使用脱脂牛奶絮凝和超滤法浓缩环境水和废水样品中的病毒颗粒

摘要

环境水和废水样品中的病毒浓度是一项具有挑战性的任务，主要用于病毒的鉴定和定量。虽然已经开发和测试了几种病毒浓缩方法，但我们在这里展示了超滤和脱脂牛奶絮凝对不同样品类型的RNA病毒的有效性。

摘要

基于水和废水的流行病学已成为监测和预测社区疫情进程的替代方法。从废水和环境水样中回收微生物组分，包括病毒、细菌和微真核生物，是这些方法中具有挑战性的步骤之一。在这项研究中，我们专注于使用ArmorRNA作为测试病毒的顺序超滤和脱脂牛奶絮凝（SMF）方法的回收效率，该方法也被其他一些研究用作对照。超滤前采用0.45 μm和0.2 μm膜盘式过滤器进行预过滤，去除固体颗粒，防止超滤装置堵塞。用顺序超滤方法处理的测试样品以两种不同的速度离心。速度的提高导致铠甲RNA的恢复率和阳性率降低。另一方面，SMF导致装甲RNA的恢复率和阳性率相对一致。对环境水样进行的其他测试表明，SMF可用于浓缩其他微生物组分。考虑到废水样品超滤之前应用的预过滤步骤，将病毒分成固体颗粒可能会影响整体回收率。由于样品中的固体浓度较低，因此具有预过滤功能的SMF在应用于环境水样品时表现更好，因此降低了对固体的分配率。在本研究中，使用顺序超滤方法的想法源于在COVID-19大流行期间减少病毒浓缩物最终体积的必要性，当时常用的超滤设备的供应有限，并且需要开发替代病毒浓度方法。

引言

确定地表和废水样品中微生物的有效浓度以进行微生物群落分析和流行病学研究，是监测和^{预测社区暴}发过程的重要步骤之一1^，2。COVID-19大流行揭示了改进集中方法的重要性。COVID-19 于 2019 年底出现，截至 2023 年 3 月，仍对人类健康、社会生活和经济构成威胁。有效的监测和控制策略，以减轻COVID-19疫情对社区的影响已成为一个重要的研究课题，因为除了病毒的快速传播和传播以及未报告和未确诊的无症状病例外，还出现了COVID-19的新浪潮和变种³，^4，5.民间社会组织、政府机构以及公共或私营公用事业使用基于废水的COVID-19流行病学有助于提供快速暴发相关信息并减轻COVID-19疫情的影响⁶、⁷、^8、9。然而，废水样品中SARS-CoV-2（一种包膜RNA病毒）的浓度仍然构成挑战¹⁰。例如，这些挑战之一是废水固体中SARS-CoV-2的分配，当固体在浓度¹¹期间被消除时，这可能会影响回收。如果是这种情况，定量/评估的重点应放在环境水样的固相和水相上，而不仅仅是水相。此外，可以根据下游测试和分析修改浓缩方法的选择。随着测序和微生物组领域的发展，环境样本中病毒颗粒和病原体的浓度已成为一个紧迫的研究课题。

在环境水和废水样品的病毒浓度领域已经应用了各种病毒浓缩方法。一些常用的方法有过滤、脱脂牛奶絮凝（SMF）、吸附/洗脱和聚乙二醇沉淀^12-17。其中，SMF被认为是一种廉价有效的方法，已成功测试，并应用于从废水和地表水中回收病毒，包括SARS-CoV-212，^15，16，18。SMF 程序是一种相对较新的方法，在许多环境研究中得到了越来越多的认可，是一种合适的方法，可以同时从所有类型的水样（即污泥、原始污水、废水和污水样本）中回收各种微生物，例如病毒、细菌和原生动物¹⁹.与其他已知的从环境样品中回收病毒的方法（例如超滤和甘氨酸碱洗脱、基于冻干的方法或超速离心和甘氨酸-碱洗脱）相比，SMF 已被报道为最有效的方法，具有更高的病毒回收率和检出率^18，20.在本研究中，我们使用ArmorRNA作为测试病毒来评估病毒浓缩方法的回收效率，包括评估SARS-CoV-2回收率的测试^21，22。

在这里，我们测试了废水和环境水样，以证明SMF和顺序超滤方法在浓缩微生物级分以进行定量聚合酶链反应（qPCR），基于序列的宏基因组学和深度扩增子测序的实用性。与超滤方法相比，SMF 是一种相对便宜的方法，最适合大量样品。使用顺序超滤方法的想法源于在 COVID-19 大流行期间减少病毒浓缩物最终体积的必要性，当时常用超滤设备的供应有限，并且需要开发替代病毒浓缩方法。

研究方案

1. 连续超滤与脱脂牛奶絮凝浓缩废水样品中病毒的比较

1. 样品制备
   1. 收集2 L的24小时流量比例复合原始（进料）废水样品。2020年夏季和秋季，从加拿大温尼伯的三个主要废水处理厂（WWTP）收集了样品（表1）。
   2. 将样品装在保温箱中的防光瓶中运送到实验室，并在24小时内进行处理。收集废水理化和生物特性数据。
2. 病毒浓度测定
   注意:采用顺序超滤法和有机絮凝法，即脱脂牛奶絮凝（SMF）来评估使用ArmorRNA作为测试病毒的每种方法的总回收效率²³.其他研究人员也使用ArmorRNA作为对照病毒来评估包膜病毒浓度方法的回收率，例如家族 Coronaviridae^22,24,25,26.
   1. 对于添加铠状RNA，将超滤和SMF方法的废水测试体积分别设置为140 mL和500 mL。使用移液器，将5 x 10⁴ 个ArmorRNA拷贝加标到一个日期收集的六个新鲜废水样品和另一个日期收集的六个新鲜废水样品中，对于每种超滤方法;此外，加标六个储存的（在4°C）废水样品在第三个较晚的日期收集，并在几天后处理SMF。
      注意:在不同日期收集的六个样本集中的每一个都由三个污水处理厂中每个样本的两个样本组成。在我们的研究中，第一批新鲜废水样本于2020年7月8日收集，第二组于2020年9月30日收集，废水样本于2020年10月14日储存用于SMF。
   2. 在4°C下搅拌30分钟，以使用磁力搅拌器接种和匀浆样品中的铠状RNA。
   3. 去除所有大于0.2μm的颗粒或细胞并进行超滤。
      1. 通过粗棉布和低蛋白结合、0.45 μm 和 0.2 μm、47 mm 膜盘过滤器过滤加标废水样品（每个 140 mL 加标样品中的 120 mL），以去除大颗粒、沉积物、真核生物和细菌²⁷。使用下面描述的超滤方法处理过滤后的样品。
         注意:7月8^日和9月30日收集的废水样品分别用于3，000 x g和7，500 x g的超滤方法。
      2. 对于 3，000 x g （UF-3k x g） 的顺序超滤，通过使用品牌 A 离心装置 30-kDa，将 60 mL 样品两次浓缩至约 5 mL，将第一天收集的总共 120 mL 测试样品在 3，000 x g 下浓缩 30 分钟。然后，使用品牌 B 离心装置 30-kDa，将 5 mL 体积以 3，000 x g 浓缩至 500-1，200 μL。
      3. 对于 7，500 x g （UF-7.5k x g） 的顺序超滤，根据制造商的建议，将品牌 B 离心装置的离心速度从 3，000 x g 更改为 7，500 x g，以获得更小的最终体积，并保持品牌 A 离心装置的离心速度相同。
         注意:测试是使用9月30日收集的样本^进行的。
   4. 对于 SMF，请执行下面概述的步骤。
   5. 使用 SMF 方案¹⁶，¹⁸ 加标废水样品（每个 500 mL）直接浓缩，无需用粗棉布和低蛋白结合膜盘过滤器预过滤^，如下所述。
   6. 将 0.5 g 脱脂奶粉溶解在 50 mL 合成海水中，以获得 1% （w/v） 脱脂牛奶溶液，并使用 1 N HCl 小心地将溶液的 pH 值调节至 3.5。
      注意:酸化使病毒由于其等电点¹⁶ 的变化而聚集并沉淀出水，并提高奶粉²⁸的溶解度。
   7. 将 5 mL 脱脂牛奶溶液加入 500 mL 原废水样品中，以获得脱脂牛奶的最终浓度为 0.01% （w/v）。
   8. 以中速搅拌样品8小时，并使形成的絮凝体在室温下再沉降8小时。
   9. 使用血清移液管小心地除去上清液，而不会干扰沉淀的絮凝物。将含有絮凝体的最终体积为50mL转移到离心管中，并在8°C下以8，000× g 离心30分钟。
   10. 使用无菌刮刀小心地刮除沉淀，并在除去上清液后将剩余的沉淀重悬于250μL0.2M磷酸钠缓冲液（pH 7.5）中。将刮擦和重悬的颗粒转移到相同的 1.5 mL 小型离心管中。
3. 根据制造商的说明，使用苯酚:氯仿:异戊醇和β-巯基乙醇比例为25:24:1的RNA提取试剂盒从废水样品的病毒浓缩物中进行病毒RNA提取和回收效率测定，以提高提取效率。最后，在 50 μL 洗脱缓冲液中洗脱 RNA。
4. 实时定量聚合酶链反应 （RT-qPCR） 分析
   1. 使用合成单链 DNA 或 gBlock 构建体的十倍稀释液（7.8 x 10⁴ 至 7.8 个基因拷贝）定量装甲 RNA。有关检测和定量铠状RNA的引物和探针组，请参见 表2 。
   2. 使用引物设计工具²⁹ 设计引物和探针组，并靶向装甲RNA基因组内的95 bp区域（gBlock构建体）。
   3. 获得每次RT-qPCR运行的校准曲线。在每次qPCR运行中包括阴性对照。一式三份运行标准、示例和非模板控件。
   4. 按以下顺序制备每个 10 μL RT-qPCR 混合物:2.5 μL 4x 预混液、每个引物 400 nM、200 nM 探针和 2.5 μL 模板，以及超纯 DNASE/RNASE 无蒸馏水。
   5. 在50°C下进行热循环反应5分钟，然后在实时PCR系统上进行45个95°C循环10秒和60°C30秒。如果CT为<40，则考虑样本铠甲RNA阳性。
   6. 使用牛血清白蛋白和原始污水样品进行 qPCR 和 RT-qPCR 测试，以评估抑制剂或污染物（如腐植酸）的可能性²⁴.在有和没有酶的样品之间没有观察到显着差异。
5. 从标准曲线计算浓度。通过将回收浓度除以加标浓度来计算回收效率百分比。
6. 使用 log₁₀ 函数转换基因拷贝数进行分析。使用统计分析工具对 qPCR 数据运行一般线性模型。应用Tukey的测试来检测方法和治疗方法之间的差异。 将 p 值 0.05 作为检验的最小显著性水平。

2. 用于水基流行病学的DNA和RNA病毒的过滤和浓缩

1. 对于环境地表水收集，收集10L环境地表水样品，并使用10L去离子水样品进行背景控制。将所有样品储存在4°C房间中，直到样品收集后24小时内处理。
2. 使用下面描述的步骤用SMF对环境样品中的病毒进行浓缩。
   1. 使用0.45 μm、0.2 μm和0.1 μm尺寸的高容量地下水采样胶囊和膜盘过滤器进行胶囊和真空过滤，以最大限度地减少宏基因组测序过程中的噪音，从较大的部分（如微真核生物和细菌）到较小的部分（如病毒）。
   2. 在 1.32 L 合成海水中制备 1% 体积重量预絮凝脱脂牛奶溶液和 13.2 g 脱脂奶粉。使用1N HCl将该悬浮液的pH值调节至3.5。
3. 使用1 N HCl将环境地表水样品的pH值调节至3.5。
4. 将 100 mL 预絮凝酸化脱脂牛奶溶液转移到 10 L 酸化 （pH 3.5） 环境水样中（最终脱脂牛奶浓度为 0.01% [w/v]）。
5. 使用磁力搅拌器和磁力搅拌棒，在室温下搅拌样品8小时，并让絮凝物通过重力沉淀8小时。在不干扰絮凝体的情况下，使用真空泵小心地除去上清液。
6. 根据50mL离心管中的重量等分并平衡剩余的絮凝体，并在4°C下以8，000× g 旋转30分钟。
7. 弃去上清液并将所得沉淀（理论上含有目标病毒）溶解在 200 μL 0.2 M 磷酸钠缓冲液中。
8. 按照制造商的说明，用 DNase I 和 RNase A 处理溶解的沉淀，以消除由于用于核酸提取的试剂盒而可能共沉淀的游离 DNA 和 RNA。按照制造商的说明灭活脱氧核糖核酸酶 I 和核糖核酸酶 A。
9. 按照制造商的说明，使用 DNA/RNA 提取试剂盒从溶解的沉淀中提取总核酸。
10. 使用荧光计定量从污水样品中提取的DNA和RNA的总量。浓度为 >1 ng/μL 的样品被认为是 DNA 定量和测序的最佳选择。
11. 进行qPCR分析以靶向感兴趣的肠道病毒，并进行高通量测序以鉴定病毒群落结构。

3. 用于水基流行病学的微生物组分的直接沉淀和浓缩

1. 从受保护和受影响的水道中收集 2 L 水样。如果样品含有大量碎屑，请使用粗棉布将其清除。
   注意:强烈建议收集每个样品的生物重复。
2. 通过将 4.4 克脱脂奶粉溶解在 440 mL 合成海水中，制备 1% （w/v） 脱脂牛奶溶液。用1N HCl将该悬浮液的pH值调节至3.5。
3. 使用 1 N HCl 将淡水样品的 pH 值调节至 3.5。
4. 将 20 mL 脱脂牛奶溶液添加到先前调节 pH 值的 2 L 淡水样品中（最终脱脂牛奶浓度为 0.01% [w/v]）。将样品在室温下搅拌8小时。
5. 让絮凝物在重力作用下再沉淀8小时。用蠕动泵小心地除去上清液。将沉淀的絮凝物转移到 50 mL 离心管中，并以 8，000 x g 的速度旋转 30 分钟。
6. 弃去上清液，并用200μL的0.2M磷酸钠缓冲液重悬沉淀。将样品储存在-20°C或按照制造商的说明，使用所选的核酸分离试剂盒继续选择~0.5g的絮体进行微生物DNA提取。
7. 使用高灵敏度荧光计测定DNA核酸浓度和纯度。浓度为 >1 ng/μL 的样品应该是 DNA 定量和测序的最佳选择。

结果

病毒RNA浓度方法的评估
用UF-3k x g处理的所有六个样品均为阳性，回收率为13.38%±8.14%（图1）。当样品用UF-7.5k x g处理时，只有一个样品呈阳性。用SMF处理的所有样品均为阳性，回收率为15.27%±2.65%（图1）。UF-3K x g和SMF的平均回收率显著且一致（p < 0.0001）高于UF-7.5K x g。另一方面，UF-3K x g和SMF的回收?...

讨论

本研究的关键步骤之一是通过使用0.2μm和0.45μm膜过滤器进行预过滤步骤来消除固体颗粒。考虑到病毒被分割成固体颗粒，特别是包膜病毒，预过滤会导致病毒回收的显着损失³⁰。虽然对于环境和废水样品几乎总是需要超滤方法的预过滤步骤以防止超滤设备堵塞，但根据下游分析的类型，可能需要对SMF进行预过滤。对于靶向PCR研究，可能不需要预过滤。另一方面，预过滤可能会显?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5	Alfa Aesar	J62041AP	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	66234	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	60043	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444432	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control	Asuragen	49650	Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	OD030C65	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	MCP010C46	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)	Nalgene	3119-0050PK	Thermo Fisher Scientific
DNAse I	Invitrogen	18047019	Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2	Invitrogen	12027	Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm	Pall	12179	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution	Thermo Fisher Scientific	AC124210025	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit	Applied biosystems	A42358	Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water	Promega	P1197	Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump	Masterflex, Cole-Parmer instrument	7553-20	Thermo Fisher Scientific
pH meter	Denver instrument	RK-59503-25	Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1	Invitrogen	15593031	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit	Qiagen		Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	A34322	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q33231	Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi	Invitrogen	Q33238	Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q32855	Thermo Fisher Scientific
RNAse A	Invitrogen	EN0531	Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit	Qiagen	26000-50	Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder	Difco (BD Life Sciences)	DF0032173	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer	Alfa Aesar		Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater	VWR	RC8363-1	RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4621	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4622	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA