スキムミルク凝集と限外ろ過を用いた環境水および廃水サンプルからのウイルス粒子の濃縮

要約

環境水および廃水サンプルからのウイルス濃度は困難な作業であり、主にウイルスの同定と定量のために実行されます。いくつかのウイルス濃縮法が開発およびテストされていますが、ここでは、異なるサンプルタイプのRNAウイルスに対する限外ろ過と脱脂粉乳凝集の有効性を示します。

要約

水と廃水に基づく疫学は、コミュニティでの発生の経過を監視および予測するための代替方法として浮上しています。廃水や環境水サンプルからウイルス、バクテリア、微小真核生物などの微生物画分を回収することは、これらのアプローチにおける困難なステップの1つです。本研究では、他の研究でも対照として使用されているArmorRNAを試験ウイルスとして使用した逐次限外ろ過および脱脂粉乳凝集(SMF)法の回収効率に着目しました。限外ろ過装置の目詰まりを防ぐために、限外ろ過の前に固体粒子を除去するために、0.45μmおよび0.2μmのメンブレンディスクフィルターによる事前ろ過が適用されました。逐次限外ろ過法で処理された試験サンプルを、2つの異なる速度で遠心分離した。速度を上げると、アーマードRNAの回復率と陽性率が低下しました。一方、SMFは、アーマードRNAの比較的一貫した回収率と陽性率をもたらしました。環境水サンプルを用いて実施された追加の試験は、他の微生物画分を濃縮するためのSMFの有用性を実証した。ウイルスの固体粒子への分割は、廃水サンプルの限外ろ過の前に適用される事前ろ過ステップを考慮すると、全体的な回収率に影響を与える可能性があります。プレフィルトレーション付きSMFは、サンプル中の固形分濃度が低く、固形物への分配率が低いため、環境水サンプルに適用すると優れた性能を発揮しました。本研究では、逐次限外ろ過法を使用するというアイデアは、一般的に使用される限外ろ過装置の供給が限られていたCOVID-19パンデミック時にウイルス濃縮物の最終量を減らす必要性から生じ、代替のウイルス濃縮法の開発が必要でした。

概要

微生物群集分析および疫学研究のために、地表および廃水サンプル中の微生物の有効濃度を決定することは、群集における発生の経過を監視および予測するための重要なステップの1つです^1,2。COVID-19のパンデミックは、濃縮方法を改善することの重要性を明らかにしました。COVID-19は2019年後半に出現し、2023年3月の時点で、依然として人間の健康、社会生活、および経済に脅威を与えています。ウイルスの急速な感染と拡散に加えて、COVID-19の新しい波と亜種、および報告されていない無症候性の症例が出現しているため、コミュニティでのCOVID-19の発生の影響を軽減するための効果的な監視および管理戦略が重要な研究トピックになっています^3,4,5.市民社会組織、政府機関、および公的または民間の公益事業によるCOVID-19の廃水ベースの疫学の使用は、迅速な発生関連情報を提供し、COVID-19の発生の影響を軽減するのに役立ちました6,7,8,9。しかし、廃水サンプル中のエンベロープRNAウイルスであるSARS-CoV-2の濃度は、依然として課題¹⁰を提起しています。たとえば、これらの課題の1つは、廃水固形物中のSARS-CoV-2の分配であり、濃縮¹¹中に固形物が除去されると、回収に影響を与える可能性があります。この場合、定量/評価の焦点は、水相のみではなく、環境水サンプルの固相と水相の両方にある必要があります。さらに、濃縮方法の選択は、下流の試験および分析に基づいて変更することができる。環境サンプルからのウイルス粒子と病原体の濃度は、シーケンシングとマイクロバイオーム分野の発展に伴い、緊急の研究トピックになっています。

環境水や廃水サンプルからのウイルス濃縮の分野では、さまざまなウイルス濃縮法が適用されています。一般的に使用される方法には、ろ過、スキムミルク凝集(SMF)、吸着/溶出、およびポリエチレングリコール沈殿があります^12〜17。その中で、SMFは安価で効果的な方法と見なされており、テストに成功し、廃水や地表水からSARS-CoV-2などのウイルスを回収するために適用されています12,15,16,18。SMF法は比較的新しいアプローチであり、汚泥、生下水、廃水、排水サンプルなど、あらゆる種類の水サンプルからウイルス、細菌、原生動物などの幅広い微生物を同時に回収するための適切な方法論として、多くの環境研究で認識が高まっています¹⁹.限外ろ過やグリシンアルカリ溶出、凍結乾燥ベースのアプローチ、超遠心やグリシンアルカリ溶出など、環境サンプルからウイルスを回収する他の既知の方法論と比較すると、SMFはウイルスの回収率と検出率が高い最も効率的な方法として報告されています^18,20.本研究では、SARS-CoV-2回収を評価するための試験を含むウイルス濃縮法の回収効率を評価するために、ArmedRNAを試験ウイルスとして使用しました^21,22。

ここでは、廃水と環境水のサンプルをテストして、SMFの有用性と、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、シーケンスベースのメタゲノミクス、およびディープアンプリコンシーケンシングのために微生物画分を濃縮するためのシーケンシャル限外ろ過法を実証しました。SMFは比較的安価な方法であり、限外ろ過法と比較して大量のサンプルに最適です。シーケンシャル限外ろ過法を使用するというアイデアは、一般的に使用される限外ろ過装置の供給が制限されていたCOVID-19パンデミック時にウイルス濃縮物の最終量を減らす必要性から生じ、代替のウイルス濃縮法の開発が必要でした。

プロトコル

1.廃水サンプル中のウイルスを濃縮するための連続限外ろ過とスキムミルク凝集の比較

1. サンプル調製
   1. 2 Lの24時間流量比例複合生(流入)廃水サンプルを収集します。サンプルは、2020年の夏から秋に、カナダのウィニペグにある3つの主要な廃水処理プラント(WWTP)から収集されました(表1)。
   2. サンプルをアイスボックス内の遮光ボトルに入れて実験室に輸送し、24時間以内に処理します。廃水の物理化学的および生物学的特性データを収集します。
2. ウイルス濃度アッセイ
   注:シーケンシャル限外ろ過法と有機フロキュレーション法、すなわちスキムミルクフロキュレーション(SMF)を適用して、ArmedRNAをテストウイルスとして使用する各方法の全体的な回収効率を評価しました²³.他の研究者も、家族などのエンベロープウイルスの濃縮法の回復を評価するためのコントロールウイルスとしてArmedRNAを使用しています Coronaviridae^22,24,25,26.
   1. アーマードRNAを添加する場合は、限外ろ過法とSMF法の廃水試験量をそれぞれ140 mLと500 mLに設定します。ピペッターを使用して、限外ろ過方法ごとに、ある日に収集された6つの新鮮な廃水サンプルと別の日に収集された6つの新鮮な廃水サンプルに、5 x 10⁴ コピーの装甲RNAをスパイクします。さらに、スパイク6は、3番目の日付に収集された(4°Cで)廃水サンプルを保管し、SMFのために数日後に処理しました。
      注:異なる日付に収集された6つのサンプルセットのそれぞれは、3つのWWTPのそれぞれからの2つのサンプルで構成されていました。私たちの研究では、最初の新鮮な廃水サンプルのセットは2020年7月8日に収集され、2番目のセットは2020年9月30^日に収集され、廃水サンプルは2020年10月14日にSMFのために保管されました。
   2. 4°Cで30分間撹拌し、マグネチックスターラーを用いてサンプル中の装甲RNAを接種し、ホモジナイズします。
   3. 0.2 μmを超えるすべての粒子または細胞を除去し、限外ろ過を実行します。
      1. 添加廃水サンプル(各140 mL添加サンプルから120 mL)をチーズクロスと低タンパク質結合、それぞれ0.45 μmおよび0.2 μm、47 mmメンブレンディスクフィルターでろ過して、大きな粒子、堆積物、真核生物、および細菌を除去します²⁷。以下に説明する限外ろ過方法を使用して、ろ過されたサンプルを処理します。
         注:7月8^日と9月30日に収集された廃水^{サンプルは、}それぞれ3,000 x gと7,500 x gの限外ろ過法に使用されました。
      2. 3,000 x g(UF-3k x g)での連続限外ろ過の場合、ブランドA遠心装置30-kDaを使用して、60 mLのサンプルを約5 mLに2回ロードすることにより、最初の日に収集された合計120 mLのテストサンプルを3,000 x gで30分間濃縮します。次に、ブランドBの遠心装置である30 kDaを使用して、3,000 x gで30分間、5 mLの容量を500〜1,200 μLに濃縮します。
      3. 7,500 x g(UF-7.5k x g)での連続限外ろ過の場合、ブランドB遠心装置の遠心分離速度を3,000 x gから7,500 x gに変更して、メーカーの推奨に従って最終容量を小さくし、ブランドA遠心装置の遠心分離速度を同じに保ちます。
         注:テストは、9月30日に収集されたサンプルで実行^{されました。}
   4. SMF の場合は、以下に概説するステップを実行します。
   5. 以下に説明するように、チーズクロスおよび低タンパク質結合メンブレンディスクフィルターによる事前ろ過なしで、SMFプロトコル^16、18を使用して廃水サンプル(各500 mL)を直接濃縮するようにスパイクします。
   6. 0.5 gの脱脂粉乳を50 mLの合成海水に溶解して1%(w / v)の脱脂乳溶液を得、1 N HClを使用して溶液のpHを3.5に注意深く調整します。
      注:酸性化により、等電点¹⁶ の変化によりウイルスが凝集して水から沈殿し、粉乳²⁸の溶解度が向上します。
   7. 500 mLの生廃水サンプルに5 mLのスキムミルク溶液を加えて、0.01%(w / v)のスキムミルクの最終濃度を得ます。
   8. サンプルを中速で8時間撹拌し、形成されたフロックを室温でさらに8時間沈降させます。
   9. 血清学的ピペットを使用して、沈降したフロックを乱すことなく上清を注意深く除去します。フロックを含む最終容量50 mLを遠沈管に移し、8,000 x g で8°Cで30分間遠心分離します。
   10. 滅菌スパチュラを使用してペレットを注意深くスクラップし、上清を除去した後、残りのペレットを250 μLの0.2 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.5)にチューブに再懸濁します。掻き取り、再懸濁したペレットを同じ1.5 mLミニ遠心チューブに移します。
3. 廃水サンプルのウイルス濃縮物からのウイルスRNA抽出と回収効率アッセイは、製造元の指示に従って、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールとβ-メルカプトエタノールの比率が25:24:1のRNA抽出キットを使用して実行し、抽出効率を向上させます。最後に、50 μLの溶出バッファーでRNAを溶出します。
4. リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)解析
   1. 合成一本鎖DNAまたはgBlockコンストラクトの10倍希釈(7.8 x 10⁴ 〜7.8遺伝子コピー)を使用して装甲RNAを定量します。ArmedRNAを検出および定量するプライマーおよびプローブセットについては、 表2 を参照してください。
   2. プライマー設計ツール²⁹ を使用してプライマーおよびプローブセットを設計し、ArmedRNAゲノム内の95bp領域(gBlock構築物)を標的とする。
   3. 各RT-qPCR実行の検量線を取得します。各qPCRの実行にネガティブコントロールを含めます。標準、サンプル、およびテンプレート以外のコントロールを 3 重に実行します。
   4. 各10 μL RT-qPCR混合物を、2.5 μLの4xマスターミックス、400 nMの各プライマー、200 nMプローブ、2.5 μLのテンプレート、および超高純度DNAse/RNAseフリー蒸留水の順序で調製します。
   5. リアルタイムPCRシステムで50°Cで5分間の熱サイクル反応を行い、続いてリアルタイムPCRシステムで95°Cで10秒間、60°Cで30秒間の45サイクルを実行します。CTが<40の場合、サンプルの装甲RNA陽性を検討してください。
   6. ウシ血清アルブミンと生の下水サンプルを使用してqPCRおよびRT-qPCRテストを実施し、阻害剤またはフミン酸などの汚染物質の可能性を評価します²⁴。酵素を含むサンプルと含まないサンプル間で有意差は観察されませんでした。
5. 検量線から濃度を計算します。回収した濃度を添加濃度で割って回収効率のパーセンテージを計算します。
6. 解析にlog₁₀ 関数を使用して遺伝子コピー数を変換します。qPCRデータに対して統計解析ツールを使用して一般線形モデルを実行します。テューキーの検定を適用して、方法と治療法の違いを検出します。 p値0.05を検定の最小有意水準とします。

2. 水系疫学のためのDNAおよびRNAウイルスのろ過と濃縮

1. 環境地表水収集には、10 Lの環境地表水サンプルを収集し、10 Lの脱イオン水サンプルをバックグラウンドコントロールに使用します。サンプル収集後24時間以内に処理されるまで、すべてのサンプルを4°Cの部屋に保管してください。
2. SMFで環境サンプルからウイルスを濃縮するには、以下の手順を使用します。
   1. 0.45 μm、0.2 μm、0.1 μmサイズの大容量地下水サンプリングカプセルとメンブレンディスクフィルターを使用してカプセルろ過と真空ろ過を行い、微小真核生物や細菌などの大きな画分からウイルスなどの小さな画分まで、メタゲノムシーケンシング中のノイズを最小限に抑えます。
   2. 13.2 gの脱脂粉乳を含む1.32 Lの合成海水中の1体積重量の凝集前脱脂乳溶液を調製します。1 N HClを使用してこの懸濁液のpHを3.5に調整します。
3. 1 N HClを使用して、環境地表水サンプルのpHを3.5に調整します。
4. 事前に凝集した酸性化脱脂乳溶液100 mLを10 Lの酸性化(pH 3.5)環境水サンプルに移します(最終脱脂乳濃度0.01% [w / v])。
5. マグネチックスターラーとマグネチックスターバーを使用して、サンプルを室温で8時間攪拌し、フロックを重力でさらに8時間沈降させます。フロックを乱さずに、真空ポンプを使用して上澄み液を慎重に除去します。
6. 50 mL 遠沈管で重量に応じて残りのフロックを分注してバランスを取り、8,000 x g で 4 °C で 30 分間スピンダウンします。
7. 上清を捨て、得られたペレット(理論的には目的のウイルスを含む)を200μLの0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液に溶解します。
8. 溶解したペレットをDNase IおよびRNase Aで処理し、製造元の指示に従って、核酸抽出に使用されるキットのために共沈する可能性のある遊離DNAおよびRNAを除去します。製造元の指示に従って、DNase IおよびRNase Aを不活性化します。
9. 製造元の指示に従って、DNA/RNA抽出キットを使用して、溶解したペレットから全核酸を抽出します。
10. 蛍光光度計を使用して、流出サンプルから抽出されたDNAおよびRNAの総量を定量します。>1 ng/μLの濃度のサンプルは、DNAの定量とシーケンシングに最適と考えられています。
11. qPCR解析を実行して目的の腸内ウイルスを標的とし、ハイスループットシーケンシングを実行してウイルス群集構造を特定します。

3. 水系疫学のための微生物画分の直接沈降と濃縮

1. 保護され影響を受けた水路から2Lの水サンプルを収集します。サンプルにかなりの量の破片が含まれている場合は、チーズクロスを使用してそれらを取り除きます。
   注:サンプルごとに生物学的複製を収集することを強くお勧めします。
2. 4.4 gの脱脂粉乳を440 mLの合成海水に溶解して、1%(w / v)の脱脂乳溶液を調製します。この懸濁液のpHを1 N HClで3.5に調整します。
3. 1 N HClを使用して淡水サンプルのpHを3.5に調整します。
4. 以前にpH調整した2 L淡水サンプル(最終スキムミルク濃度0.01%[w / v])に20 mLのスキムミルク溶液を追加します。サンプルを室温で8時間撹拌します。
5. フロックをさらに8時間重力で沈降させます。蠕動ポンプで上清を慎重に取り除きます。沈降したフロックを50 mLの遠沈管に移し、8,000 x g で30分間スピンダウンします。
6. 上清を廃棄し、ペレットを200 μLの0.2 Mリン酸ナトリウムバッファーで再懸濁します。サンプルを-20°Cで保存するか、製造元の指示に従って、選択した核酸分離キットを使用して、微生物DNA抽出用のフロック~0.5 gを選択します。
7. 高感度蛍光光度計でDNA核酸濃度と純度を測定します。濃度>1 ng/μLのサンプルは、DNAの定量とシーケンシングに最適です。

結果

ウイルスRNA濃縮法の評価
UF-3k x gで処理された6つのサンプルはすべて陽性であり、13.38%±8.14%の回復をもたらしました(図1)。サンプルをUF-7.5k x gで処理した場合、1つのサンプルのみが陽性でした。SMFで処理されたすべてのサンプルは陽性であり、15.27%±2.65%の回復をもたらしました(図1)。UF-3K x gおよびSMFの平均回収?...

ディスカッション

この研究の重要なステップの1つは、0.2 μmおよび0.45 μmのメンブレンフィルターを使用した事前ろ過ステップを適用することによる固体粒子の除去です。ウイルスの固体粒子、特にエンベロープウイルスへの分割を考慮すると、事前ろ過はウイルス回収の著しい損失を引き起こす可能性があります³⁰。限外ろ過装置の目詰まりを防ぐために、環境サンプルや廃水サンプルには?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5	Alfa Aesar	J62041AP	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	66234	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	60043	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444432	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control	Asuragen	49650	Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	OD030C65	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	MCP010C46	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)	Nalgene	3119-0050PK	Thermo Fisher Scientific
DNAse I	Invitrogen	18047019	Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2	Invitrogen	12027	Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm	Pall	12179	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution	Thermo Fisher Scientific	AC124210025	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit	Applied biosystems	A42358	Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water	Promega	P1197	Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump	Masterflex, Cole-Parmer instrument	7553-20	Thermo Fisher Scientific
pH meter	Denver instrument	RK-59503-25	Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1	Invitrogen	15593031	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit	Qiagen		Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	A34322	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q33231	Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi	Invitrogen	Q33238	Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q32855	Thermo Fisher Scientific
RNAse A	Invitrogen	EN0531	Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit	Qiagen	26000-50	Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder	Difco (BD Life Sciences)	DF0032173	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer	Alfa Aesar		Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater	VWR	RC8363-1	RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4621	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4622	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA