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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La concentración de virus a partir de muestras ambientales de agua y aguas residuales es una tarea desafiante, llevada a cabo principalmente para la identificación y cuantificación de virus. Si bien se han desarrollado y probado varios métodos de concentración de virus, demostramos aquí la efectividad de la ultrafiltración y la floculación de leche desnatada para virus de ARN con diferentes tipos de muestras.

Resumen

La epidemiología basada en el agua y las aguas residuales ha surgido como métodos alternativos para monitorear y predecir el curso de los brotes en las comunidades. La recuperación de fracciones microbianas, incluidos virus, bacterias y microeucariotas de aguas residuales y muestras de agua ambiental es uno de los pasos desafiantes en estos enfoques. En este estudio, nos centramos en la eficiencia de recuperación de los métodos secuenciales de ultrafiltración y floculación de leche desnatada (SMF) utilizando ARN blindado como virus de prueba, que también se utiliza como control en algunos otros estudios. Se aplicó prefiltración con filtros de disco de membrana de 0,45 μm y 0,2 μm para eliminar las partículas sólidas antes de la ultrafiltración para evitar la obstrucción de los dispositivos de ultrafiltración. Las muestras de prueba, procesadas con el método de ultrafiltración secuencial, se centrifugaron a dos velocidades diferentes. Una mayor velocidad resultó en menores tasas de recuperación y positividad de ARN blindado. Por otro lado, SMF resultó en tasas de recuperación y positividad relativamente consistentes de ARN blindado. Pruebas adicionales realizadas con muestras de agua ambiental demostraron la utilidad de SMF para concentrar otras fracciones microbianas. La partición de los virus en partículas sólidas podría tener un impacto en las tasas generales de recuperación, teniendo en cuenta el paso de prefiltración aplicado antes de la ultrafiltración de muestras de aguas residuales. SMF con prefiltración funcionó mejor cuando se aplicó a muestras de agua ambiental debido a las concentraciones de sólidos más bajas en las muestras y, por lo tanto, a las tasas de partición más bajas a sólidos. En el presente estudio, la idea de utilizar un método de ultrafiltración secuencial surgió de la necesidad de disminuir el volumen final de los concentrados virales durante la pandemia de COVID-19, cuando el suministro de los dispositivos de ultrafiltración comúnmente utilizados era limitado, y existía la necesidad del desarrollo de métodos alternativos de concentración viral.

Introducción

La determinación de la concentración efectiva de microorganismos en muestras de superficie y aguas residuales para análisis de comunidades microbianas y estudios epidemiológicos, es uno de los pasos importantes para monitorear y predecir el curso de los brotes en las comunidades 1,2. La pandemia de COVID-19, puso de manifiesto la importancia de mejorar los métodos de concentración. COVID-19 surgió a fines de 2019 y, a partir de marzo de 2023, todavía representa una amenaza para la salud humana, la vida social y la economía. Las estrategias efectivas de vigilancia y control para aliviar los impactos de los brotes de COVID-19 en las comunidades se han convertido en un importante tema de investigación, ya que han surgido nuevas olas y variantes de COVID-19, además de la rápida transmisión y propagación del virus, así como casos asintomáticos no notificados y no diagnosticados 3,4,5. El uso de la epidemiología basada en las aguas residuales para COVID-19 por parte de organizaciones de la sociedad civil, agencias gubernamentales y servicios públicos o privados ha sido útil para proporcionar información rápida relacionada con el brote y mitigar los impactos de los brotes de COVID-19 6,7,8,9. Sin embargo, la concentración de SARS-CoV-2, un virus de ARN envuelto, en muestras de aguas residuales todavía plantea desafíos10. Por ejemplo, uno de estos desafíos es la partición del SARS-CoV-2 en los sólidos de aguas residuales, lo que puede afectar la recuperación cuando los sólidos se eliminan durante la concentración11. Si este es el caso, el enfoque de la cuantificación / evaluación debe estar en las fases sólida y acuosa de las muestras de agua ambiental, en lugar de la fase acuosa solamente. Además, la elección del método de concentración puede modificarse en función de ensayos y análisis posteriores. La concentración de partículas de virus y patógenos de muestras ambientales se ha convertido en un tema de investigación urgente con desarrollos en los campos de secuenciación y microbioma.

Se han aplicado varios métodos de concentración de virus en el campo de la concentración de virus a partir de muestras ambientales de agua y aguas residuales. Algunos métodos comúnmente utilizados son la filtración, la floculación de leche desnatada (SMF), la adsorción/elución y la precipitación de polietilenglicol12-17. Entre ellos, SMF ha sido considerado un método barato y eficaz, probado con éxito y aplicado para recuperar virus, incluido el SARS-CoV-2, de aguas residuales y superficiales12,15,16,18. El procedimiento SMF es un enfoque relativamente nuevo que ha ganado un mayor reconocimiento entre muchos estudios ambientales como una metodología apropiada para recuperar simultáneamente una amplia gama de microorganismos como virus, bacterias y protozoos de todo tipo de muestras de agua, a saber, lodos, aguas residuales sin tratar, aguas residuales y muestras de efluentes19. En comparación con otras metodologías conocidas para recuperar virus de muestras ambientales como la ultrafiltración y la elución glicina-alcalina, el enfoque basado en la liofilización o la ultracentrifugación y la elución glicina-alcalina, la SMF ha sido reportada como el método más eficiente con mayores tasas de recuperación y detección viral18,20. En el presente estudio, utilizamos ARN blindado como virus de prueba para evaluar la eficiencia de recuperación de los métodos de concentración del virus, incluidas las pruebas para evaluar la recuperación del SARS-CoV-221,22.

Aquí, probamos muestras de aguas residuales y agua ambiental para demostrar la utilidad de SMF y un método de ultrafiltración secuencial para concentrar fracciones microbianas para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), la metagenómica basada en secuencias y la secuenciación de amplicones profundos. SMF es un método relativamente más barato y óptimo para un mayor volumen de muestras en comparación con los métodos de ultrafiltración. La idea de utilizar un método de ultrafiltración secuencial surgió de la necesidad de disminuir el volumen final de los concentrados virales durante la pandemia de COVID-19, cuando el suministro de los dispositivos de ultrafiltración de uso común era limitado, y existía la necesidad de desarrollar métodos alternativos de concentración viral.

Protocolo

1. Comparación de la ultrafiltración en serie y la floculación de la leche desnatada para concentrar virus en muestras de aguas residuales

  1. Preparación de muestras
    1. Recolectar 2 L de muestras compuestas de aguas residuales crudas (afluentes) proporcionales al caudal de 24 h. Se recogieron muestras de las tres principales plantas de tratamiento de aguas residuales (EDAR) en Winnipeg, Canadá, durante el verano y el otoño de 2020 (Tabla 1).
    2. Transportar las muestras al laboratorio en botellas a prueba de luz en una nevera y procesarlas en 24 h. Recopilar datos de características físico-químicas y biológicas de las aguas residuales.
  2. Ensayos de concentración de virus
    NOTA: Se aplicaron un método de ultrafiltración secuencial y un método de floculación orgánica, a saber, floculación de leche desnatada (SMF), para evaluar la eficiencia de recuperación total de cada método utilizando ARN blindado como virus de prueba.23. Otros investigadores también han utilizado el ARN blindado como virus de control para evaluar la recuperación de métodos de concentración para virus envueltos, como la familia. Coronaviridae22,24,25,26.
    1. Para la adición de ARN blindado, establezca los volúmenes de prueba de aguas residuales para los métodos de ultrafiltración y SMF como 140 ml y 500 ml, respectivamente. Usando un pipetero, pinchar 5 x 104 copias de ARN blindado en seis muestras de aguas residuales frescas recolectadas en una fecha y seis muestras de aguas residuales frescas en otra fecha, para cada método de ultrafiltración; además, se aumentaron seis muestras de aguas residuales almacenadas (a 4 °C) recogidas en una tercera fecha posterior y procesadas días después para SMF.
      NOTA: Cada uno de los seis conjuntos de muestras recogidos en diferentes fechas estaba compuesto por dos muestras de cada una de las tres EDAR. En nuestro estudio, el primer conjunto de muestras frescas de aguas residuales se recolectó el 8 de julio de 2020, el segundo el 30 de septiembre de 2020 y las muestras de aguas residuales se almacenarán para SMF el 14 de octubrede 2020.
    2. Remover durante 30 min a 4 °C para inocular y homogeneizar el ARN blindado en las muestras utilizando un agitador magnético.
    3. Eliminar todas las partículas o células mayores de 0,2 μm y realizar la ultrafiltración.
      1. Filtrar las muestras de aguas residuales con púas (120 ml de cada muestra con púas de 140 ml) a través de gasa y unión de baja proteína, filtros de disco de membrana de 0,45 μm y 0,2 μm, 47 mm, respectivamente, para eliminar partículas grandes, sedimentos, eucariotas y bacterias27. Procesar las muestras filtradas utilizando los métodos de ultrafiltración que se describen a continuación.
        NOTA: Las muestras de aguas residuales recogidas el 8 de julio y el 30 deseptiembre se utilizaron para métodos de ultrafiltración con 3.000 xg y 7.500 x g, respectivamente.
      2. Para la ultrafiltración secuencial a 3.000 x g (UF-3k x g), concentrar un total de 120 ml de la muestra problema recogida en la primera fecha a 3.000 x g durante 30 min cargando 60 ml de la muestra dos veces a aproximadamente 5 ml utilizando un dispositivo centrífugo de marca A, 30 kDa. Luego, concentre el volumen de 5 ml a 3,000 x g durante 30 minutos usando un dispositivo centrífugo de marca B, 30 kDa, a 500-1,200 μL.
      3. Para la ultrafiltración secuencial a 7.500 x g (UF-7,5k x g), cambie la velocidad de centrifugación para el dispositivo centrífugo de la marca B de 3.000 x g a 7.500 x g para obtener volúmenes finales más pequeños, según las recomendaciones del fabricante, y mantenga la misma velocidad de centrifugación del dispositivo centrífugo de la marca A.
        NOTA: Las pruebas se realizaron con las muestras recogidas el 30 deseptiembre.
    4. Para SMF, realice los pasos que se describen a continuación.
    5. Aumentar las muestras de aguas residuales (500 ml cada una) para concentrarlas directamente utilizando el protocolo SMF16,18, sin prefiltración con gasa y filtros de disco de membrana de unión baja en proteínas, como se describe a continuación.
    6. Disolver 0,5 g de leche desnatada en polvo en 50 ml de agua de mar sintética para obtener una solución de leche desnatada al 1% (p/v) y ajustar cuidadosamente el pH de la solución a 3,5 utilizando 1 N HCl.
      NOTA: La acidificación hace que los virus se agreguen y precipiten fuera del agua debido al cambio en su punto isoeléctrico16 y mejora la solubilidad de la leche en polvo28.
    7. Añadir 5 ml de solución de leche desnatada a 500 ml de muestras de aguas residuales crudas para obtener una concentración final de leche desnatada del 0,01% (p/v).
    8. Revuelva las muestras durante 8 h a velocidad media y deje que los flóculos formados se asienten durante otras 8 h a temperatura ambiente.
    9. Retirar los sobrenadantes con cuidado utilizando pipetas serológicas sin alterar los flóculos asentados. Transfiera un volumen final de 50 ml que contenga los flóculos a los tubos de centrifugación y centrifugar a 8.000 x g durante 30 min a 8 °C.
    10. Desechar cuidadosamente los gránulos con una espátula esterilizada y volver a suspender los gránulos restantes en los tubos en 250 μL de tampón fosfato de sodio 0,2 M (pH 7,5) después de retirar el sobrenadante. Transfiera los gránulos raspados y resuspendidos a los mismos tubos de minicentrífuga de 1,5 ml.
  3. Realice la extracción de ARN viral de concentrados virales de muestras de aguas residuales y ensayos de eficiencia de recuperación utilizando un kit de extracción de ARN con una proporción de 25:24:1 de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y β-mercaptoetanol, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para mejorar la eficiencia de extracción. Finalmente, eluye el ARN en 50 μL de tampón de elución.
  4. Análisis cuantitativo en tiempo real de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-qPCR)
    1. Cuantificar el ARN blindado utilizando diluciones diez veces (7.8 x 104 a 7.8 copias de genes) de una construcción sintética de ADN monocatenario o gBlock. Consulte la Tabla 2 para los cebadores y conjuntos de sondas que detectan y cuantifican el ARN blindado.
    2. Diseñe conjuntos de cebadores y sondas utilizando la herramienta de diseño de cebadores29 y apunte a una región de 95 pb (construcción gBlock) dentro del genoma de ARN blindado.
    3. Obtenga curvas de calibración para cada ejecución de RT-qPCR. Incluya controles negativos en cada ejecución de qPCR. Ejecute estándares, ejemplos y controles que no sean de plantilla por triplicado.
    4. Prepare cada mezcla RT-qPCR de 10 μL en el siguiente orden: 2,5 μL de mezcla maestra 4x, 400 nM de cada cebador, sonda de 200 nM y 2,5 μL de plantilla, así como agua destilada ultrapura libre de DNAsa/ARNasa.
    5. Realice reacciones de ciclo térmico a 50 °C durante 5 min, seguidas de 45 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 30 s en un sistema de PCR en tiempo real. Si la TC fue <40, considere la muestra de ARN blindado positivo.
    6. Realizar pruebas de qPCR y RT-qPCR utilizando albúmina sérica bovina con muestras de aguas residuales crudas para evaluar la posibilidad de inhibidores o contaminantes como ácidos húmicos24. No se observaron diferencias significativas entre las muestras con y sin la enzima.
  5. Calcular las concentraciones a partir de la curva estándar. Calcule el porcentaje de eficiencia de recuperación dividiendo la concentración recuperada por la concentración con picos.
  6. Transforme el número de copias de genes utilizando la función log10 para el análisis. Ejecute un modelo lineal general utilizando una herramienta de análisis estadístico sobre los datos de qPCR. Aplicar la prueba de Tukey para detectar diferencias entre los métodos y tratamientos. Tome un valor p de 0.05 para ser un nivel mínimo de significación para la prueba.

2. Filtración y concentración de virus de ADN y ARN para la epidemiología basada en el agua

  1. Para la recolección de agua superficial ambiental, recolecte 10 L de muestras ambientales de agua superficial y use 10 L de muestras de agua desionizada para el control de fondo. Almacenar todas las muestras en una sala de 4 °C hasta su procesamiento dentro de las 24 h siguientes a la recogida de la muestra.
  2. Realice la concentración de virus de muestras ambientales con SMF siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. Realice filtración de cápsulas y vacío utilizando cápsulas de muestreo de agua subterránea de alta capacidad y filtros de disco de membrana de tamaños de 0,45 μm, 0,2 μm y 0,1 μm para minimizar el ruido durante la secuenciación metagenómica, desde fracciones más grandes como microeucariotas y bacterias hasta fracciones más pequeñas como virus.
    2. Preparar una solución de leche desnatada prefloculada al 1% peso por volumen en 1,32 L de agua de mar sintética con 13,2 g de leche desnatada en polvo. Ajuste el pH de esta suspensión a 3,5 utilizando 1 N HCl.
  3. Ajustar el pH de las muestras de agua superficial ambiental a 3,5 utilizando 1 N HCl.
  4. Transfiera 100 ml de la solución de leche desnatada acidificada prefloculada a 10 L de muestras de agua ambiental acidificada (pH 3,5) (concentración final de leche desnatada de 0,01% [p/v]).
  5. Usando un agitador magnético y una barra de agitación magnética, agite las muestras durante 8 h a temperatura ambiente y permita que los flóculos sedimenten por gravedad durante 8 h adicionales. Sin molestar los flóculos, retire con cuidado el sobrenadante con una bomba de vacío.
  6. Alícuota y equilibrar los flóculos restantes según el peso en tubos de centrífuga de 50 ml y hacerlos girar hacia abajo a 8.000 x g durante 30 min a 4 °C.
  7. Desechar el sobrenadante y disolver el pellet resultante (que teóricamente contiene virus de interés) en 200 μL de tampón fosfato de sodio 0,2 M.
  8. Tratar el pellet disuelto con DNasa I y RNasa A, siguiendo las instrucciones del fabricante, para eliminar el ADN y el ARN libres presentes que pueden ser coprecipitados debido al kit utilizado para la extracción de ácidos nucleicos. Desactive la DNasa I y la RNasa A siguiendo las instrucciones del fabricante.
  9. Extraiga los ácidos nucleicos totales del pellet disuelto utilizando un kit de extracción de ADN / ARN, según las instrucciones del fabricante.
  10. Cuantificar la cantidad total de ADN y ARN extraídos de muestras de efluentes utilizando un fluorómetro. Las muestras con concentraciones >1 ng/μL se consideran óptimas para la cuantificación y secuenciación del ADN.
  11. Realice análisis de qPCR para atacar virus entéricos de interés y secuenciación de alto rendimiento para identificar la estructura de la comunidad viral.

3. Precipitación directa y concentración de fracciones microbianas para la epidemiología basada en el agua

  1. Recoja 2 L de muestras de agua de vías fluviales protegidas e impactadas. Si la muestra contiene una cantidad considerable de residuos, use una gasa para eliminarlos.
    NOTA: Se recomienda encarecidamente recolectar un duplicado biológico por muestra.
  2. Preparar una solución de leche desnatada al 1% (p/v) disolviendo 4,4 g de leche desnatada en polvo en 440 ml de agua de mar sintética. Ajuste el pH de esta suspensión a 3,5 con 1 N HCl.
  3. Ajustar el pH de las muestras de agua dulce a 3,5 utilizando 1 N HCl.
  4. Añadir 20 ml de solución de leche desnatada a las muestras de agua dulce de 2 L previamente ajustadas al pH (concentración final de leche desnatada de 0,01% [p/v]). Remover las muestras a temperatura ambiente durante 8 h.
  5. Deje que los flóculos sedimenten por gravedad durante otras 8 h. Retire con cuidado los sobrenadantes con una bomba peristáltica. Transfiera los flóculos sedimentados a un tubo de centrífuga de 50 ml y gírelos a 8.000 x g durante 30 min.
  6. Desechar el sobrenadante y resuspender los pellets con 200 μL de tampón fosfato sódico 0,2 M. Almacene las muestras a -20 °C o proceda a seleccionar ~ 0,5 g del flóculo para la extracción de ADN microbiano utilizando el kit de aislamiento de ácidos nucleicos de su elección, siguiendo las instrucciones del fabricante.
  7. Determine la concentración y pureza del ácido nucleico de ADN con un fluorómetro de alta sensibilidad. Las muestras con concentraciones >1 ng/μL deben ser óptimas para la cuantificación y secuenciación del ADN.

Resultados

Evaluación de métodos de concentración de ARN viral
Las seis muestras procesadas con UF-3k x g fueron positivas y resultaron en una recuperación del 13,38% ± 8,14% (Figura 1). Solo una muestra fue positiva cuando las muestras se procesaron con UF-7.5k x g. Todas las muestras procesadas con SMF fueron positivas y resultaron en una recuperación del 15,27% ± del 2,65% (Figura 1). Las tasas promedio de recuperación de UF...

Discusión

Uno de los pasos críticos en este estudio es la eliminación de partículas sólidas mediante la aplicación de un paso de prefiltración con filtros de membrana de 0,2 μm y 0,45 μm. Considerando la partición de los virus en partículas sólidas, especialmente los virus envueltos, la prefiltración puede causar una pérdida significativa en la recuperación viral30. Si bien un paso de prefiltración para los métodos de ultrafiltración casi siempre es necesario para las muestras ambientales y...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales contradictorias conocidos que podrían haber parecido influir en el trabajo reportado en este documento.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por NSERC Alliance Covid-19 Grant (Premio No. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan y Uyaguari-Díaz). MUD desea agradecer al Programa de Becas de Investigación Universitaria (Premio No. 325201). Tanto JF como JZA cuentan con el apoyo del programa de capacitación de posgrado Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY y JF recibieron becas del programa Mitacs Accelerate. MUD y los miembros de su laboratorio (KY, JF, JZA) cuentan con el apoyo de NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) y la subvención Research Manitoba New Investigator Operating (No 5385). Un agradecimiento especial a la ciudad de Winnipeg, Manitoba. Esta investigación se llevó a cabo en la Universidad de Manitoba. Nos gustaría reconocer que los campus de la Universidad de Manitoba están ubicados en las tierras originales de los pueblos Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota y Dene y en la patria de la Nación Métis.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5Alfa AesarJ62041APFisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filtersVWR66234Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filtersVWR60043Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master MixThermo Fisher Scientific4444432Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing ControlAsuragen49650Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDaPall OD030C65Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDaPallMCP010C46Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml) Nalgene3119-0050PKThermo Fisher Scientific
DNAse IInvitrogen18047019Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2Invitrogen12027Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µmPall12179Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solutionThermo Fisher ScientificAC124210025Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation KitApplied biosystemsA42358Thermo Fisher Scientific
Nuclease free waterPromegaP1197Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pumpMasterflex, Cole-Parmer instrument7553-20Thermo Fisher Scientific
pH meter Denver instrumentRK-59503-25Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1Invitrogen15593031Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe setsIDTIntegrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kitQiagenQiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR SystemThermo Fisher ScientificA34322Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kitInvitrogenQ33231Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFiInvitrogenQ33238Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kitInvitrogenQ32855Thermo Fisher Scientific
RNAse AInvitrogenEN0531Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome KitQiagen26000-50Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powderDifco (BD Life Sciences)DF0032173Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate bufferAlfa AesarAlfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawaterVWR RC8363-1RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlockIDTIntegrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiatedPall4621Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiatedPall4622Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanolGibco21985023Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

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