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Neste Artigo

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Resumo

A concentração de vírus a partir de amostras ambientais de água e efluentes é uma tarefa desafiadora, realizada principalmente para a identificação e quantificação de vírus. Embora vários métodos de concentração viral tenham sido desenvolvidos e testados, demonstramos aqui a eficácia da ultrafiltração e floculação de leite desnatado para vírus de RNA com diferentes tipos de amostras.

Resumo

A epidemiologia baseada em água e esgoto tem emergido como métodos alternativos para monitorar e prever o curso de surtos em comunidades. A recuperação de frações microbianas, incluindo vírus, bactérias e microeucariotos de amostras de águas residuárias e ambientais é uma das etapas desafiadoras nessas abordagens. Neste estudo, focamos na eficiência de recuperação dos métodos de ultrafiltração sequencial e floculação de leite desnatado (FMS) usando RNA blindado como vírus teste, que também é usado como controle por alguns outros estudos. A pré-filtração com filtros de disco de membrana de 0,45 μm e 0,2 μm foi aplicada para eliminar partículas sólidas antes da ultrafiltração para evitar o entupimento dos dispositivos de ultrafiltração. As amostras-teste, processadas pelo método de ultrafiltração sequencial, foram centrifugadas em duas velocidades diferentes. Uma maior velocidade resultou em menores taxas de recuperação e positividade do RNA blindado. Por outro lado, a FME resultou em taxas de recuperação e positividade relativamente consistentes do RNA blindado. Testes adicionais realizados com amostras de água ambientais demonstraram a utilidade da FME para concentrar outras frações microbianas. A partição de vírus em partículas sólidas pode ter um impacto nas taxas gerais de recuperação, considerando a etapa de pré-filtração aplicada antes da ultrafiltração de amostras de águas residuais. A FME com pré-filtração apresentou melhor desempenho quando aplicada em amostras de água ambientais devido às menores concentrações de sólidos nas amostras e, portanto, menores taxas de partição para sólidos. No presente estudo, a ideia de usar um método de ultrafiltração sequencial surgiu da necessidade de diminuir o volume final dos concentrados virais durante a pandemia de COVID-19, quando o fornecimento dos dispositivos de ultrafiltração comumente usados era limitado, e havia uma necessidade para o desenvolvimento de métodos alternativos de concentração viral.

Introdução

A determinação da concentração efetiva de microrganismos em amostras de águas superficiais e residuárias para análise de comunidades microbianas e estudos epidemiológicos é uma das etapas importantes para monitorar e prever o curso de surtos em comunidades 1,2. A pandemia de COVID-19, desdobrou a importância de melhorar os métodos de concentração. A COVID-19 surgiu no final de 2019 e, em março de 2023, ainda representa uma ameaça à saúde humana, à vida social e à economia. Estratégias eficazes de vigilância e controle para aliviar os impactos dos surtos de COVID-19 nas comunidades tornaram-se um importante tópico de pesquisa, à medida que novas ondas e variantes da COVID-19 têm surgido, além da rápida transmissão e disseminação do vírus, bem como casos assintomáticos não notificados e não diagnosticados 3,4,5. O uso da epidemiologia baseada em águas residuais para COVID-19 por organizações da sociedade civil, agências governamentais e serviços públicos ou privados tem sido útil para fornecer informações rápidas relacionadas a surtos e mitigar os impactos de surtos de COVID-19 6,7,8,9. No entanto, a concentração de SARS-CoV-2, um vírus de RNA envelopado, em amostras de águas residuais ainda apresenta desafios10. Por exemplo, um desses desafios é a partição do SARS-CoV-2 em sólidos de águas residuais, o que pode impactar a recuperação quando os sólidos são eliminados durante a concentração11. Se este for o caso, o foco da quantificação/avaliação deve ser nas fases sólida e aquosa das amostras de água ambiental, e não apenas na fase aquosa. Além disso, a escolha do método de concentração pode ser modificada com base em ensaios e análises a jusante. A concentração de partículas virais e patógenos a partir de amostras ambientais tornou-se um tópico de pesquisa urgente com desenvolvimentos nos campos de sequenciamento e microbioma.

Vários métodos de concentração de vírus têm sido aplicados no campo da concentração de vírus a partir de amostras ambientais de água e efluentes. Alguns métodos comumente utilizados são filtração, floculação de leite desnatado (FMS), adsorção/eluição e precipitação de polietilenoglicol12-17. Dentre eles, o SMF tem sido considerado um método barato e eficaz, testado com sucesso e aplicado na recuperação de vírus, incluindo o SARS-CoV-2, de águas residuárias e superficiais12,15,16,18. O procedimento SMF é uma abordagem relativamente nova que tem ganhado crescente reconhecimento entre muitos estudos ambientais como uma metodologia apropriada para recuperar simultaneamente uma ampla gama de microrganismos, como vírus, bactérias e protozoários, de todos os tipos de amostras de água, a saber, lodo, esgoto bruto, efluentes e amostras de efluentes19. Quando comparada a outras metodologias conhecidas para recuperar vírus de amostras ambientais, como ultrafiltração e eluição glicina-alcalina, abordagem baseada em liofilização ou ultracentrifugação e eluição glicina-alcalina, a FMM tem sido relatada como o método mais eficiente, com maiores taxas de recuperação e detecção viral18,20. No presente estudo, usamos o RNA blindado como um vírus de teste para avaliar a eficiência da recuperação dos métodos de concentração do vírus, incluindo testes para avaliar a recuperação do SARS-CoV-221,22.

Aqui, testamos amostras de águas residuais e ambientais para demonstrar a utilidade da SMF e de um método de ultrafiltração sequencial para concentrar frações microbianas para reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), metagenômica baseada em sequência e sequenciamento de amplicon profundo. O SMF é um método relativamente mais barato e ideal para um volume maior de amostras em comparação com os métodos de ultrafiltração. A ideia de usar um método de ultrafiltração sequencial surgiu da necessidade de diminuir o volume final dos concentrados virais durante a pandemia de COVID-19, quando o fornecimento dos dispositivos de ultrafiltração comumente usados era limitado, e havia a necessidade do desenvolvimento de métodos alternativos de concentração viral.

Protocolo

1. Comparação entre ultrafiltração seriada e floculação de leite desnatado para concentrar vírus em amostras de águas residuárias

  1. Preparo da amostra
    1. Coletar 2 L de amostras de águas residuais compostas (influentes) compostas proporcionais ao fluxo de 24 horas. As amostras foram coletadas nas três principais estações de tratamento de águas residuais (ETEs) em Winnipeg, Canadá, durante o verão e o outono de 2020 (Tabela 1).
    2. Transportar as amostras para o laboratório em frascos à prova de luz em uma caixa de gelo e processá-las dentro de 24 h. Coletar dados de características físico-químicas e biológicas de águas residuárias.
  2. Ensaios de concentração viral
    NOTA: Um método de ultrafiltração sequencial e um método de floculação orgânica, a saber, floculação de leite desnatado (SMF), foram aplicados para avaliar a eficiência de recuperação total de cada método usando RNA blindado como um vírus de teste23. Outros pesquisadores também usaram o RNA blindado como um vírus de controle para avaliar a recuperação de métodos de concentração para vírus envelopados, como a família Coronaviridae22,24,25,26.
    1. Para a adição de RNA blindado, definir os volumes de teste de águas residuais para os métodos de ultrafiltração e SMF como 140 mL e 500 mL, respectivamente. Usando um pipetador, spike 5 x 104 cópias de RNA blindado em seis amostras de águas residuais frescas coletadas em uma data e seis amostras de águas residuais frescas em outra data, para cada método de ultrafiltração; além disso, seis amostras de águas residuais armazenadas (a 4 °C) coletadas em uma terceira data posterior e processadas dias depois para SMF.
      NOTA: Cada um dos seis conjuntos de amostras coletados em datas diferentes foi composto por duas amostras de cada uma das três ETEs. Em nosso estudo, o primeiro conjunto de amostras de águas residuais doces foi coletado em 8 de julho de 2020, o segundo em 30 de setembro de 2020 e as amostras de águas residuais a serem armazenadas para SMF em 14 de outubro de 2020.
    2. Agitar durante 30 minutos a 4 °C para inocular e homogeneizar o ARN blindado nas amostras utilizando um agitador magnético.
    3. Remova todas as partículas ou células maiores que 0,2 μm e realize a ultrafiltração.
      1. Filtrar as amostras de águas residuais fortificadas (120 mL de cada amostra fortificada de 140 mL) através de pano de queijo e filtros de disco de membrana de baixa proteína, 0,45 μm e 0,2 μm, 47 mm, respectivamente, para remover partículas grandes, sedimentos, eucariotos e bactérias27. Processe as amostras filtradas usando os métodos de ultrafiltração descritos abaixo.
        OBS: As amostras de águas residuárias coletadas nos dias 8 de julho e 30 desetembro foram utilizadas paramétodos de ultrafiltração com 3.000 x g e 7.500 x g, respectivamente.
      2. Para ultrafiltração sequencial a 3.000 x g (UF-3k x g), concentrar um total de 120 mL da amostra teste coletada na primeira data a 3.000 x g por 30 min, carregando 60 mL da amostra duas vezes a aproximadamente 5 mL usando um dispositivo centrífugo da marca A, 30 kDa. Em seguida, concentrar o volume de 5 mL a 3.000 x g por 30 min usando um dispositivo centrífugo da marca B, 30 kDa, para 500-1.200 μL.
      3. Para ultrafiltração sequencial a 7.500 x g (UF-7,5k x g), altere a velocidade de centrifugação do dispositivo centrífugo marca B de 3.000 x g para 7.500 x g para obter volumes finais menores, conforme recomendações do fabricante, e mantenha a mesma velocidade de centrifugação do dispositivo centrífugo marca A.
        OBS: Os testes foram realizados com as amostras coletadas nodia 30 de setembro.
    4. Para SMF, execute as etapas descritas abaixo.
    5. Colocar as amostras de efluentes (500 mL cada) para concentrar diretamente usando o protocolo SMF16,18, sem pré-filtração com pano de queijo e filtros de disco de membrana de baixa ligação à proteína, conforme descrito a seguir.
    6. Dissolver 0,5 g de leite em pó desnatado em 50 mL de água do mar sintética para obter uma solução de leite desnatado a 1% (p/v) e ajustar cuidadosamente o pH da solução para 3,5 usando 1 N HCl.
      OBS: A acidificação faz com que os vírus se agreguem e precipitem fora da água devido à mudança em seu ponto isoelétrico16 e melhora a solubilidade do leite em pó28.
    7. Adicionar 5 mL de solução de leite desnatado a 500 mL de amostras de água residuária crua para obter uma concentração final de leite desnatado de 0,01% (p/v).
    8. Agitar as amostras durante 8 h à velocidade média e deixar que os flocos formados se contentem por mais 8 h à temperatura ambiente.
    9. Remova cuidadosamente os sobrenadantes usando pipetas sorológicas sem perturbar os flocos assentados. Transferir um volume final de 50 mL contendo os flocos para tubos de centrífuga e centrifugar a 8.000 x g por 30 min a 8 °C.
    10. Raspar cuidadosamente os pellets usando uma espátula esterilizada e ressuspender os pellets restantes nos tubos em 250 μL de tampão fosfato de sódio 0,2 M (pH 7,5) após a remoção do sobrenadante. Transfira os pellets raspados e ressuspensos para os mesmos tubos de minicentrífuga de 1,5 mL.
  3. Realizar extração de RNA viral de concentrados virais de amostras de águas residuais e ensaios de eficiência de recuperação usando um kit de extração de RNA com uma proporção de 25:24:1 de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico e β-mercaptoetanol, de acordo com as instruções do fabricante, para melhorar a eficiência da extração. Finalmente, eluir o RNA em 50 μL de tampão de eluição.
  4. Análise quantitativa em tempo real da reação em cadeia da polimerase (RT-qPCR)
    1. Quantificar o RNA blindado usando diluições de dez vezes (7,8 x 10,4 a 7,8 cópias gênicas) de um DNA sintético de fita simples ou construção gBlock. Veja a Tabela 2 para os primers e conjuntos de sondas que detectam e quantificam o RNA Blindado.
    2. Projete conjuntos de primers e sondas usando a ferramenta de projeto de primer29 e tenha como alvo uma região de 95 pb (construção gBlock) dentro do genoma de RNA blindado.
    3. Obter curvas de calibração para cada execução de RT-qPCR. Inclua controles negativos em cada execução do qPCR. Execute padrões, amostras e controles que não sejam de modelo em triplicata.
    4. Preparar cada mistura de 10 μL RT-qPCR na seguinte ordem: 2,5 μL de mistura mestra 4x, 400 nM de cada primer, sonda de 200 nM e 2,5 μL de molde, bem como água destilada livre de DNAse/RNAse ultrapura.
    5. Realizar reações de ciclagem térmica a 50 °C por 5 min, seguidas por 45 ciclos de 95 °C por 10 s e 60 °C por 30 s em um sistema de PCR em tempo real. Se a TC foi <40, considere a amostra de RNA blindado positiva.
    6. Realizar testes de qPCR e RT-qPCR utilizando albumina de soro bovino com amostras brutas de esgoto para avaliar a possibilidade de inibidores ou contaminantes como os ácidoshúmicos 24. Não foram observadas diferenças significativas entre as amostras com e sem a enzima.
  5. Calcule as concentrações a partir da curva padrão. Calcule a porcentagem de eficiência de recuperação dividindo a concentração recuperada pela concentração cravada.
  6. Transforme números de cópias de genes usando a função log10 para análise. Execute um modelo linear geral usando uma ferramenta de análise estatística nos dados do qPCR. Aplicar o teste de Tukey para detectar diferenças entre os métodos e tratamentos. Considere-se um valor de p de 0,05 como um nível mínimo de significância para o teste.

2. Filtração e concentração de vírus de DNA e RNA para epidemiologia baseada em água

  1. Para a coleta de águas superficiais ambientais, colete 10 L de amostras de águas superficiais ambientais e use 10 L de amostras de água deionizada para controle de fundo. Conservar todas as amostras numa sala a 4 °C até ao processamento no prazo de 24 h após a colheita das amostras.
  2. Realizar concentração de vírus de amostras ambientais com SMF utilizando as etapas descritas abaixo.
    1. Realize a filtração de cápsulas e vácuo usando cápsulas de amostragem de água subterrânea de alta capacidade e filtros de disco de membrana de tamanhos de 0,45 μm, 0,2 μm e 0,1 μm para minimizar o ruído durante o sequenciamento metagenômico, de frações maiores, como micro-eucariotos e bactérias, a frações menores, como vírus.
    2. Preparar uma solução de leite desnatado pré-floculado a 1% em peso por volume em 1,32 L de água do mar sintética com 13,2 g de leite em pó desnatado. Ajustar o pH desta suspensão para 3,5 utilizando HCl 1 N.
  3. Ajustar o pH das amostras de águas superficiais ambientais para 3,5 usando HCl 1 N.
  4. Transferir 100 mL da solução de leite desnatado acidificado pré-floculado para 10 L de amostras de água ambiente acidificada (pH 3,5) (concentração final de leite desnatado de 0,01% [p/v]).
  5. Usando um agitador magnético e uma barra de agitação magnética, agite as amostras por 8 h à temperatura ambiente e deixe os flocos sedimentarem por gravidade por mais 8 h. Sem perturbar os flocos, remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma bomba de vácuo.
  6. Aliquot e balanceamento dos flocos restantes de acordo com o peso em tubos de centrífuga de 50 mL e girá-los para baixo a 8.000 x g por 30 min a 4 °C.
  7. Descarte o sobrenadante e dissolva a pelota resultante (que teoricamente contém vírus de interesse) em 200 μL de tampão fosfato de sódio 0,2 M.
  8. Tratar o pellet dissolvido com DNase I e RNase A, seguindo as instruções do fabricante, para eliminar o DNA livre e o RNA presentes que podem ser co-precipitados devido ao kit usado para extração de ácido nucleico. Inative o DNase I e RNase A seguindo as instruções do fabricante.
  9. Extraia ácidos nucleicos totais do pellet dissolvido usando um kit de extração de DNA/RNA, de acordo com as instruções do fabricante.
  10. Quantificar a quantidade total de DNA e RNA extraídos de amostras de efluentes usando um fluorômetro. Amostras com concentrações >1 ng/μL são consideradas ótimas para quantificação e sequenciamento de DNA.
  11. Realizar análise de qPCR para atingir vírus entéricos de interesse e sequenciamento de alto rendimento para identificar a estrutura da comunidade viral.

3. Precipitação direta e concentração de frações microbianas para epidemiologia baseada na água

  1. Coletar 2 L de amostras de água de cursos d'água protegidos e impactados. Se a amostra contiver uma quantidade considerável de detritos, use um pano de queijo para removê-los.
    NOTA: A coleta de uma duplicata biológica por amostra é altamente recomendada.
  2. Preparar uma solução de leite desnatado a 1% (p/v) dissolvendo 4,4 g de leite em pó desnatado em 440 ml de água do mar sintética. Ajustar o pH desta suspensão para 3,5 com HCl 1 N.
  3. Ajustar o pH das amostras de água doce para 3,5 utilizando HCl 1 N.
  4. Adicionar 20 mL de solução de leite desnatado às amostras de água doce de 2 L previamente ajustadas ao pH (concentração final de leite desnatado de 0,01% [p/v]). Agitar as amostras à temperatura ambiente durante 8 h.
  5. Deixe os flocos sedimentarem por gravidade por mais 8 h. Remova cuidadosamente os sobrenadantes com uma bomba peristáltica. Transfira os flocos sedimentados para um tubo centrífugo de 50 mL e gire-os para baixo a 8.000 x g por 30 min.
  6. Eliminar o sobrenadante e voltar a suspender os pellets com 200 μL de tampão fosfato de sódio 0,2 M. Conservar as amostras a -20 °C ou proceder à selecção de ~ 0,5 g do floco para extracção de ADN microbiano utilizando o kit de isolamento de ácido nucleico de eleição, seguindo as instruções do fabricante.
  7. Determinar a concentração e pureza do ácido nucleico do DNA com um fluorômetro de alta sensibilidade. Amostras com concentrações >1 ng/μL devem ser ideais para quantificação e sequenciamento de DNA.

Resultados

Avaliação de métodos de concentração de RNA viral
Todas as seis amostras processadas com UF-3k x g foram positivas e resultaram em 13,38% ± 8,14% de recuperação (Figura 1). Apenas uma amostra foi positiva quando as amostras foram processadas com UF-7,5k x g. Todas as amostras processadas com FML foram positivas e resultaram em recuperação de 15,27% ± 2,65% (Figura 1). As taxas médias de recuperação de UF-3K x g...

Discussão

Uma das etapas críticas neste estudo é a eliminação de partículas sólidas através da aplicação de uma etapa de pré-filtração com filtros de membrana de 0,2 μm e 0,45 μm. Considerando a partição de vírus em partículas sólidas, especialmente vírus envelopados, a pré-filtração pode causar uma perda significativa na recuperação viral30. Embora uma etapa de pré-filtragem para métodos de ultrafiltração seja quase sempre necessária para amostras ambientais e de águas residu...

Divulgações

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relações pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela NSERC Alliance Covid-19 Grant (Prêmio No. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan e Uyaguari-Díaz). A MUD agradece ao Programa de Bolsas de Pesquisa da Universidade (Prêmio nº 325201). Tanto a JF quanto a JZA são apoiadas pelo programa de treinamento de pós-graduação Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY e JF receberam bolsas do programa Mitacs Acelerar. MUD e seus membros do laboratório (KY, JF, JZA) são apoiados pelo NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) e pela bolsa Research Manitoba New Investigator Operating (nº 5385). Agradecimentos especiais à cidade de Winnipeg, Manitoba. Esta pesquisa foi conduzida na Universidade de Manitoba. Gostaríamos de reconhecer que os campi da Universidade de Manitoba estão localizados nas terras originais dos povos Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota e Dene e na terra natal da Nação Métis.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5Alfa AesarJ62041APFisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filtersVWR66234Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filtersVWR60043Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master MixThermo Fisher Scientific4444432Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing ControlAsuragen49650Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDaPall OD030C65Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDaPallMCP010C46Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml) Nalgene3119-0050PKThermo Fisher Scientific
DNAse IInvitrogen18047019Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2Invitrogen12027Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µmPall12179Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solutionThermo Fisher ScientificAC124210025Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation KitApplied biosystemsA42358Thermo Fisher Scientific
Nuclease free waterPromegaP1197Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pumpMasterflex, Cole-Parmer instrument7553-20Thermo Fisher Scientific
pH meter Denver instrumentRK-59503-25Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1Invitrogen15593031Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe setsIDTIntegrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kitQiagenQiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR SystemThermo Fisher ScientificA34322Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kitInvitrogenQ33231Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFiInvitrogenQ33238Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kitInvitrogenQ32855Thermo Fisher Scientific
RNAse AInvitrogenEN0531Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome KitQiagen26000-50Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powderDifco (BD Life Sciences)DF0032173Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate bufferAlfa AesarAlfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawaterVWR RC8363-1RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlockIDTIntegrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiatedPall4621Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiatedPall4622Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanolGibco21985023Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

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