillons d’eaux usées prélevés le 8 juillet et le 30septembre ont été utilisés pour des méthodes d’ultrafiltration avec 3 000 xg et 7 500 x g, respectivement.
      2. Pour l’ultrafiltration séquentielle à 3 000 x g (UF-3k x g), concentrer un total de 120 mL de l’échantillon d’essai prélevé à la première date à 3 000 x g pendant 30 minutes en chargeant 60 mL de l’échantillon deux fois à environ 5 mL à l’aide d’un dispositif centrifuge de marque A, 30 kDa. Ensuite, concentrez le volume de 5 mL à 3 000 x g pendant 30 minutes à l’aide d’un dispositif centrifuge de marque B, 30 kDa, à 500-1 200 μL.
      3. Pour l’ultrafiltration séquentielle à 7 500 x g (UF-7,5k x g), modifiez la vitesse de centrifugation du dispositif centrifuge de marque B de 3 000 x g à 7 500 x g pour obtenir des volumes finaux plus petits, conformément aux recommandations du fabricant, et conservez la vitesse de centrifugation du dispositif centrifuge de marque A identique.
        NOTE: Les tests ont été effectués avec les échantillons prélevés le 30septembre.
    4. Pour SMF, effectuez les étapes décrites ci-dessous.
    5. Augmenter les échantillons d’eaux usées (500 mL chacun) pour les concentrer directement en utilisant le protocole SMF16,18, sans préfiltration avec une étamine et des filtres à disque à membrane à faible teneur en protéines, comme décrit ci-dessous.
    6. Dissoudre 0,5 g de lait écrémé en poudre dans 50 mL d’eau de mer synthétique pour obtenir une solution de lait écrémé à 1 % (p/v) et ajuster soigneusement le pH de la solution à 3,5 en utilisant 1 N HCl.
      NOTE: L’acidification fait que les virus s’agrègent et précipitent hors de l’eau en raison du changement de leur point isoélectrique16 et améliore la solubilité du lait en poudre28.
    7. Ajouter 5 mL de solution de lait écrémé à 500 mL d’échantillons d’eaux usées crues pour obtenir une concentration finale de lait écrémé de 0,01 % (p/v).
    8. Remuer les échantillons pendant 8 h à vitesse moyenne et laisser les flocs formés se déposer encore 8 h à température ambiante.
    9. Retirer soigneusement les surnageants à l’aide de pipettes sérologiques sans déranger les flocs déposés. Transférer un volume final de 50 mL contenant les flocs dans des tubes à centrifuger et centrifuger à 8 000 x g pendant 30 min à 8 °C.
    10. Mettez soigneusement les granulés au rebut à l’aide d’une spatule stérilisée et remettez en suspension les granulés restants dans les tubes dans 250 μL de tampon phosphate de sodium 0,2 M (pH 7,5) après le retrait du surnageant. Transférer les pastilles raclées et remises en suspension dans les mêmes tubes minicentrifugeuses de 1,5 mL.
  3. Effectuer l’extraction de l’ARN viral à partir de concentrés viraux d’échantillons d’eaux usées et des tests d’efficacité de récupération à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN avec un rapport de 25:24:1 de phénol:chloroforme:alcool isoamylique et β-mercaptoéthanol, selon les instructions du fabricant, pour améliorer l’efficacité de l’extraction. Enfin, éluer l’ARN dans 50 μL de tampon d’élution.
  4. Analyse quantitative en chaîne par polymérase en temps réel (RT-qPCR)
    1. Quantifier l’ARN blindé en utilisant des dilutions décuplées (7,8 x 104 à 7,8 copies de gènes) d’un ADN simple brin synthétique ou d’une construction gBlock. Voir le tableau 2 pour les amorces et les ensembles de sondes qui détectent et quantifient l’ARN blindé.
    2. Concevoir des ensembles d’amorces et de sondes à l’aide de l’outil de conception d’amorces29 et cibler une région de 95 pb (construction gBlock) dans le génome de l’ARN blindé.
    3. Obtenez des courbes d’étalonnage pour chaque exécution RT-qPCR. Inclure des contrôles négatifs dans chaque qPCR. Exécutez des normes, des exemples et des contrôles sans modèle en trois exemplaires.
    4. Préparer chaque mélange RT-qPCR de 10 μL dans l’ordre suivant : 2,5 μL de mélange maître 4x, 400 nM de chaque apprêt, sonde 200 nM et 2,5 μL de gabarit, ainsi que de l’eau distillée ultrapure sans DNAse/RNAse.
    5. Effectuer des réactions de cyclage thermique à 50 °C pendant 5 min, suivies de 45 cycles de 95 °C pendant 10 s et de 60 °C pendant 30 s sur un système de PCR en temps réel. Si le CT était de <40, considérez l’échantillon d’ARN blindé positif.
    6. Effectuer des tests qPCR et RT-qPCR en utilisant de l’albumine sérique bovine avec des échantillons d’eaux usées brutes afin d’évaluer la possibilité d’inhibiteurs ou de contaminants tels que les acides humiques24. Aucune différence significative n’a été observée entre les échantillons avec et sans l’enzyme.
  5. Calculer les concentrations à partir de la courbe standard. Calculez le pourcentage d’efficacité de récupération en divisant la concentration récupérée par la concentration d’augmentation.
  6. Transformez le nombre de copies de gènes à l’aide de la fonction log10 pour l’analyse. Exécutez un modèle linéaire général à l’aide d’un outil d’analyse statistique sur les données qPCR. Appliquez le test de Tukey pour détecter les différences entre les méthodes et les traitements. Prenez une valeur de p de 0,05 comme niveau de signification minimum pour le test.

2. Filtration et concentration des virus à ADN et à ARN pour l’épidémiologie à base d’eau

  1. Pour la collecte d’eau de surface environnementale, prélever 10 L d’échantillons d’eau de surface environnementale et utiliser 10 L d’échantillons d’eau désionisée pour le contrôle du bruit de fond. Conserver tous les échantillons dans une salle à 4 °C jusqu’à leur traitement dans les 24 heures suivant le prélèvement.
  2. Effectuer la concentration de virus à partir d’échantillons environnementaux avec SMF en suivant les étapes décrites ci-dessous.
    1. Effectuer la filtration par capsule et sous vide à l’aide de capsules d’échantillonnage d’eau souterraine de grande capacité et de filtres à disques à membrane de 0,45 μm, 0,2 μm et 0,1 μm pour minimiser le bruit pendant le séquençage métagénomique, des fractions plus grandes telles que les micro-eucaryotes et les bactéries aux plus petites telles que les virus.
    2. Préparer une solution de lait écrémé préfloculé à 1 % poids par volume dans 1,32 L d’eau de mer synthétique avec 13,2 g de lait écrémé en poudre. Ajuster le pH de cette suspension à 3,5 en utilisant 1 N HCl.
  3. Ajuster le pH des échantillons d’eau de surface environnementale à 3,5 en utilisant 1 N HCl.
  4. Transvaser 100 mL de la solution de lait écrémé acidifié préfloculée dans des échantillons d’eau ambiante acidifiée de 10 L (pH 3,5) (concentration finale de lait écrémé de 0,01 % [p/v]).
  5. À l’aide d’un agitateur magnétique et d’une barre d’agitation magnétique, agiter les échantillons pendant 8 h à température ambiante et laisser les flocs sédimenter par gravité pendant 8 heures supplémentaires. Sans déranger les flocs, retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pompe à vide.
  6. Aliquote et équilibrer les flocs restants en fonction du poids dans des tubes à centrifuger de 50 ml et les faire tourner vers le bas à 8 000 x g pendant 30 minutes à 4 °C.
  7. Jeter le surnageant et dissoudre la pastille résultante (qui contient théoriquement des virus d’intérêt) dans 200 μL de tampon phosphate de sodium 0,2 M.
  8. Traiter la pastille dissoute avec la DNase I et la RNase A, en suivant les instructions du fabricant, afin d’éliminer l’ADN et l’ARN libres présents qui peuvent être coprécipités en raison de la trousse utilisée pour l’extraction des acides nucléiques. Désactivez la DNase I et la RNase A en suivant les instructions du fabricant.
  9. Extraire les acides nucléiques totaux de la pastille dissoute à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN / ARN, conformément aux instructions du fabricant.
  10. Quantifier la quantité totale d’ADN et d’ARN extraits d’échantillons d’effluents à l’aide d’un fluoromètre. Les échantillons dont les concentrations sont >1 ng/μL sont considérés comme optimaux pour la quantification et le séquençage de l’ADN.
  11. Effectuer une analyse qPCR pour cibler les virus entériques d’intérêt et un séquençage à haut débit pour identifier la structure de la communauté virale.

3. Précipitations directes et concentration des fractions microbiennes pour l’épidémiologie aqueuse

  1. Prélever 2 L d’échantillons d’eau dans les cours d’eau protégés et contaminés. Si l’échantillon contient une quantité considérable de débris, utilisez une étamine pour les enlever.
    REMARQUE : Il est fortement recommandé de prélever un double biologique par échantillon.
  2. Préparer une solution de lait écrémé à 1 % (p/v) en dissolvant 4,4 g de lait écrémé en poudre dans 440 mL d’eau de mer synthétique. Ajuster le pH de cette suspension à 3,5 avec 1 N HCl.
  3. Ajuster le pH des échantillons d’eau douce à 3,5 en utilisant 1 N HCl.
  4. Ajouter 20 ml de solution de lait écrémé aux échantillons d’eau douce de 2 L au pH précédemment ajusté (concentration finale de lait écrémé de 0,01 % [p/v]). Remuer les échantillons à température ambiante pendant 8 h.
  5. Laisser les flocs sédimenter par gravité pendant encore 8 heures. Retirez délicatement les surnageants à l’aide d’une pompe péristaltique. Transférer les flocs sédimentés dans un tube à centrifuger de 50 ml et les faire tourner à 8 000 x g pendant 30 minutes.
  6. Jeter le surnageant et remettre les pastilles en suspension avec 200 μL de tampon phosphate de sodium 0,2 M. Conservez les échantillons à -20 °C ou procédez à la sélection de ~ 0,5 g du floc pour l’extraction de l’ADN microbien en utilisant le kit d’isolation des acides nucléiques de votre choix, en suivant les instructions du fabricant.
  7. Déterminez la concentration et la pureté de l’acide nucléique de l’ADN à l’aide d’un fluoromètre à haute sensibilité. Les échantillons avec des concentrations >1 ng/μL devraient être optimaux pour la quantification et le séquençage de l’ADN.

Résultats

Évaluation des méthodes de concentration de l’ARN viral
Les six échantillons traités avec de l’UF-3k x g étaient positifs et ont donné lieu à une récupération de 13,38 % ± 8,14 % (figure 1). Un seul échantillon était positif lorsque les échantillons ont été traités avec de l’UF-7,5k x g. Tous les échantillons traités avec SMF étaient positifs et ont donné lieu à un taux de récupération de 15,27 % ± de 2,65 % (

Discussion

L’une des étapes critiques de cette étude est l’élimination des particules solides par l’application d’une étape de préfiltration avec des filtres à membrane de 0,2 μm et 0,45 μm. Compte tenu de la répartition des virus en particules solides, en particulier en virus enveloppés, la préfiltration peut entraîner une perte importante de récupérationvirale30. Alors qu’une étape de préfiltration pour les méthodes d’ultrafiltration est presque toujours nécessaire pour les é...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer le travail rapporté dans cet article.

Remerciements

Ce travail a été financé par la subvention Covid-19 de l’Alliance du CRSNG (bourse no 431401363, 2020-2021, Drs Yuan et Uyaguari-Díaz). MUD tient à remercier le Programme de subventions de recherche universitaire (prix no 325201). JF et JZA sont tous deux soutenus par le programme de formation des diplômés Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY et JF ont tous deux reçu des bourses du programme Mitacs Accélération. MUD et ses membres de laboratoire (KY, JF, JZA) sont soutenus par le GENSNG-DG (RGPIN-2022-04508) et la subvention de fonctionnement pour nouveaux chercheurs de Research Manitoba (no 5385). Un merci spécial à la Ville de Winnipeg, au Manitoba. Cette recherche a été menée à l’Université du Manitoba. Nous tenons à souligner que les campus de l’Université du Manitoba sont situés sur les terres originales des peuples Anishinaabeg, Cri, Oji-Cri, Dakota et Déné et sur la patrie de la Nation métisse.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5Alfa AesarJ62041APFisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filtersVWR66234Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filtersVWR60043Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master MixThermo Fisher Scientific4444432Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing ControlAsuragen49650Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDaPall OD030C65Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDaPallMCP010C46Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml) Nalgene3119-0050PKThermo Fisher Scientific
DNAse IInvitrogen18047019Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2Invitrogen12027Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µmPall12179Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solutionThermo Fisher ScientificAC124210025Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation KitApplied biosystemsA42358Thermo Fisher Scientific
Nuclease free waterPromegaP1197Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pumpMasterflex, Cole-Parmer instrument7553-20Thermo Fisher Scientific
pH meter Denver instrumentRK-59503-25Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1Invitrogen15593031Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe setsIDTIntegrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kitQiagenQiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR SystemThermo Fisher ScientificA34322Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kitInvitrogenQ33231Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFiInvitrogenQ33238Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kitInvitrogenQ32855Thermo Fisher Scientific
RNAse AInvitrogenEN0531Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome KitQiagen26000-50Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powderDifco (BD Life Sciences)DF0032173Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate bufferAlfa AesarAlfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawaterVWR RC8363-1RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlockIDTIntegrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiatedPall4621Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiatedPall4622Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanolGibco21985023Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

Références

  1. Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
  2. Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
  3. Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
  4. Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
  5. Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
  6. Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
  7. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  8. Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
  9. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
  10. Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
  11. Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
  12. Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
  13. Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
  14. Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
  15. Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
  16. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  17. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
  18. Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
  20. Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
  21. Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
  22. Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
  23. Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
  24. Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
  25. Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
  26. Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
  27. Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
  28. Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), 3526-3537 (2018).
  29. . Geneious Available from: https://www.geneious.com (2021)
  30. Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
  31. Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
  32. Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
  33. Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Ce mois ci dans JoVEnum ro 193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.