القياس الكمي لتكاليف اللياقة البدنية في بعوض الزاعجة المصرية المعدلة وراثيا

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية قياس بيانات معلمات الحياة الشائعة في بعوض الزاعجة المصرية ، بما في ذلك الخصوبة ، وحجم الجناح ، والخصوبة ، ونسبة الجنس ، والقدرة على البقاء ، وأوقات النمو ، ومساهمة الذكور ، وطول عمر البالغين. يمكن استخدام هذه القياسات لتقييم لياقة البعوض المعدل وراثيا.

Abstract

غالبا ما يعرض البعوض المعدل وراثيا تكاليف اللياقة البدنية مقارنة بنظرائه من النوع البري. وفي هذا الصدد، تنطوي دراسات تكاليف اللياقة على جمع بيانات بارامترات الحياة من البعوض المعدل وراثيا ومقارنتها بالبعوض الذي يفتقر إلى جينات التحوير من نفس الخلفية الجينية. توضح هذه المخطوطة كيفية قياس سمات تاريخ الحياة الشائعة في البعوضة Aedes aegypti ، بما في ذلك الخصوبة ، وحجم الجناح وشكله ، والخصوبة ، ونسبة الجنس ، والقدرة على البقاء ، وأوقات النمو ، ومساهمة الذكور ، وطول عمر البالغين. تم اختيار هذه المعلمات لأنها تعكس النجاح الإنجابي ، وسهلة القياس ، ويتم الإبلاغ عنها بشكل شائع في الأدبيات. تحدد النتائج التمثيلية تكاليف اللياقة البدنية المرتبطة إما بالضربة القاضية الجينية أو إدخال واحد لعنصر محرك الجينات. يعد توحيد كيفية جمع بيانات معلمات الحياة أمرا مهما لأن هذه البيانات يمكن استخدامها لمقارنة صحة البعوض المعدل وراثيا المتولدة عبر الدراسات أو لنمذجة معدل تثبيت الجينات المحورة في محاكاة مجموعات البعوض من النوع البري. على الرغم من أن هذا البروتوكول خاص بالزاعجة المصرية المعدلة وراثيا ، إلا أنه يمكن أيضا استخدام البروتوكول لأنواع البعوض الأخرى أو ظروف العلاج التجريبية الأخرى ، مع التحذير من أن بعض السياقات البيولوجية قد تتطلب تكيفات خاصة.

Introduction

البقاء للأصلح هو الفكرة الداروينية القائلة بأن الأفراد الذين يؤوون جينات تتكيف بشكل أفضل مع بيئتهم سينقلون هذه الجينات إلى الأجيال اللاحقة¹. هذا يعني أن اللياقة البدنية هي التي تحدد ما إذا كانت جيناتهم ستبقى على قيد الحياة. ربما يكون هذا المفهوم الذي يزيد عمره عن 150 عاما هو أهم محدد لهندسة محرك جيني ناجح في البعوض المعدل وراثيا. يتم استكشاف محركات الجينات ، أو نمط الوراثة الفائقة المندلية لعنصر وراثي أناني يسمح له بالانتشار عبر السكان² ، من أجل الإدارة الوراثية للآفات³. وفي سياق مكافحة النواقل، تهدف هذه الاستراتيجية إما إلى الاستعاضة عن مفصليات الأرجل البرية بأخرى مقاومة لمسببات الأمراض (تعديل السكان) أو القضاء عليها جميعا معا (قمع التجمع)⁴. ومع ذلك ، غالبا ما يظهر البعوض المعدل وراثيا تكاليف اللياقة البدنية (وتسمى أيضا الحمل الجيني) مقارنة بنظرائهم في WT ، مما يعني أن الجينات المحورة ستفقد في المجموعات التي يمكن أن تتفوق عليها. لذلك فإن اقتران جينات التحوير بنظام محرك الجينات ضروري لتعويض أي تكاليف للياقة البدنية ودفع الجينات المحورة عبر السكان بمستويات أكبر من المتوقع من الوراثة المندلية^{النموذجية 4}.

أظهرت الدراسات المختبرية عبر أنواع البعوض الناقل أن جينات التحوير غالبا ما تعرض تكاليف اللياقة^{البدنية 5،6،7}. على سبيل المثال ، Irvin et al. قياس معلمات الحياة المختلفة في الزاعجة (Ae.) aegypti المصممة للتعبير عن البروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP) أو جينات transposase تحت ذبابة الفاكهة أكتين 5C أو محفزات 3XP3 الاصطناعية ، ومقارنتها بسلالة أورلاندو من النوع البري (نفس الخلفية الجينية التي اشتقت منها) ⁵. والجدير بالذكر أنهم وجدوا أن جميع السلالات المعدلة وراثيا قد قللت بشكل كبير من اللياقة الإنجابية⁵. اعتمادا على جين التحوير ، أظهر بعض بعوض الأنوفيلة (An.) الذي يعبر عن جينات التحوير التي تثبط تطور طفيلي البلازموديوم أيضا تكاليف اللياقة^{البدنية 6}. على وجه التحديد ، وضع An. stephensi الذي يعبر عن فوسفوليباز سم النحل (PLA2) تحت المروجين التأسيسيين أو المحرضين لمسحوق الدم عددا أقل بكثير من البيض مقارنة بالضوابط⁶. وجد هؤلاء المؤلفون أيضا أن الأنوفيلة المعدلة وراثيا التي تعبر عن جين محوري مختلف ، وهو رباعي دوديكاببتيد SM1 لم يظهر تكاليف اللياقة البدنية ، مما دفعهم إلى استنتاج أن تكاليف اللياقة البدنية الممنوحة للجينات المعدلة تعتمد ، على الأقل جزئيا ، على تأثير البروتين المعدل وراثيا^{المنتج 6}. في الواقع ، يمكن أن تعزى تكاليف اللياقة البدنية إلى منتجات الجينات المحورة ، أو التأثيرات الموضعية ، أو التأثيرات غير المستهدفة ، أو الطفرات الإدراجية ، أو تأثيرات زواج الأقارب في السلالات التي يتم تربيتها في المختبر⁷. لذلك يجب أن تكون محركات الجينات قوية بما يكفي لتعويض تكاليف اللياقة البدنية التي يسببها التحوير الجيني مع تجنب تطوير عمليات الإدراج والحذف (indels) التي تمنع محرك الأقراص نفسه.

يمكن قياس تكاليف اللياقة التنموية أو الإنجابية في الدراسات المختبرية أو الأقفاص⁷ ، مع التحذير من أن العوامل غير المعروفة في هذا المجال قد يكون لها تأثير أيضا. ومع ذلك ، فإن دراسات اللياقة البدنية الخاضعة للرقابة هي خطوة أولى مهمة عند تخطيط أو تقييم إطلاق البعوض المعدل وراثيا ، مثل برنامج محرك الجينات ، لتحديد ما إذا كان الخط المعدل وراثيا سيستمر على مدى الأجيال اللاحقة. على سبيل المثال ، هاموند وآخرون. تم تقييم محركات الجينات المستندة إلى CRISPR / Cas9 في غامبيا والتي تهدف إلى تعطيل الجينات اللازمة لخصوبة الإناث⁸. من خلال دراسات الأقفاص التي تم الحفاظ عليها لمدة 25 جيلا على الأقل ، وجد المؤلفون أن البعوض تكبد أليلات مقاومة لمحرك الجينات منعت الانقسام المستهدف لكريسبر واستعادت خصوبة الإناث⁸. اقترحت جهود النمذجة التي بذلوها أن الخصوبة في الإناث غير المتجانسة الزيجوت لمحرك الجينات كان لها التأثيرات الأكثر دراماتيكية على تثبيت محرك الجينات في ظروف محاكاة⁸. على نفس المنوال ، Ae. aegypti (سلالة العين البيضاء هيغز ، HWE) المصممة للتعبير عن أشرطة محرك الجينات المستقلة تحت مروجين مختلفين أو في مواقع مختلفة بين الجينات أظهرت معدلات مختلفة من تثبيت محرك الجينات في مجموعات محاكاة⁹. باستخدام نمذجة MGDrivE¹⁰ ، جنبا إلى جنب مع المعدلات المقاسة لتكوين indel ، وتأثيرات الأمهات ، وبيانات معلمات الحياة التي تم جمعها في المختبر ، وجد المؤلفون أن لياقة البعوض أثرت بشدة على استمرار محرك الجينات في ظروف محاكاة⁹. تعزى تكاليف اللياقة البدنية التي من المرجح أن تضعف كفاءة محرك الجينات إلى التعبير الجسدي Cas9 (الزائد) أو من الجين المستهدف ، خاصة في الزيجوتات غير المتجانسة ، بدلا من المحرك الداخلي نفسه^{11،12،13،14،15،16،17}.

نظرا لأهميتها ، تعد اللياقة البدنية عاملا مهما لقدرة الخط المعدل وراثيا على الاستمرار على مدى الأجيال اللاحقة ، ويمكن استخدامه كمؤشر لأي تأثيرات فسيولوجية مرتبطة بجين التحوير. على سبيل المثال ، قد ترتبط التأثيرات غير المستهدفة بتكاليف اللياقة البدنية. في هذه الحالة ، يوصى بعبور خط معدل وراثيا لعدة أجيال. علاوة على ذلك ، قد يكون من الضروري أيضا عبور الخط المعدل وراثيا بخط يعكس مجموعة الحقل للتحقيق في مدى قدرة السكان المحورين وراثيا على المنافسة في العالم الحقيقي. لتحديد تكاليف اللياقة البدنية بحيث يمكن مقارنتها ، توفر هذه المخطوطة بروتوكولات بسيطة لقياس سمات تاريخ الحياة الشائعة في Ae. aegypti Mosquitoi ، مع التركيز بشكل خاص على تكاليف اللياقة البدنية المرتبطة بالجينات المحورة ، بحيث يمكن استنساخ مثل هذه الدراسات بسهولة أكبر. تشمل البروتوكولات الخصوبة والخصوبة ونسبة الجنس والجدوى وأوقات النمو ومساهمة الذكور وطول عمر البالغين. كما تم اختيار قياس طول الجناح ومساحته كقياس للياقة البدنية لأنه يرتبط بطول الصدر^18,19 وقياسات حجم الجسم ، والتي ترتبط ارتباطا مباشرا بحجم وجبة الدم والخصوبة والمناعة^20,21. على الرغم من وجود العديد من الطرق لتقييم اللياقة البدنية ، فقد تم اختيار هذه المعلمات لأنها تعكس النجاح الإنجابي ، وسهلة القياس ، ويتم الإبلاغ عنها بشكل شائع في الأدبيات.

Protocol

ملاحظة: تمت كتابة هذا البروتوكول للخطوط Ae. aegypti المعدلة وراثيا والبرية التي تم التحقق من صحتها وتأسيسها مسبقا. لمزيد من المعلومات حول توليد Ae. aegypti المعدلة وراثيا ، انظر Kistler et al.²² وكوتس وآخرون.²³. تم إجراء جميع التجارب الموضحة أدناه وفقا لإجراءات التربية القياسية Ae. aegypti . تم الحفاظ على البعوض عند 28 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 75٪ -80٪ ودورة مظلمة لمدة 12 ساعة / 12 ساعة. يوصى بشدة بما لا يقل عن 100 ورقة بيض فردية لكل بقعة بعوض للأغراض الإحصائية. تستغرق دراسات اللياقة البدنية الشاملة حوالي 3 أشهر لإكمالها (الشكل 1).

1. قياس الخصوبة في إناث البعوض

1. يفقس البعوض المعدل وراثيا و WT (من نفس الخلفية الجينية ولكن يفتقر إلى الجينات المحورة) عن طريق وضع أوراق البيض في الماء المعقم طوال الليل في الحشرة ، وفقا لظروف التربية القياسية. اسمح لليرقات بتغذية ad libitum من خلال توفير عدة قطرات (كل منها حوالي 50 ميكرولتر) من ملاط الأسماك المطحون (Tetramin) (حوالي 30٪ وزن / حجم). يمكن التعرف على اليرقات الأولى 1 يوم بعد الفقس. ضع اليرقات في حاويات أكبر حتى لا يكون هناك ازدحام ، وعموما يمكن تربية 100-150 يرقة في حجم 1 لتر من الماء بمساحة سطح حوالي 250 سم². استمر في توفير ملاط Tetramin كمصدر للغذاء ، مما يسمح لليرقات بالتغذية الإعلانية. أضف ملاط الطعام في قطرات منفصلة بحيث يتوفر دائما طعام كاف لليرقات ، وحتى لا يبدو الماء غائما. سيزداد حجم اليرقات مع كل حشرة وستدخل في النهاية في الجرو في أحواض اليرقات.
2. بمجرد أن تبدأ الشرانق في الظهور ، ~ 5-6 أيام بعد الفقس ، افصلها حسب الجنس للتأكد من أن البالغين عذارى بمجرد ظهورهم (للتزاوج اللاحق) ، كما هو موضح أدناه.
   1. لفرز الشرانق حسب الجنس ، ابدأ باختيار الشرانق باستخدام ماصات بلاستيكية سعة 3 مل في أكواب بلاستيكية صغيرة تحتوي على ماء صنبور نظيف. تميل ذكور الشرانق إلى أن تكون أصغر وتميل إلى الظهور أولا مقارنة بالإناث. أولا ، قم بفرز الشرانق حسب الحجم ، ثم قم بتأكيد هذه الشاشة الأولية حسب التشكل.
   2. انقل الخادرة إلى شريحة مجهر زجاجي وقم بإزالة الماء الزائد بمنديل. هذا يجمد الخادرة. تحت مجسم عند تكبير 2x-4x ، ضع الجانب البطني للخادرة لأعلى باستخدام فرشاة طلاء ذات رؤوس دقيقة.
   3. تحليل بصريا الذيل للاختلافات في شكل الفص التناسلي (في نهاية شرائح البطن العذراء خلف المجاذيف. الشكل 2). لدى الإناث زعانف مدببة تمتد إلى ما بعد الفصوص التناسلية ، تشبه تقريبا أسنان التاج أو مصاصي الدماء ، في حين أن الفصوص التناسلية الذكرية مستديرة ولا تحتوي على هذه الهياكل المدببة. انظر كارفالهو وآخرون.⁽²⁴ ) للاطلاع على أرقام إضافية.
3. ضع الشرانق من الذكور والإناث في أكواب ماء منفصلة وضعها في الاحتواء المناسب ، على سبيل المثال ، كرتون 1.9 لتر (1/2 جالون أو 64 أونصة) مع 0.2 م × 0.2 م (8 بوصة × 8 بوصة) من القماش العضوي الأبيض ، يحتوي كل منها على ~ 150 خادرة.
4. توفير مصدر للسكر والماء فوق الأقفاص (على سبيل المثال ، الزبيب وكوب مملوء بالماء مغطى بشاش ، مثبت بشريطين مطاطيين). اقطع ثقبا بحجم القلم في الكراتين وقم بتغطيته بسدادة مطاطية بحيث يمكن إضافة الشرانق الإضافية إلى الأقفاص عند ظهورها.
5. في 3-5 أيام بعد ظهور البالغين ، قم بتخدير البعوض عن طريق وضع الكراتين عند 4 درجات مئوية لمدة ~ 2-5 دقائق. على الرغم من أنها قد لا تزال ترتعش ، إلا أن البعوض يتم تخديره بشكل كاف بمجرد سقوط الغالبية في قاع الكرتون. ضع البعوض على طبق بتري زجاجي على الجليد لمدة ~ 30 دقيقة -1 ساعة.
   ملاحظة: ترك البعوض عند 4 درجات مئوية لفترة طويلة جدا قد يؤثر بشكل كبير على صحته ، على الرغم من أننا لم نجد أي آثار إذا ترك على الجليد لمدة تصل إلى 1 ساعة.
6. عبر WT أو GD1 المعدلة وراثيا أو GD2⁹ (محرك الجينات القائم على CRISPR / Cas-9) الذكور بشكل جماعي مع إناث WT البكر (السيطرة) عن طريق إضافة البعوض المخدر بنسب خمسة WT أو الذكور المعدلة وراثيا إلى أنثى WT واحدة في علب البعوض ، كل منها يحتوي على ~ 150 البعوض. تأكد من تسمية الأقفاص حسب نوع الذكور.
   ملاحظة: يهدف مخطط العبور هذا إلى تحديد مدى ملاءمة GD1 أو GD2⁹ hemizygotes (أي البعوض الذي يؤوي نسخة واحدة من جين التحوير). لتحديد مدى ملاءمة الخطوط المعدلة وراثيا متماثلة الزيجوت ، يمكن تكييف مخطط العبور بحيث يسمح للذكور والإناث المحورين وراثيا بالتزاوج مقارنة بتهجين الذكور والإناث WT.
7. بعد 2-3 أيام ، إطعام الدم الإناث باتباع ممارسات التربية القياسية²⁵ من خلال توفير مصدر دم أعلى القفص. قم بإزالة مصدر السكر قبل تغذية الدم لمدة 24 ساعة ومصدر المياه ~ 2-3 ساعات قبل تغذية الدم لزيادة كفاءة التغذية.
8. بعد تغذية الدم ، قم بتخدير البعوض عن طريق وضعه عند 4 درجات مئوية ، كما في الخطوة 1.5.
9. فرز الإناث التي تتغذى على الدم (احتقان بالكامل) من الإناث غير المغذية عن طريق فحص بطونهن بصريا للاحتقان. تخلص من غير المتغذين ، والذين يتغذون جزئيا ، والذكور.
10. ضع الإناث المحتقنة مرة أخرى في أقفاصها ووفر مصدرا للسكر والماء فوق الأقفاص.
11. بعد 2-3 أيام ، ضع الإناث الفردية في أنابيب مخروطية سعة 50 مل مبطنة بورق ترشيح تم تسميته مسبقا بالقلم الرصاص (الشكل 3). قم بتغطية الأنابيب المخروطية بشبكة وختم بشريطين مطاطيين.
12. بمجرد استيقاظ الإناث ، املأ جميع الأنابيب ب ~ 5 مل من ماء الصنبور. ضع قطعة صغيرة من الزبيب أو كرة قطنية مبللة بالسكر فوق كل أنبوب مخروطي. اترك الإناث لمدة 1-2 أيام في الحشرة واسمح لها بالبيض.
13. بعد 1-2 أيام ، صفي كل أنبوب مخروطي وتخدير البعوض عن طريق وضعه عند 4 درجات مئوية. للمعالجة السريعة ، استخدم طرف ماصة بلاستيكية سعة 3 مل مضغوطة على الشبكة لتصريف المياه من كل أنبوب مخروطي. قم بتدوير الأنابيب رأسا على عقب وضعها فوق منشفة ورقية لتصريفها. ضع الأنابيب المخروطية سعة 50 مل في حامل أنبوب وضع الرف على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
14. اجمع ورقة البيض واحسب عدد البيض على كل ورقة. عد الإناث التي لا تضع البيض على أنها 0 وأدرجها في التحليل. احسب متوسط الخصوبة باعتباره إجمالي عدد البيض المحسوب على كل ورقة مقسوما على إجمالي عدد الإناث التي تم فحصها.
    ملاحظة: قد تكون الصور الرقمية لأوراق البيض الفردية بمثابة سجل مرئي لتأكيد العد (الشكل 4).
15. جفف أوراق البيض وضعها مرة أخرى في الحشرة. يوصى بأن تجف أوراق البيض لمدة 3-5 أيام على الأقل من أجل الفقس الأمثل²⁵.

2. قياس طول الجناح ومساحته وحجمه مركزيا

1. قم بتجميد ما لا يقل عن 25 WT أو الإناث المتطابقة مع العمر المعدلة وراثيا التي تغذت على الدم من دراسة الخصوبة المكتملة عن طريق وضع أقفاص البعوض عند -20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا.
   ملاحظة: لا تجمد لفترة أطول من الوقت ولا تهز الحاوية أو تسقطها ، لأن ذلك قد يتسبب في سقوط الأجنحة من البعوض.
2. تشريح الجناح الأيسر لكل بعوضة ، واستئصال مفصل الجناح والصدر ، وإزالة الجناح بأكمله ، باتباع البروتوكول أدناه.
   1. في يد واحدة ، أمسك البعوض بالملقط ، وأمسك منطقة الصدر تحت الأجنحة.
   2. باستخدام زوج آخر من الملقط في اليد الأخرى ، قم بتشريح الجناح الأيسر لكل بعوضة ، واستئصالها عند مفصل الجناح والصدر باستخدام ضغط لطيف لسحب الجناح ، وإزالة الجناح بالكامل دون تمزيق عروق الجناح.
3. باستخدام ملقط ، ضع الجناح على شريحة زجاجية ، مستلقيا بشكل مسطح. باستخدام ماصة نقل ، أضف قطرة واحدة من محلول مخزون سعة 15 مل ، يتكون من 70٪ إيثانول ، وقطرة واحدة من صابون الأطباق إلى الجناح الموجود على الشريحة.
4. أضف قطرة واحدة من 80٪ من الجلسرين إلى الغطاء وضعه أعلى الجناح في محلول صابون الإيثانول.
5. قم بتصوير الأجنحة المثبتة على الشرائح باستخدام كاميرا بعدسة 65 مم (7D-65 mm-1x ؛ التكبير = 1 ، 200 ، 6.3 ، ISO = 100). لاحظ مقياس البكسل / مم وتأكد من بقاء هذا كما هو لجميع الصور. إذا تم تصوير أجنحة متعددة معا، فقم بقص الصور إلى أجنحة فردية وأضف أشرطة مقياس إلى كل صورة. احفظ الصور بتنسيق TIFF مع ضغط LZW ، مع تسمية كل صورة بوضوح بجميع المعلومات الخاصة بالجناح الفردي.
   ملاحظة: يمكن تصوير الأجنحة باستخدام كاميرا وتكبير مختلفين أو بكاميرا متصلة بمجهر لدراسات أخرى ، إذا ظلت الإعدادات كما هي وظل مقياس البكسل / مم كما هو لكل جناح تم تصويره في الدراسة. سيتم احتساب نسبة البكسل / مم عند تحديد القياسات.
6. قم بتنزيل tpsUtil و tpsDig ، وهما برنامجان مجانيان لمعالجة الصور المورفومترية. راجع Rohlf ^26,27 للحصول على معلومات أكثر تفصيلا حول البرنامج.
7. رقمنة الأجنحة باستخدام tpsUtil لإنشاء ملف TPS لصور الجناح للخطوة التالية من الرقمنة.
   1. للقيام بذلك ، افتح tpsUtil ، وتحت التشغيل ، حدد إنشاء ملف tps من الصور. انقر فوق إدخال ، وحدد الملف الذي يحتوي على صور الجناح الفردية ، ثم حدد أي صورة لاختيار هذا المجلد. انقر فوق الإخراج وقم بتسمية الملف الذي سيتم إنشاؤه بتنسيق .tps. انقر على حفظ.
   2. ثم ضمن إجراءات، انقر فوق إعداد. حدد تضمين الكل، وانقر فوق إنشاء وأغلق المربع المنبثق. تحت العملية ، حدد الآن ترتيب العينات بشكل عشوائي. انقر فوق الإدخال وحدد ملف .tps الذي تم إنشاؤه للتو. انقر فوق الإخراج ، وأعد تسمية ملف .tps للإشارة إلى أن هذا هو إصدار الملف مع العينات العشوائية ، وانقر فوق حفظ. ثم انقر فوق إنشاء. أغلق برنامج tpsUtil.
      ملاحظة: لتقليل خطأ القياس ، قد يتم تكرار صور الجناح واستخدامها مرتين للنسخ المتماثل الفني.
8. استخدم برنامج tpsDig لتحديد الإحداثيات الديكارتية ثنائية الأبعاد للمعالم. ضمن الإدخال، حدد ملف .tps الذي تم إنشاؤه في الخطوة 2.7. اضبط المقياس على المقياس المحدد في الخطوة 2.5 ؛ ضمن خيارات، حدد أدوات الصورة، ثم انقر فوق قياس.
9. أضف معالم إلى الصورة بالنقر فوق رمز التقاطع الأزرق الذي يمثل رقمنة المعالم ، ثم انقر فوق مفاصل الجناح المشار إليها في الشكل 5 ، بالترتيب من المعلم 1 إلى المعلم 14.
   ملاحظة: تم اختيار هذه المعالم لأنها استخدمت سابقا في رقمنة وتحليل معالم الجناح¹⁹ ، ويسهل تحديد موقعها عند مفاصل عروق الجناح عبر العديد من العينات ، وتوفر معالم جناح كافية لالتقاط حجم وشكل الجناح.
10. عند وضع علامة على المعالم ، ضع علامة على أي معالم مفقودة أو محجوبة (بسبب طي الجناح أو تلفه) على أنها مفقودة في tpsDig بالنقر فوق الرمز M لاستبعادها من التحليل والاحتفاظ بالترتيب الصحيح للمعالم. انقر فوق السهم الأحمر المواجه لليمين لتكرار رقمنة المعالم للصور التالية حتى تكتمل جميع الصور الموجودة في الملف. احفظ الملف وأغلقه.
    ملاحظة: يجب إضافة المعالم إلى صورة الجناح بالترتيب الصحيح لكل صورة حتى تكون حسابات طول الجناح ومساحته وحجمه صحيحة.
11. احسب طول الجناح ومساحته باستخدام البرنامج النصي R المتوفر في الملف التكميلي 1 ، مع تعديل موقع ملف .tps ومقياس الصورة وفقا للتجربة.
12. احسب حجم الجناح المركزي ، وهو مقياس للحجم مستقل إحصائيا عن الشكل ، ويعرف بأنه الجذر التربيعي لمجموع المسافات التربيعية لكل معلم من نقطة مركز الجناح^28,29.
13. استخدم محاذاة procrustes المعممة لإزالة التباين غير الشكلي ورسم إحداثيات المعالم ، باستخدام الأجنحة التي تحتوي على جميع المعالم سليمة. لكل من حجم الجناح المركزي ومتوسط تحديد المعالم ، استخدم البرنامج النصي R المقدم في الملف التكميلي 2 ، مع تعديل موقع ملف .tps ومقياس الصورة وفقا للتجربة.

3. تقييم خصوبة البويضات

1. فقس بيض F₁ فردي من الأوراق التي تم جمعها من الإناث العازبات (التي تم جمعها في الخطوة 1) في حاويات أطعمة لذيذة شفافة من مادة البولي بروبيلين تحتوي على ~ 100 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم حديثا. أضف قطرتين أو ثلاث قطرات من ملاط طعام السمك المطحون لتغذية المخصص . قم بتبطين قمم الحاويات بشبكة أو أورجاندي ، وثبتها بشريط مطاطي.
2. في 2-3 أيام بعد الفقس ، قم بإزالة أوراق البيض من الماء واتركها تجف طوال الليل عن طريق وضعها في وعاء جديد مغطى بغطاء أو شبكة وتركها في الحشرة.
3. أعد تفريخ أوراق البيض في نفس الحاويات التي فقست فيها في البداية عن طريق وضعها مرة أخرى في وعاء الماء.
   ملاحظة: تجفيف وإعادة تفريخ أوراق البيض يحسن بشكل كبير من كفاءة الفقس. قد لا يكون هذا ضروريا لأنواع البعوض الأخرى.
4. في 3-5 أيام بعد الفقس الأولي ، افحص اليرقات بصريا (^{2 إلى 4 من} instar) بحثا عن علامة معدلة وراثيا (إن أمكن ؛ الشكل 6). افحص العديد من اليرقات تحت مجهر الفلورسنت في نفس الوقت عن طريق وضعها على قطعة من ورق الترشيح موضوعة فوق عضو أو شبكة مبطنة بمناشف ورقية. تمتص المناشف الورقية الماء الزائد ، بحيث يمكن استخدام ورق الترشيح لفحص اليرقات المجمدة ومعالجتها.
5. سجل عدد اليرقات المعدلة وراثيا الإيجابية أو السلبية. تخلص من اليرقات السلبية.
6. تنظيف مياه اليرقات لضمان أوقات النمو المثلى. للقيام بذلك ، ماصة اليرقات في كوب صغير ، وتجاهل المياه القذرة ، واستبدالها بماء الصنبور العذب أضف اليرقات الإيجابية وتأكد من توفر ما يكفي من ملاط طعام الأسماك المطحون.
7. احسب الخصوبة على أنها عدد اليرقات المعدلة وراثيا أو الضابطة مقسومة على إجمالي عدد البيض.

4. تحديد نسبة الجنس في الشرانق

1. حتى 14 يوما بعد الفقس ، استمر في جمع وتسجيل عدد الشرانق من الذكور والإناث (كما هو موضح في الخطوة 1.2.3). يمكن تجميع الإناث أو الذكور ، حسب الجنس ، في أكواب صغيرة موضوعة في حاويات سعة 1.9 لتر.
2. لتحديد نسبة الجنس ، أضف عدد إناث F₁ أو عدد ذكور F₁ التي تم جمعها عبر الجدول الزمني للدراسة لكل بعوضة أنثى بالغة. اقسم هذا الرقم على إجمالي عدد الشرانق التي تم جمعها لنفس خط البعوض الناتج من أنثى واحدة.

5. تحديد صلاحية اليرقات

1. لتحديد صلاحية اليرقات ، أضف العدد الإجمالي للشرانق التي تم جمعها عبر الجدول الزمني للدراسة لكل بعوضة أنثى بالغة.
2. اقسم هذا الرقم على إجمالي عدد اليرقات التي تم عدها لكل أنثى بعوضة بالغة لنفس الخط الذي تم حسابه في الخطوة 3.

6. تحديد وقت تطور اليرقات إلى الشرانق

1. لتحديد تطور اليرقات إلى الشرانق ، تتبع عدد اليرقات وعدد الشرانق لكل سطر يوميا.
2. احسب تطور اليرقات إلى الشرانق كمتوسط الوقت اللازم لتطور الشرانق بعد الفقس.

7. تحديد مساهمة الذكور

1. باستخدام الذكور المتطابقة مع العمر ، قم بتخدير ذكور البعوض البكر المعدلة وراثيا على الجليد ، وكذلك البعوض البكر البالغ من الذكور والإناث.
2. اعبر إما البالغين الذكور المحورين وراثيا أو الضابطين مع السيطرة على الإناث البالغات عن طريق إضافة 50 من الذكور المحورين وراثيا أو 50 من الذكور الضابطين (المطابقين للعمر) مع 100 أنثى ضابطة في علب 64 أونصة ، بحيث يكون هناك ما مجموعه 50 ذكرا مع 100 أنثى (إناث ضابطة: واحدة تحكم أو ذكر معدل وراثيا). تأكد من تسمية الكرتون الذي يحتوي على ذكور معدلة وراثيا وأي كرتون يحتوي على ذكور التحكم.
3. السماح بالتزاوج يحدث لمدة 2-3 أيام. بعد هذا الوقت ، قدم للبعوض وجبة دم وفقا لممارسات التربية القياسية.
4. بعد ثلاثة أيام من تغذية الدم ، افصل الإناث المحتقنة بالكامل إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل مبطنة بورق ترشيح أبيض مسمى مسبقا ، كما هو موضح في الخطوة 1 (فحص الخصوبة). تخلص من الإناث غير المغذيات أو قدم لهن وجبة دم أخرى في اليوم التالي. املأ جميع الأنابيب ب ~ 5 مل من ماء الصنبور. ضع قطعة صغيرة من الزبيب على الشبكة الموضوعة فوق كل أنبوب مخروطي.
5. اترك الإناث لمدة 1-2 أيام في الحشرة واسمح لهم بالبيض. فحص بصريا أوراق البيض لمدة 4-5 أيام بعد وجبة الدم للبيض. السماح للإناث يوم إضافي ل oviposit لزيادة معدلات وضع البيض.
6. لجمع أوراق البيض ، قم بتصريف الماء وتخدير الإناث عن طريق وضع أنابيب مخروطية عند 4 درجات مئوية ، كما هو موضح سابقا. تخلص من إناث البعوض عن طريق وضع 70٪ من الإيثانول.
7. اترك الأوراق في أنابيب في الحشرة لمدة 5 أيام على الأقل حتى تجف. استخدم ملقط لإزالة الأوراق ووضعها في حاويات أطعمة لذيذة شفافة من مادة البولي بروبيلين تحتوي على ~ 100 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم حديثا للتفقيس. أضف 2-3 قطرات من ملاط طعام الأسماك المطحون لتغذية المخصص . قم بتبطين قمم الحاويات بشبكة أو عضوي ، مثبتة بشريط مطاطي.
8. في 2-3 أيام بعد الفقس ، قم بإزالة أوراق البيض من الماء واتركها تجف طوال الليل عن طريق وضعها في وعاء جديد مغطى بغطاء أو شبكة ووضعها مرة أخرى في الحشرة.
9. أعد تفريخ أوراق البيض في نفس الحاويات عن طريق وضعها مرة أخرى في وعاء الماء.
10. في 3-5 أيام بعد الفقس الأولي ، افحص اليرقات بصريا (^{2 إلى 4 من} instar) بحثا عن علامة معدلة وراثيا (إن وجدت). احسب مساهمة الذكور على أنها عدد اليرقات المعدلة وراثيا F₂ مقسوما على عدد اليرقات الكلية لكل خط بعوضة.

8. تحديد طول عمر البعوض

1. نقل 50 من الذكور و 50 أنثى من WT أو البعوض المعدل وراثيا المطابق للعمر غير المغذي للدم إلى حاوية مناسبة. استخدم كرتون سعة 64 أونصة ، مع فتحة علوية مبطنة بخرطوم اللباس الداخلي ، ملتوية ومغلقة معقودة ، لسهولة الوصول والتلاعب بالبعوض مع تقدم التجربة (الشكل 7).
   ملاحظة: يوصى بالقيام بذلك في ثلاث نسخ للأغراض الإحصائية.
2. توفير مصدر للسكر والمياه. هنا ، تم استخدام الزبيب وكوب مملوء بالماء مبطن بشاش ، مثبت بشريطين مطاطيين.
3. تتبع عدد البعوض النافق من الذكور والإناث كل يوم. احسب طول العمر كمتوسط عدد الأيام التي مرت قبل موت البعوض عبر الأقفاص ، مع حذف البعوض الذي يموت لأسباب غير إعلامية (أسباب لا ترجع إلى عمر البعوض ، مثل السحق أو الغرق في السكر) وحذف البعوض الذي لا يزال على قيد الحياة في نهاية الدراسة.
   ملاحظة: يتم تعريف البقاء على قيد الحياة على أنه احتمال أن تكون على قيد الحياة حتى الوقت t ، أو الوظيفة S (t) = Pr (T>t). متوسط البقاء على قيد الحياة هو الوقت الذي يكون فيه احتمال البقاء على قيد الحياة 0.5 ، أو T_0.5 = ^S-1 x 0.5.

النتائج

باتباع البروتوكول المذكور أعلاه ، تم تقييم ملاءمة سلالتين من البعوض: (1) CRISPR / Cas9 بوساطة الضربة القاضية من Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424) بروتين لعابي و (2) Ae. خطوط aegypti التي تعبر عن محركات الجينات المستقلة بوساطة CRISPR / Cas9⁹. في الحالة الأولى ، تم إنشاء خط خروج المغلوب D7L1 متماثل الزيجوت م?...

Discussion

غالبا ما يتم إجراء دراسات اللياقة البدنية المصرية في المختبر لتقييم تكاليف اللياقة البدنية المرتبطة بالبضائع المعدلة وراثيا (على سبيل المثال ، عناصر محرك الجينات) أو الضربات القاضية الجينية ، كما تمت مناقشته في هذه المخطوطة ؛ ومع ذلك ، يمكن إجراء هذه الدراسات لمجموعة متنوعة من ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 oz. translucent plastic souffle cups	WebstaurantStore	301100PC
2 oz. translucent polystyrene souffle cups	WebstaurantStore	760P200N
3 mL plastic pipettors	Cornin	357524
50 mL conical tubes	Any brand
64 oz. white double poly-coated paper food cup	WebstaurantStore	999SOUP64WB	for mosquito enclosement
65 mm lens	Canon	MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo	Canon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
Aedes aegypti mosquitoes	BEI	multiple strains as eggs are available
Artifical membrane feeders	https://lillieglassblowers.com/	Meduim membrane feeder, Custom made, 33mm	Chemglass also offers, but sizes are wrong for us. Ours are about 3 cm?
ATP	MP Biomedical	ICN15026605	Any good quality ATP, 10mM filter sterile aliquots at -20
Autoclave			for sterilizing water for hatching
Canon EOS 7D camera	Canon	3814B004	for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
defibrinated sheep blood	Colorado Serum Co.	60 ml, every 2 weeks	https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
Dual Gooseneck Microscope Illuminator	Dolan Jenner Fiber-Lite 180	181-1 System
Ethanol
Forceps	Dumont	5SF
Gauze		omnisorb ii	4" non-woven sponges
glass microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Glass Petri dishes, 100 × 15 mm	VWR	75845-546	for anesthesizing/manipulating mosquitoes on ice
Hogs' gut	Any Deli		we buy in bulk, split, wash and store in small aliquots of ~4X12" at -20 in 50 ml conical
Ice
Ice bucket
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Leica GZ4 StereoZoom microscope			for screening transgenic mosquitoes (if applicable)
Paintbrush	AIT synthetic brush	size 10-0	for manipulating larvae/pupae (Amazon)
Panty hose	Walmart	L'eggs Everyday	Women's Nylon Plus Knee Highs Sheer Toe, 16 pairs (plus fits the carton)
Pencils	Any brand
Plastic containers for 2° storage of cartons	Walmart		Sterilite 58 Qt Storage Box Clear Base White Lid Set of 8
Plastic containers for growing larvae	Walmart		Sterilite 28 Qt. Storage Box Plastic, White, Set of 10
Plastic containers for hatching larvae	Walmart		Sterilite 6 Qt. Storage Box Plastic, White
polypropylene clear deli containers	WebstaurantStore	127DM12BULK	12 oz, or 16 oz if needed for bigger (127RD16BULK)
Rubber bands	Office Max	#100736/#909606 /#3777415	12", #64 and #10
Rubber stopper	VWR	217-0515	for mosquito enclosement
Sugar source, such as sugar cubes or raisins
Tetramin flake food	Tetramin	16106
tpsDig	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
tpsUtil	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
White organza fabric 8” × 8”	FabricWholesale.com	4491676	Joann Casa Collection Organza Fabric by Casa Collection
Whitman Grade 1 Qualitative Filter paper	Whitman	1001-824	for egg papers. The white color makes it easier to see the black eggs.