Concentración de partículas de virus de muestras ambientales de agua y aguas residuales mediante floculación y ultrafiltración de leche desnatada

Resumen

La concentración de virus a partir de muestras ambientales de agua y aguas residuales es una tarea desafiante, llevada a cabo principalmente para la identificación y cuantificación de virus. Si bien se han desarrollado y probado varios métodos de concentración de virus, demostramos aquí la efectividad de la ultrafiltración y la floculación de leche desnatada para virus de ARN con diferentes tipos de muestras.

Resumen

La epidemiología basada en el agua y las aguas residuales ha surgido como métodos alternativos para monitorear y predecir el curso de los brotes en las comunidades. La recuperación de fracciones microbianas, incluidos virus, bacterias y microeucariotas de aguas residuales y muestras de agua ambiental es uno de los pasos desafiantes en estos enfoques. En este estudio, nos centramos en la eficiencia de recuperación de los métodos secuenciales de ultrafiltración y floculación de leche desnatada (SMF) utilizando ARN blindado como virus de prueba, que también se utiliza como control en algunos otros estudios. Se aplicó prefiltración con filtros de disco de membrana de 0,45 μm y 0,2 μm para eliminar las partículas sólidas antes de la ultrafiltración para evitar la obstrucción de los dispositivos de ultrafiltración. Las muestras de prueba, procesadas con el método de ultrafiltración secuencial, se centrifugaron a dos velocidades diferentes. Una mayor velocidad resultó en menores tasas de recuperación y positividad de ARN blindado. Por otro lado, SMF resultó en tasas de recuperación y positividad relativamente consistentes de ARN blindado. Pruebas adicionales realizadas con muestras de agua ambiental demostraron la utilidad de SMF para concentrar otras fracciones microbianas. La partición de los virus en partículas sólidas podría tener un impacto en las tasas generales de recuperación, teniendo en cuenta el paso de prefiltración aplicado antes de la ultrafiltración de muestras de aguas residuales. SMF con prefiltración funcionó mejor cuando se aplicó a muestras de agua ambiental debido a las concentraciones de sólidos más bajas en las muestras y, por lo tanto, a las tasas de partición más bajas a sólidos. En el presente estudio, la idea de utilizar un método de ultrafiltración secuencial surgió de la necesidad de disminuir el volumen final de los concentrados virales durante la pandemia de COVID-19, cuando el suministro de los dispositivos de ultrafiltración comúnmente utilizados era limitado, y existía la necesidad del desarrollo de métodos alternativos de concentración viral.

Introducción

La determinación de la concentración efectiva de microorganismos en muestras de superficie y aguas residuales para análisis de comunidades microbianas y estudios epidemiológicos, es uno de los pasos importantes para monitorear y predecir el curso de los brotes en las comunidades ^1,2. La pandemia de COVID-19, puso de manifiesto la importancia de mejorar los métodos de concentración. COVID-19 surgió a fines de 2019 y, a partir de marzo de 2023, todavía representa una amenaza para la salud humana, la vida social y la economía. Las estrategias efectivas de vigilancia y control para aliviar los impactos de los brot....

Protocolo

1. Comparación de la ultrafiltración en serie y la floculación de la leche desnatada para concentrar virus en muestras de aguas residuales

1. Preparación de muestras
   1. Recolectar 2 L de muestras compuestas de aguas residuales crudas (afluentes) proporcionales al caudal de 24 h. Se recogieron muestras de las tres principales plantas de tratamiento de aguas residuales (EDAR) en Winnipeg, Canadá, durante el verano y el otoño de 2020 (Tabla 1).
   2. Transportar las muestras al laboratorio en botellas a prueba de luz en una nevera y procesarlas en 24 h. Recopilar datos de características físico-químicas y biológicas de la....

Resultados

Evaluación de métodos de concentración de ARN viral
Las seis muestras procesadas con UF-3k x g fueron positivas y resultaron en una recuperación del 13,38% ± 8,14% (Figura 1). Solo una muestra fue positiva cuando las muestras se procesaron con UF-7.5k x g. Todas las muestras procesadas con SMF fueron positivas y resultaron en una recuperación del 15,27% ± del 2,65% (Figura 1). Las tasas promedio de recuperación de UF.......

Discusión

Uno de los pasos críticos en este estudio es la eliminación de partículas sólidas mediante la aplicación de un paso de prefiltración con filtros de membrana de 0,2 μm y 0,45 μm. Considerando la partición de los virus en partículas sólidas, especialmente los virus envueltos, la prefiltración puede causar una pérdida significativa en la recuperación viral³⁰. Si bien un paso de prefiltración para los métodos de ultrafiltración casi siempre es necesario para las muestras ambientales y.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5	Alfa Aesar	J62041AP	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	66234	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	60043	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444432	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control	Asuragen	49650	Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	OD030C65	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	MCP010C46	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)	Nalgene	3119-0050PK	Thermo Fisher Scientific
DNAse I	Invitrogen	18047019	Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2	Invitrogen	12027	Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm	Pall	12179	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution	Thermo Fisher Scientific	AC124210025	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit	Applied biosystems	A42358	Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water	Promega	P1197	Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump	Masterflex, Cole-Parmer instrument	7553-20	Thermo Fisher Scientific
pH meter	Denver instrument	RK-59503-25	Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1	Invitrogen	15593031	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit	Qiagen		Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	A34322	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q33231	Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi	Invitrogen	Q33238	Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q32855	Thermo Fisher Scientific
RNAse A	Invitrogen	EN0531	Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit	Qiagen	26000-50	Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder	Difco (BD Life Sciences)	DF0032173	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer	Alfa Aesar		Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater	VWR	RC8363-1	RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4621	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4622	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA