JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Концентрация вирусов в пробах воды и сточных вод окружающей среды представляет собой сложную задачу, выполняемую главным образом для идентификации и количественной оценки вирусов. Несмотря на то, что было разработано и протестировано несколько методов концентрации вирусов, мы демонстрируем здесь эффективность ультрафильтрации и флокуляции обезжиренного молока для РНК-вирусов с различными типами образцов.

Аннотация

Эпидемиология, основанная на водных ресурсах и сточных водах, стала альтернативным методом мониторинга и прогнозирования хода вспышек в сообществах. Извлечение микробных фракций, включая вирусы, бактерии и микроэукариоты, из сточных вод и проб воды окружающей среды является одним из сложных шагов в этих подходах. В этом исследовании мы сосредоточились на эффективности восстановления методов последовательной ультрафильтрации и флокуляции обезжиренного молока (SMF) с использованием бронированной РНК в качестве тестового вируса, который также используется в качестве контроля в некоторых других исследованиях. Предварительная фильтрация мембранными дисковыми фильтрами 0,45 мкм и 0,2 мкм применялась для удаления твердых частиц перед ультрафильтрацией для предотвращения засорения ультрафильтрационных устройств. Испытуемые образцы, обработанные методом последовательной ультрафильтрации, центрифугировали на двух разных скоростях. Увеличение скорости привело к снижению уровня восстановления и положительности бронированной РНК. С другой стороны, SMF приводил к относительно последовательному восстановлению и положительным показателям бронированной РНК. Дополнительные тесты, проведенные с пробами воды из окружающей среды, продемонстрировали полезность SMF для концентрирования других микробных фракций. Разделение вирусов на твердые частицы может повлиять на общую скорость извлечения, учитывая стадию предварительной фильтрации, применяемую перед ультрафильтрацией проб сточных вод. SMF с предварительной фильтрацией показал лучшую эффективность при нанесении на пробы воды из окружающей среды из-за более низких концентраций твердых веществ в пробах и, следовательно, более низких скоростей разделения на твердые частицы. В настоящем исследовании идея использования метода последовательной ультрафильтрации возникла из-за необходимости снижения конечного объема вирусных концентратов в период пандемии COVID-19, когда поставки широко используемых ультрафильтрационных устройств были ограничены, и возникла необходимость в разработке альтернативных методов концентрации вируса.

Введение

Определение эффективной концентрации микроорганизмов в пробах поверхностных и сточных вод для анализа микробных сообществ и эпидемиологических исследований является одним из важных шагов для мониторинга и прогнозирования течения вспышек в сообществах 1,2. Пандемия COVID-19 раскрыла важность совершенствования методов концентрации. COVID-19 возник в конце 2019 года и по состоянию на март 2023 года по-прежнему представляет угрозу для здоровья людей, социальной жизни и экономики. Эффективные стратегии эпиднадзора и контроля для смягчения последствий вспышек COVID-19 в сообществах стали важной темой исследований, поскольку в дополнение к быстрой передаче и распространению вируса появляются новые волны и варианты COVID-19, а также незарегистрированные и недиагностированные бессимптомные случаи 3,4,5. Использование эпидемиологии COVID-19 на основе сточных вод организациями гражданского общества, государственными учреждениями и государственными или частными коммунальными службами помогло быстро предоставить информацию, связанную со вспышками, и смягчить последствия вспышек COVID-19 6,7,8,9. Тем не менее, концентрация SARS-CoV-2, вируса РНК в оболочке, в образцах сточных вод по-прежнему создает проблемы10. Например, одной из таких проблем является разделение SARS-CoV-2 в твердых частицах сточных вод, что может повлиять на восстановление, когда твердые вещества удаляются во время концентрации11. Если это так, то при количественном определении/оценке основное внимание следует уделять как твердой, так и водной фазам проб воды в окружающей среде, а не только водной фазе. Кроме того, выбор метода концентрирования может быть изменен на основе последующих испытаний и анализов. Концентрация вирусных частиц и патогенов в образцах окружающей среды стала актуальной темой исследований с разработками в области секвенирования и микробиома.

Различные методы концентрации вируса применялись в области концентрации вируса в пробах воды и сточных вод окружающей среды. Некоторые часто используемые методы: фильтрация, флокуляция обезжиренного молока (SMF), адсорбция/элюирование и осаждение полиэтиленгликоля12-17. Среди них SMF считается дешевым и эффективным методом, успешно протестированным и применяемым для извлечения вирусов, включая SARS-CoV-2, из сточных и поверхностных вод12,15,16,18. Процедура SMF является относительно новым подходом, который получил все большее признание во многих экологических исследованиях в качестве подходящей методологии для одновременного извлечения широкого спектра микроорганизмов, таких как вирусы, бактерии и простейшие, из всех типов проб воды, а именно из проб ила, неочищенных сточных вод, сточных вод и сточных вод19. По сравнению с другими известными методологиями извлечения вирусов из образцов окружающей среды, такими как ультрафильтрация и глицин-щелочное элюирование, подход, основанный на лиофилизации, или ультрацентрифугирование и глицин-щелочное элюирование, SMF был признан наиболее эффективным методом с более высокими показателями восстановления и обнаружения вирусов18,20. В настоящем исследовании мы использовали бронированную РНК в качестве тестового вируса для оценки эффективности восстановления методами концентрации вируса, включая тесты для оценки восстановления SARS-CoV-221,22.

Здесь мы протестировали образцы сточных вод и воды окружающей среды, чтобы продемонстрировать полезность SMF и последовательного метода ультрафильтрации для концентрирования микробных фракций для количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР), метагеномики на основе последовательностей и секвенирования с глубоким ампликоном. SMF является относительно более дешевым методом и оптимален для большего объема образцов по сравнению с методами ультрафильтрации. Идея использования метода последовательной ультрафильтрации возникла из-за необходимости уменьшить конечный объем вирусных концентратов во время пандемии COVID-19, когда поставки широко используемых ультрафильтрационных устройств были ограничены, и возникла необходимость в разработке альтернативных методов концентрации вируса.

протокол

1. Сравнение серийной ультрафильтрации и флокуляции обезжиренного молока для концентрирования вирусов в пробах сточных вод

  1. Пробоподготовка
    1. Соберите 2 л 24-часовых пропорциональных потоку композитных образцов неочищенных (приточных) сточных вод. Пробы были взяты с трех основных очистных сооружений (СОСВ) в Виннипеге, Канада, летом и осенью 2020 года (таблица 1).
    2. Транспортируйте образцы в лабораторию в светонепроницаемых бутылках в холодильнике и обрабатывайте их в течение 24 часов. Сбор данных о физико-химических и биологических характеристиках сточных вод.
  2. Анализы концентрации вируса
    ПРИМЕЧАНИЕ: Метод последовательной ультрафильтрации и метод органической флокуляции, а именно флокуляция обезжиренного молока (SMF), были применены для оценки общей эффективности восстановления каждого метода с использованием бронированной РНК в качестве тестового вируса23. Другие исследователи также использовали бронированную РНК в качестве контрольного вируса для оценки восстановления методов концентрации оболочечных вирусов, таких как семейство Coronaviridae22,24,25,26.
    1. Для добавления бронированной РНК установите объемы испытаний сточных вод для методов ультрафильтрации и SMF как 140 мл и 500 мл соответственно. Используя пипеттор, добавьте 5 x 104 копий бронированной РНК в шесть образцов пресных сточных вод, собранных в одну дату, и шесть проб пресных сточных вод в другую дату для каждого метода ультрафильтрации; кроме того, в Spike six хранились (при 4 °C) пробы сточных вод, собранные на третью, более позднюю дату и обработанные через несколько дней для SMF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый из шести наборов проб, собранных в разные даты, состоял из двух проб с каждой из трех очистных сооружений. В нашем исследовании первый набор проб пресных сточных вод был собран 8 июля 2020 года, второй - 30 сентября 2020 года, а пробы сточных вод будут храниться для SMF - 14 октября 2020года.
    2. Перемешивайте в течение 30 минут при 4 ° C, чтобы инокулировать и гомогенизировать бронированную РНК в образцах с помощью магнитной мешалки.
    3. Удалите все частицы или ячейки размером более 0,2 мкм и выполните ультрафильтрацию.
      1. Отфильтруйте образцы сточных вод с шипами (120 мл из каждого образца с шипами объемом 140 мл) через марлю и мембранные дисковые фильтры с низким содержанием белка размером 0,45 мкм и 0,2 мкм, 47 мм, соответственно, для удаления крупных частиц, отложений, эукариот и бактерий27. Обработайте отфильтрованные образцы, используя методы ультрафильтрации, описанные ниже.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пробы сточных вод, собранные 8 июля и 30 сентября, были использованы для методов ультрафильтрации с 3 000 xg и 7 500 x g соответственно.
      2. Для последовательной ультрафильтрации при 3000 x g (UF-3k x g) концентратируют в общей сложности 120 мл испытуемого образца, собранного в первый день при 3000 x g, в течение 30 мин, загружая 60 мл образца дважды примерно до 5 мл с использованием центробежного устройства марки А, 30 кДа. Затем сконцентрируйте объем 5 мл при 3,000 x g в течение 30 мин, используя центробежное устройство марки B, 30 кДа, до 500-1,200 мкл.
      3. Для последовательной ультрафильтрации при 7,500 x g (UF-7,5k x g) измените скорость центрифугирования для центробежного устройства марки B с 3,000 x g до 7,500 x g, чтобы получить меньшие конечные объемы, в соответствии с рекомендациями производителя, и сохраняйте скорость центрифугирования центробежного устройства марки A прежней.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Испытания проводились с образцами, собранными 30сентября.
    4. Для SMF-функции выполните действия, описанные ниже.
    5. Отсортируйте пробы сточных вод (по 500 мл каждая) для непосредственного концентрирования, используя протоколSMF 16,18, без предварительной фильтрации с помощью марли и мембранных дисковых фильтров с низким содержанием белка, как описано ниже.
    6. Растворите 0,5 г сухого обезжиренного молока в 50 мл синтетической морской воды для получения 1% (мас./об.) раствора обезжиренного молока и осторожно отрегулируйте рН раствора до 3,5, используя 1 N HCl.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подкисление приводит к тому, что вирусы агрегируются и выпадают в осадок из воды из-за изменения их изоэлектрической точки16 и улучшают растворимость сухого молока28.
    7. Добавьте 5 мл раствора обезжиренного молока к 500 мл проб сырых сточных вод, чтобы получить конечную концентрацию обезжиренного молока 0,01% (мас. / об.).
    8. Перемешивайте образцы в течение 8 ч на средней скорости и дайте образовавшимся хлопьям отстояться еще 8 ч при комнатной температуре.
    9. Удалите надосадочную жидкость осторожно с помощью серологических пипеток, не повреждая осевшие хлопья. Конечный объем объемом 50 мл, содержащий хлопья, переносят в центрифужные пробирки и центрифугу при 8000 x g в течение 30 мин при 8 °C.
    10. Аккуратно утилизируйте гранулы стерилизованным шпателем и ресуспендируйте оставшиеся гранулы в пробирках в 250 мкл 0,2 М натрий-фосфатного буфера (pH 7,5) после удаления надосадочной жидкости. Переложите очищенные и ресуспендированные гранулы в те же мини-центрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
  3. Выполните экстракцию вирусной РНК из вирусных концентратов образцов сточных вод и анализы эффективности восстановления с использованием набора для экстракции РНК с соотношением фенол:хлороформ:изоамиловый спирт и β-меркаптоэтанол 25:24:1 в соответствии с инструкциями производителя для повышения эффективности экстракции. Наконец, разбавьте РНК в 50 мкл элюирующего буфера.
  4. Количественный анализ полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-кПЦР)
    1. Количественное определение бронированной РНК с использованием десятикратных разведений (7,8 x 10,от 4 до 7,8 копий генов) синтетической одноцепочечной ДНК или конструкции gBlock. В таблице 2 приведены праймеры и наборы зондов, которые обнаруживают и количественно определяют бронированную РНК.
    2. Проектируйте наборы праймеров и зондов с помощью инструмента29 проектирования праймеров и нацеливайтесь на область 95.н. (конструкция gBlock) в геноме бронированной РНК.
    3. Получение калибровочных кривых для каждого запуска ОТ-кПЦР. Включайте отрицательные элементы управления в каждый запуск qPCR. Выполняйте стандарты, примеры и элементы управления, не являющиеся шаблонами, в трех экземплярах.
    4. Приготовьте каждую смесь ОТ-кПЦР объемом 10 мкл в следующем порядке: 2,5 мкл 4-кратной основной смеси, 400 нМ каждого праймера, 200 нМ зонда и 2,5 мкл шаблона, а также сверхчистая дистиллированная вода, не содержащая ДНКазы/РНК.
    5. Выполняйте реакции термоциклирования при 50 ° C в течение 5 мин, а затем 45 циклов при 95 ° C в течение 10 с и 60 ° C в течение 30 с на системе ПЦР в реальном времени. Если КТ была <40, считайте, что образец бронированной РНК положительный.
    6. Проведите тесты кПЦР и ОТ-кПЦР с использованием бычьего сывороточного альбумина с образцами неочищенных сточных вод для оценки возможности ингибиторов или загрязняющих веществ, таких как гуминовые кислоты24. Существенных различий между образцами с ферментом и без него не наблюдалось.
  5. Рассчитайте концентрации по стандартной кривой. Рассчитайте процент эффективности извлечения, разделив извлеченную концентрацию на пиковую концентрацию.
  6. Преобразуйте количество копий генов, используя функцию log10 для анализа. Запустите общую линейную модель с помощью инструмента статистического анализа на данных qPCR. Примените тест Тьюки, чтобы обнаружить различия между методами и методами лечения. Примите p-значение 0,05 в качестве минимального уровня значимости для теста.

2. Фильтрация и концентрация ДНК- и РНК-вирусов для водной эпидемиологии

  1. Для сбора поверхностных вод окружающей среды соберите 10 л проб поверхностных вод окружающей среды и используйте 10 л проб деионизированной воды для фонового контроля. Храните все образцы в помещении при температуре 4 °C до обработки в течение 24 часов после отбора проб.
  2. Выполните концентрацию вирусов из образцов окружающей среды с помощью SMF, выполнив действия, описанные ниже.
    1. Выполняйте капсульную и вакуумную фильтрацию с использованием высокопроизводительных капсул для отбора проб подземных вод и мембранных дисковых фильтров размером 0,45 мкм, 0,2 мкм и 0,1 мкм, чтобы свести к минимуму шум во время метагеномного секвенирования, от более крупных фракций, таких как микроэукариоты и бактерии, до более мелких, таких как вирусы.
    2. Приготовьте 1%-ный раствор предварительно флокулированного обезжиренного молока по весу в 1,32 л синтетической морской воды с 13,2 г сухого обезжиренного молока. Отрегулируйте рН этой суспензии до 3,5, используя 1 Н HCl.
  3. Отрегулируйте рН проб поверхностных вод окружающей среды до 3,5, используя 1 Н HCl.
  4. Перенесите 100 мл предварительно флокулированного подкисленного раствора обезжиренного молока в 10 л подкисленного (рН 3,5) пробы воды из окружающей среды (конечная концентрация обезжиренного молока 0,01% [мас./об.]).
  5. Используя магнитную мешалку и магнитную мешалку, перемешивайте образцы в течение 8 часов при комнатной температуре и дайте хлопьям осаждаться под действием силы тяжести в течение дополнительных 8 часов. Не беспокоя хлопья, аккуратно удалите надосадочную жидкость с помощью вакуумного насоса.
  6. Распределите и уравновесьте оставшиеся хлопья в соответствии с весом в центрифужных пробирках объемом 50 мл и открутите их при 8000 x g в течение 30 мин при 4 °C.
  7. Выбросьте надосадочную жидкость и растворите полученную гранулу (которая теоретически содержит интересующие вирусы) в 200 мкл 0,2 М фосфатного буфера натрия.
  8. Обработайте растворенную гранулу ДНКазой I и РНКазой А, следуя инструкциям производителя, чтобы удалить присутствующие свободные ДНК и РНК, которые могут быть осаждены из-за набора, используемого для экстракции нуклеиновых кислот. Инактивируйте ДНКазу I и РНКазу А, следуя инструкциям производителя.
  9. Извлеките общее количество нуклеиновых кислот из растворенной гранулы с помощью набора для экстракции ДНК / РНК в соответствии с инструкциями производителя.
  10. Количественно определите общее количество извлеченной ДНК и РНК из образцов сточных вод с помощью флуорометра. Образцы с концентрацией >1 нг/мкл считаются оптимальными для количественного определения и секвенирования ДНК.
  11. Выполните анализ кПЦР для нацеливания на интересующие кишечные вирусы и высокопроизводительное секвенирование для определения структуры вирусного сообщества.

3. Прямые осадки и концентрация микробных фракций для водной эпидемиологии

  1. Соберите 2 л проб воды из защищенных и пострадавших водных путей. Если образец содержит значительное количество мусора, используйте марлю для их удаления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется собирать биологический дубликат на образец.
  2. Приготовьте 1% (мас./об.) раствор обезжиренного молока, растворив 4,4 г сухого обезжиренного молока в 440 мл синтетической морской воды. Отрегулируйте рН этой суспензии до 3,5 с 1 Н HCl.
  3. Отрегулируйте рН проб пресной воды до 3,5, используя 1 N HCl.
  4. Добавьте 20 мл раствора обезжиренного молока к предварительно скорректированным рН 2-литровым образцам пресной воды (конечная концентрация обезжиренного молока 0,01% [мас./об.]). Перемешивайте образцы при комнатной температуре в течение 8 часов.
  5. Дайте хлопьям осаждаться под действием силы тяжести еще 8 часов. Аккуратно удалите надосадочную жидкость с помощью перистальтического насоса. Перенесите осажденные хлопья в центрифужную пробирку объемом 50 мл и открутите их при 8000 x g в течение 30 минут.
  6. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы с 200 мкл 0,2 М буфера фосфата натрия. Храните образцы при температуре -20 °C или приступайте к отбору ~ 0,5 г хлопьев для экстракции микробной ДНК с помощью выбранного набора для выделения нуклеиновых кислот, следуя инструкциям производителя.
  7. Определите концентрацию и чистоту нуклеиновых кислот ДНК с помощью высокочувствительного флуорометра. Образцы с концентрацией >1 нг/мкл должны быть оптимальными для количественного определения и секвенирования ДНК.

Результаты

Оценка методов концентрации вирусной РНК
Все шесть образцов, обработанных UF-3k x g, были положительными и привели к восстановлению 13,38% ± 8,14% (рис. 1). Только один образец был положительным, когда образцы были обработаны UF-7,5k x g. Все образцы, обработанные с ...

Обсуждение

Одним из важнейших этапов этого исследования является удаление твердых частиц путем применения этапа предварительной фильтрации с мембранными фильтрами 0,2 мкм и 0,45 мкм. Учитывая разделение вирусов на твердые частицы, особенно оболочечные вирусы, предварительная фильтрация может при?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этой статье.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом NSERC Alliance Covid-19 (награда No 431401363, 2020-2021 гг., доктора Юань и Уягуари-Диас). MUD благодарит Программу университетских исследовательских грантов (награда No 325201). И JF, и JZA поддерживаются программой обучения выпускников Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY и JF получили стипендии в рамках программы Mitacs Accelerate. MUD и его сотрудники лаборатории (KY, JF, JZA) поддерживаются NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) и грантом Research Manitoba New Investigator Operating (No 5385). Особая благодарность городу Виннипег, Манитоба. Это исследование было проведено в Университете Манитобы. Мы хотели бы признать, что кампусы Университета Манитобы расположены на исконных землях народов анишинабег, кри, оджи-кри, дакота и дене, а также на родине нации метисов.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5Alfa AesarJ62041APFisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filtersVWR66234Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filtersVWR60043Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master MixThermo Fisher Scientific4444432Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing ControlAsuragen49650Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDaPall OD030C65Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDaPallMCP010C46Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml) Nalgene3119-0050PKThermo Fisher Scientific
DNAse IInvitrogen18047019Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2Invitrogen12027Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µmPall12179Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solutionThermo Fisher ScientificAC124210025Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation KitApplied biosystemsA42358Thermo Fisher Scientific
Nuclease free waterPromegaP1197Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pumpMasterflex, Cole-Parmer instrument7553-20Thermo Fisher Scientific
pH meter Denver instrumentRK-59503-25Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1Invitrogen15593031Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe setsIDTIntegrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kitQiagenQiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR SystemThermo Fisher ScientificA34322Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kitInvitrogenQ33231Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFiInvitrogenQ33238Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kitInvitrogenQ32855Thermo Fisher Scientific
RNAse AInvitrogenEN0531Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome KitQiagen26000-50Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powderDifco (BD Life Sciences)DF0032173Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate bufferAlfa AesarAlfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawaterVWR RC8363-1RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlockIDTIntegrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiatedPall4621Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiatedPall4622Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanolGibco21985023Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

Ссылки

  1. Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
  2. Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
  3. Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
  4. Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
  5. Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
  6. Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
  7. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  8. Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
  9. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
  10. Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
  11. Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
  12. Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
  13. Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
  14. Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
  15. Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
  16. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  17. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
  18. Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
  20. Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
  21. Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
  22. Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
  23. Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
  24. Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
  25. Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
  26. Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
  27. Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
  28. Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), 3526-3537 (2018).
  29. . Geneious Available from: https://www.geneious.com (2021)
  30. Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
  31. Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
  32. Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
  33. Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены