Quantificando os custos de aptidão em mosquitos Aedes aegypti transgênicos

Resumo

O presente protocolo descreve como medir dados de parâmetros de vida comuns em mosquitos Aedes aegypti , incluindo fecundidade, tamanho da asa, fertilidade, proporção sexual, viabilidade, tempos de desenvolvimento, contribuição masculina e longevidade adulta. Essas medições podem ser usadas para avaliar a aptidão de mosquitos transgênicos.

Resumo

Os mosquitos transgênicos geralmente apresentam custos de condicionamento físico em comparação com seus equivalentes do tipo selvagem. Nesse sentido, os estudos de custo de aptidão envolvem a coleta de dados de parâmetros de vida de mosquitos geneticamente modificados e a comparação com mosquitos sem transgenes do mesmo fundo genético. Este manuscrito ilustra como medir características comuns da história de vida no mosquito Aedes aegypti, incluindo fecundidade, tamanho e forma das asas, fertilidade, proporção sexual, viabilidade, tempos de desenvolvimento, contribuição masculina e longevidade adulta. Esses parâmetros foram escolhidos por refletirem o sucesso reprodutivo, serem simples de mensurar e serem comumente relatados na literatura. Os resultados representativos quantificam os custos de aptidão associados a um nocaute genético ou a uma única inserção de um elemento de condução genética. Padronizar como os dados dos parâmetros de vida são coletados é importante porque esses dados podem ser usados para comparar a saúde dos mosquitos transgênicos gerados em estudos ou para modelar a taxa de fixação do transgene em uma população simulada de mosquitos do tipo selvagem. Embora este protocolo seja específico para Aedes aegypti transgênico, o protocolo também pode ser usado para outras espécies de mosquitos ou outras condições experimentais de tratamento, com a ressalva de que certos contextos biológicos podem exigir adaptações especiais.

Introdução

A sobrevivência do mais apto é a ideia darwiniana de que os indivíduos que abrigam genes mais bem adaptados ao seu ambiente passarão esses genes para^{as gerações} subsequentes. Isso significa que é a aptidão que determina se seus genes sobreviverão. Esse conceito de mais de 150 anos é talvez o determinante mais significativo da engenharia de um gene drive bem-sucedido em mosquitos transgênicos. Os impulsos genéticos, ou o padrão de herança super-mendeliano de um elemento genético egoísta que permite que ele se espalhe pelas populações², estão sendo explorados para o manejo genético de pragas³. No contexto do controle vetorial, essa estratégia visa substituir os artrópodes do tipo selvagem (WT) por aqueles resistentes a patógenos (modificação populacional) ou eliminá-los todos juntos (supressão populacional)⁴. No entanto, os mosquitos transgênicos geralmente exibem custos de aptidão (também chamados de carga genética) em comparação com seus equivalentes WT, o que significa que o transgene será perdido em populações que podem superá-los. O acoplamento de transgenes com um sistema de gene drive é, portanto, necessário para compensar quaisquer custos de aptidão e empurrar o transgene pela população em níveis maiores do que o esperado da herança mendeliana típica⁴.

Estudos de laboratório em espécies de mosquitos vetores mostraram que os transgenes geralmente apresentam custos de aptidão ^5,6,7. Por exemplo, Irvin et al. mediram vários parâmetros de vida em Aedes (Ae.) aegypti projetados para expressar genes de proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP) ou transposase sob promotores de actina 5C ou 3XP3 sintéticos de Drosophila, e os compararam com a cepa Orlando do tipo selvagem (o mesmo fundo genético do qual foram derivados) ⁵. Mais notavelmente, eles descobriram que todas as cepas transgênicas reduziram significativamente a aptidão reprodutiva⁵. Dependentes do transgene, alguns mosquitos Anopheles (An.) que expressam transgenes que inibiram o desenvolvimento do parasita Plasmodium também exibiram custos de aptidão⁶. Especificamente, An. stephensi expressando uma fosfolipase de veneno de abelha (PLA2) sob promotores constitutivos ou induzíveis por farinha de sangue colocou significativamente menos ovos em comparação com os controles⁶. Esses autores também descobriram que Anopheles transgênicos expressando um transgene diferente, um tetrâmero de dodecapeptídeo SM1, não exibiram custos de adaptação, levando-os a concluir que os custos de adaptação conferidos pelo transgene dependem, pelo menos provavelmente em parte, do efeito da proteína transgênica produzida⁶. De fato, os custos de adaptação podem ser atribuídos a produtos transgênicos, efeitos posicionais, efeitos fora do alvo, mutagênese insercional ou efeitos de endogamia em cepas criadas em laboratório⁷. Os impulsos genéticos devem, portanto, ser robustos o suficiente para compensar esses custos de aptidão induzidos por transgenes, ao mesmo tempo em que evitam o desenvolvimento de inserções e deleções (indels) que bloqueiam o próprio impulso.

Os custos de desenvolvimento ou aptidão reprodutiva podem ser medidos em estudos de laboratório ou gaiola⁷, com a ressalva de que fatores desconhecidos no campo também podem ter impacto. No entanto, estudos controlados de aptidão são um primeiro passo importante ao planejar ou avaliar liberações de mosquitos geneticamente modificados, como um programa de genética dirigida, para determinar se a linha transgênica persistirá nas gerações subsequentes. Por exemplo, Hammond et al. avaliado Um gambiae CRISPR / Cas9-drives de genes destinados a interromper os genes necessários para a fertilidade feminina⁸. Por meio de estudos em gaiolas mantidos por pelo menos 25 gerações, os autores descobriram que os mosquitos incorriam em alelos resistentes à genética que bloqueavam a clivagem direcionada ao CRISPR e restauravam a fertilidade feminina⁸. Seus esforços de modelagem sugeriram que a fertilidade em fêmeas heterozigotas para o gene drive teve os impactos mais dramáticos na fixação do gene drive em condições simuladas⁸. Nessa mesma linha, Ae. aegypti (cepa de olho branco de Higgs, HWE) projetado para expressar de gene drive autônomo sob diferentes promotores ou em diferentes loci intergênicos exibiu diferentes taxas de fixação de gene drive em populações simuladas⁹. Usando a modelagem MGDrivE¹⁰, combinada com taxas medidas de formação de indel, efeitos maternos e dados de parâmetros de vida coletados em laboratório, os autores descobriram que a aptidão do mosquito influenciou mais fortemente a persistência do gene drive em condições simuladas⁹. Os custos de aptidão com maior probabilidade de prejudicar a eficiência do gene drive são atribuíveis à (super) expressão somática de Cas9 ou do gene que é direcionado, particularmente em heterozigotos, em vez do próprio impulso intrínseco 11,12,13,14,15,16,17.

Dada a sua importância, a aptidão é um fator importante para a capacidade de uma linhagem transgênica persistir nas gerações subsequentes e pode ser usada como um indicador de quaisquer efeitos fisiológicos associados a um transgene. Por exemplo, efeitos fora do alvo podem estar associados a custos de condicionamento físico. Nesse caso, recomenda-se o retrocruzamento de uma linhagem transgênica por várias gerações. Além disso, cruzar a linha transgênica com uma que reflita uma população de campo também pode ser necessário para investigar o quão bem a população transgênica pode competir no mundo real. Para quantificar os custos de aptidão para que possam ser comparáveis, este manuscrito fornece protocolos simples para medir características comuns de história de vida em mosquitos Ae. aegypti, com ênfase particular nos custos de aptidão associados aos transgenes, para que tais estudos possam ser mais facilmente reproduzidos. Os protocolos incluem fecundidade, fertilidade, proporção sexual, viabilidade, tempos de desenvolvimento, contribuição masculina e longevidade adulta. A medição do comprimento e da área da asa também foi escolhida como medida de aptidão, pois se correlaciona com o comprimento do tórax^18,19 e as medidas do tamanho do corpo, que estão diretamente ligadas ao tamanho do repasto sanguíneo, fecundidade e imunidade^20,21. Embora existam muitas maneiras de avaliar a aptidão, esses parâmetros foram escolhidos porque refletem o sucesso reprodutivo, são simples de medir e são comumente relatados na literatura.

Protocolo

NOTA: Este protocolo foi escrito para linhagens transgênicas e selvagens de Ae. aegypti que foram previamente validadas e estabelecidas. Para mais informações sobre a geração de Ae. aegypti transgênico, ver Kistler et al.²² e Coates et al.²³. Todos os experimentos descritos abaixo foram realizados sob procedimentos padrão de criação de Ae. aegypti . Os mosquitos foram mantidos a 28 °C com umidade relativa de 75% a 80% e um ciclo de 12 h de luz / 12 h de escuridão. Um mínimo de 100 papéis de ovo individuais por mancha de mosquito é altamente recomendado para fins estatísticos. Estudos abrangentes de condicionamento físico levam aproximadamente 3 meses para serem concluídos (Figura 1).

1. Medindo a fecundidade em mosquitos fêmeas

1. Choque mosquitos transgênicos e WT (do mesmo histórico genético, mas sem o transgene) colocando papéis de ovo em água estéril durante a noite no insetário, seguindo as condições padrão de criação. Permita que as larvas se alimentem ad libitum , fornecendo várias gotas (cada uma com cerca de 50 μL) de chorume de ração para peixes moídos (Tetramin) (aproximadamente 30% p / v). As larvas do primeiro ínstar são reconhecíveis 1 dia após a eclosão. Coloque as larvas em recipientes maiores para que não haja aglomeração, geralmente 100-150 larvas podem ser criadas em um volume de 1 L de água com uma área de superfície de cerca de 250 cm². Continue a fornecer chorume de Tetramin como fonte de alimento, permitindo que as larvas se alimentem ad libitum. Adicione a pasta de alimentos em gotículas discretas para que haja alimento suficiente sempre disponível para as larvas e para que a água não pareça turva. As larvas aumentarão de tamanho a cada ínstar e, por fim, entrarão em pupação nas bacias larvais.
2. Assim que as pupas começarem a emergir, ~ 5-6 dias após a eclosão, separe-as por sexo para garantir que os adultos sejam virgens assim que emergirem (para o acasalamento subsequente), conforme descrito abaixo.
   1. Para classificar as pupas por sexo, comece colhendo as pupas usando pipetadores de plástico de 3 mL em pequenos copos plásticos contendo água limpa da torneira. As pupas masculinas tendem a ser menores e tendem a emergir primeiro em comparação com as fêmeas. Primeiro, classifique as pupas por tamanho e, em seguida, confirme essa triagem inicial por morfologia.
   2. Mova a pupa para uma lâmina de microscópio de vidro e remova o excesso de água com um lenço de papel. Isso imobiliza a pupa. Sob um estereoscópio com ampliação de 2x-4x, posicione o lado ventral da pupa para cima usando um pincel de ponta fina.
   3. Analise visualmente a cauda em busca de diferenças na forma do lobo genital (no final dos segmentos abdominais da pupa atrás das pás; Figura 2). As fêmeas têm barbatanas pontiagudas que se estendem além dos lobos genitais, lembrando aproximadamente uma coroa ou dentes de vampiro, enquanto os lobos genitais masculinos são arredondados e não possuem essas estruturas pontiagudas. Ver Carvalho et al.²⁴ para números adicionais.
3. Coloque as pupas masculinas e femininas em copos de água separados e coloque-as em contenção adequada, por exemplo, caixas de 1,9 L (1/2 galão ou 64 onças) com tecido de organdi branco de 0,2 m x 0,2 m (8 pol x 8 pol.), cada um contendo ~ 150 pupas.
4. Forneça uma fonte de açúcar e água em cima das gaiolas (por exemplo, passas e um copo cheio de água coberto com gaze, preso com dois elásticos). Faça um orifício do tamanho de uma caneta nas caixas e cubra-o com uma rolha de borracha para que pupas adicionais possam ser adicionadas às gaiolas à medida que emergem.
5. Aos 3-5 dias após a emergência adulta, anestesiar os mosquitos colocando as caixas a 4 °C por ~2-5 min. Embora ainda possam se contorcer, os mosquitos são suficientemente anestesiados quando a maioria cai no fundo da caixa. Coloque os mosquitos em uma placa de Petri de vidro no gelo por ~ 30 min-1 h.
   NOTA: Deixar os mosquitos a 4 °C por muito tempo pode afetar significativamente sua saúde, embora não tenhamos encontrado nenhum impacto se eles forem deixados no gelo por até 1 h.
6. Cruze machos WT ou transgênicos GD1 ou^{GD2 9} (CRISPR / Cas-9-based-gene drive) em massa com fêmeas virgens WT (controle) adicionando mosquitos anestesiados em proporções de cinco machos WT ou transgênicos para uma fêmea WT em caixas de mosquitos, cada uma contendo ~ 150 mosquitos. Certifique-se de rotular as gaiolas por tipo masculino.
   NOTA: Este esquema de cruzamento é para determinar a aptidão para GD1 ou GD2⁹ hemizigotos (ou seja, mosquitos que abrigam uma cópia do transgene). Para determinar a aptidão para linhagens transgênicas homozigóticas, o esquema de cruzamento pode ser adaptado para que machos e fêmeas transgênicos possam acasalar em comparação com cruzamentos de machos e fêmeas WT.
7. Após 2-3 dias, o sangue alimenta as fêmeas seguindo as práticas padrão de criação²⁵ , fornecendo uma fonte de sangue no topo da gaiola. Remova a fonte de açúcar 24 h antes da alimentação com sangue e a fonte de água ~ 2-3 h antes da alimentação com sangue para aumentar a eficiência da alimentação.
8. Após a alimentação com sangue, anestesiar os mosquitos colocando-os a 4 °C, como no passo 1.5.
9. Separe as fêmeas alimentadas com sangue (totalmente ingurgitadas) das fêmeas não alimentadas, examinando visualmente seus abdômens em busca de ingurgitamento. Descarte os não alimentados, parcialmente alimentados e os machos.
10. Coloque as fêmeas ingurgitadas de volta em suas respectivas gaiolas e forneça uma fonte de açúcar e água em cima das gaiolas.
11. Após 2-3 dias, coloque as fêmeas individuais em tubos cônicos de 50 mL forrados com papel de filtro pré-rotulado a lápis (Figura 3). Cubra os tubos cônicos com malha e sele com dois elásticos.
12. Quando as fêmeas estiverem acordadas, encha todos os tubos com ~ 5 mL de água da torneira. Coloque um pequeno pedaço de passas ou bola de algodão embebida em açúcar em cima de cada tubo cônico. Deixe as fêmeas por 1-2 dias no insetário e deixe-as ovipositar.
13. Após 1-2 dias, drene cada tubo cônico e anestesie os mosquitos, colocando-os a 4 °C. Para um processamento rápido, use a ponta de um pipetador de plástico de 3 mL pressionado contra a malha para drenar a água de cada tubo cônico. Gire os tubos de cabeça para baixo e coloque-os em cima de uma toalha de papel para escorrer. Coloque os tubos cônicos de 50 mL em um suporte de tubo e coloque o rack a 4 °C.
14. Recolha o papel de ovo e conte o número de ovos em cada papel. Conte as fêmeas que não põem ovos como 0 e inclua-as na análise. Calcule a fecundidade média como o número total de ovos contados em cada papel dividido pelo número total de fêmeas rastreadas.
    NOTA: As imagens digitais dos papéis individuais dos ovos individuais podem servir como um registro visual para confirmação da contagem (Figura 4).
15. Seque os papéis de ovo e coloque-os de volta no insetário. Recomenda-se que os papéis de ovo sequem por pelo menos 3-5 dias para uma eclosão ideal²⁵.

2. Medindo o comprimento, a área e o tamanho do centróide da asa

1. Congele pelo menos 25 WT ou fêmeas alimentadas com sangue transgênico da mesma idade do estudo de fecundidade concluído, colocando as gaiolas de mosquito a -20 ° C por aproximadamente 15 min.
   NOTA: Não congele por um longo período de tempo e não agite ou deixe cair o recipiente, pois isso pode fazer com que as asas caiam dos mosquitos.
2. Dissecar a asa esquerda de cada mosquito, extirpando a articulação da asa e do tórax, retirando a totalidade da asa, seguindo o protocolo abaixo.
   1. Em uma mão, segure o mosquito com uma pinça, segurando a região do tórax sob as asas.
   2. Usando outro par de pinças na outra mão, disseque a asa esquerda de cada mosquito, extirpando a articulação da asa e do tórax usando uma leve pressão para puxar a asa, removendo toda a asa sem rasgar as veias das asas.
3. Usando uma pinça, coloque a asa em uma lâmina de vidro, deitada. Usando uma pipeta de transferência, adicione uma gota de uma solução estoque de 15 mL, composta de etanol a 70%, e uma gota de detergente na asa da lâmina.
4. Adicione uma gota de glicerol a 80% à lamínula e coloque no topo da asa na solução de etanol e sabão.
5. Fotografe as asas montadas nos slides usando uma câmera com lente de 65 mm (7D-65 mm-1x; zoom = 1.200, 6.3, ISO = 100). Observe a escala de pixels/mm e certifique-se de que ela permaneça a mesma para todas as imagens. Se várias asas forem fotografadas juntas, corte as fotos em asas individuais e adicione barras de escala a cada foto. Salve as imagens no formato TIFF com compactação LZW, com cada imagem claramente rotulada com todas as informações para a asa individual.
   NOTA: As asas podem ser fotografadas usando uma câmera e ampliação diferentes ou com uma câmera acoplada a um microscópio para outros estudos, se as configurações permanecerem as mesmas e a escala de pixels/mm permanecer a mesma para cada asa fotografada no estudo. A relação pixel/mm será considerada ao determinar as medições.
6. Baixe tpsUtil e tpsDig, que são softwares gratuitos de processamento de imagens morfométricas. Consulte Rohlf ^26,27 para obter informações mais detalhadas sobre o software.
7. Digitalize as asas usando tpsUtil para criar um arquivo TPS das fotografias das asas para a próxima etapa da digitalização.
   1. Para fazer isso, abra tpsUtil e, em operação, selecione Construir arquivo tps a partir de imagens. Clique em entrada, selecione o arquivo que contém as imagens individuais da asa e, em seguida, selecione qualquer imagem para escolher esta pasta. Clique em saída e nomeie o arquivo que será criado no formato .tps. Clique em salvar.
   2. Em seguida, em ações, clique em configuração. Selecione Incluir tudo, clique em criar e feche a caixa pop-up. Em operação, agora selecione Ordenar amostras aleatoriamente. Clique em entrada e selecione o arquivo .tps que acabou de ser criado. Clique em saída, renomeie o arquivo .tps para indicar que esta é a versão do arquivo com as amostras aleatórias e clique em salvar. Em seguida, clique em Criar. Feche o programa tpsUtil.
      NOTA: Para reduzir o erro de medição, as fotos da asa podem ser duplicadas e utilizadas duas vezes para uma réplica técnica.
8. Use o software tpsDig para identificar coordenadas cartesianas bidimensionais para os pontos de referência. Em entrada, selecione o arquivo .tps criado na etapa 2.7. Defina a escala para a escala determinada pela etapa 2.5; Em Opções, selecione Ferramentas de Imagem e clique em Medir.
9. Adicione pontos de referência à imagem clicando no ícone de mira azul que representa os pontos de referência digitalizados e, em seguida, clique nas juntas das asas indicadas na Figura 5, em ordem do Ponto de Referência 1 ao Ponto de Referência 14.
   NOTA: Esses pontos de referência foram escolhidos porque já foram usados na digitalização e análise de marcos de asa¹⁹, são fáceis de localizar nas juntas das veias das asas em muitas amostras e fornecem pontos de referência de asa suficientes para capturar o tamanho e a forma da asa.
10. Ao marcar pontos de referência, marque quaisquer pontos de referência ausentes ou obscurecidos (devido a dobras ou danos nas asas) como ausentes no tpsDig clicando no ícone M para excluí-los da análise e manter a ordem correta dos pontos de referência. Clique na seta vermelha voltada para a direita para repetir a digitalização do ponto de referência para as próximas imagens até que todas as imagens no arquivo tenham sido concluídas. Salve e feche o arquivo.
    NOTA: Os pontos de referência devem ser adicionados à imagem da asa na ordem correta para cada imagem para que os cálculos do comprimento, área e tamanho da asa estejam corretos.
11. Calcule o comprimento e a área da asa usando o script R fornecido no Arquivo Suplementar 1, modificando para a localização do arquivo .tps e a escala da imagem de acordo com o experimento.
12. Calcule o tamanho do centróide da asa, uma medida de tamanho estatisticamente independente da forma, definida como a raiz quadrada da soma das distâncias quadradas de cada um dos pontos de referência do ponto central da asa^28,29.
13. Use um alinhamento de procusto generalizado para remover a variação sem forma e traçar coordenadas médias de pontos de referência, usando asas que tenham todos os pontos de referência intactos. Para o tamanho do centróide da asa e a determinação média do ponto de referência, use o script R fornecido no Arquivo Suplementar 2, modificando para o local do arquivo .tps e a escala da imagem de acordo com o experimento.

3. Avaliação da fertilidade do óvulo

1. Choque os ovos F₁ individuais dos papéis coletados de fêmeas solteiras (coletados na etapa 1) em recipientes transparentes de polipropileno contendo ~ 100 mL de água deionizada recém-esterilizada. Adicione duas ou três gotas de pasta de comida de peixe moída para alimentação ad libitum . Forre a parte superior dos recipientes com malha ou organdi e prenda com um elástico.
2. Aos 2-3 dias após a eclosão, remova os papéis de ovo da água e deixe-os secar durante a noite, colocando-os em um novo recipiente coberto com uma tampa ou rede e deixando-os no insetário.
3. Choque novamente os papéis de ovo nos mesmos recipientes em que foram inicialmente chocados, colocando-os de volta no recipiente de água.
   NOTA: Secar e chocar novamente os papéis de ovo melhora muito a eficiência da eclosão. Isso pode não ser necessário para outras espécies de mosquitos.
4. De 3 a 5 dias após a eclosão inicial, inspecione visualmente as larvas (^2º a^4º ínstar) em busca de um marcador transgênico (se aplicável; Figura 6). Inspecione várias larvas sob um microscópio fluorescente ao mesmo tempo, colocando-as em um pedaço de papel de filtro colocado em cima de um organdi ou malha forrada com toalhas de papel. As toalhas de papel absorvem o excesso de água, de modo que o papel de filtro pode ser usado para peneirar e manipular as larvas imobilizadas.
5. Registre o número de larvas transgênicas positivas ou negativas. Descarte as larvas negativas.
6. Limpe a água larval para garantir tempos de desenvolvimento ideais. Para fazer isso, pipete as larvas em um copo pequeno, descarte a água suja e substitua-a por água fresca da torneira Adicione as larvas positivas e certifique-se de que haja lama suficiente para ração de peixe moída.
7. Calcule a fertilidade como o número de larvas transgênicas ou de controle dividido pelo número total de ovos.

4. Determinação da proporção sexual nas pupas

1. Até 14 dias após a eclosão, continue coletando e registrando o número de pupas masculinas e femininas (conforme descrito na etapa 1.2.3). Fêmeas ou machos podem ser agrupados, por sexo, em pequenos copos alojados em recipientes de 1,9 L.
2. Para determinar a proporção sexual, adicione o número de fêmeas F₁ ou o número de machos F₁ coletados ao longo da linha do tempo do estudo por mosquito fêmea adulto individual. Divida esse número pelo número total de pupas coletadas para a mesma linhagem de mosquito gerada a partir de uma única fêmea.

5. Determinação da viabilidade das larvas

1. Para determinar a viabilidade das larvas, adicione o número total de pupas coletadas ao longo da linha do tempo do estudo por mosquito fêmea adulto individual.
2. Divida esse número pelo número total de larvas contadas por mosquito fêmea adulta individual para a mesma linha contada na etapa 3.

6. Determinação do tempo de desenvolvimento larva-pupa

1. Para determinar o desenvolvimento de larvas para pupas, acompanhe o número de larvas e o número de pupas por linha diariamente.
2. Calcule o desenvolvimento de larvas para pupas como o tempo médio para o desenvolvimento de pupas após a eclosão.

7. Determinação da contribuição masculina

1. Usando machos da mesma idade, anestesiar mosquitos machos transgênicos virgens adultos no gelo, bem como mosquitos de controle machos e fêmeas virgens adultos.
2. Cruze os adultos transgênicos ou do sexo masculino de controle com as fêmeas de controle, adicionando 50 machos transgênicos ou 50 machos de controle (pareados por idade) com 100 fêmeas de controle em caixas de 64 onças, de modo que haja um total de 50 machos com 100 fêmeas (duas fêmeas de controle: um macho de controle ou transgênico). Certifique-se de rotular qual caixa contém machos transgênicos e qual cartonagem contém machos de controle.
3. Deixe o acasalamento ocorrer por 2-3 dias. Após esse período, ofereça aos mosquitos uma refeição de sangue seguindo as práticas padrão de criação.
4. Três dias após a alimentação com sangue, separe as fêmeas individuais totalmente ingurgitadas em tubos cônicos de 50 mL revestidos com papel de filtro branco pré-rotulado, conforme descrito na etapa 1 (ensaio de fecundidade). Descarte as fêmeas não alimentadas ou ofereça-lhes outra refeição de sangue no dia seguinte. Encha todos os tubos com ~ 5 mL de água da torneira. Coloque um pequeno pedaço de passas na malha colocada em cima de cada tubo cônico.
5. Deixe as fêmeas por 1-2 dias no insetário e deixe-as ovipositar. Inspecione visualmente os papéis de ovo por 4-5 dias após a refeição de sangue para ovos. Dê às fêmeas um dia adicional para ovipositar para aumentar as taxas de postura de ovos.
6. Para coletar os papéis dos ovos, drene a água e anestesie as fêmeas colocando tubos cônicos a 4 °C, conforme descrito anteriormente. Descarte os mosquitos fêmeas colocando etanol a 70%.
7. Deixe os papéis em tubos no insetário por pelo menos 5 dias para secar. Use uma pinça para remover os papéis e coloque-os em recipientes transparentes de polipropileno contendo ~ 100 mL de água deionizada recém-esterilizada para incubação. Adicione 2-3 gotas de pasta de ração para peixes moídos para alimentação ad libitum . Forre os topos dos recipientes com malha ou organdi, presos com um elástico.
8. Aos 2-3 dias após a eclosão, remova os papéis de ovo da água e deixe-os secar durante a noite, colocando-os em um novo recipiente coberto com uma tampa ou rede e colocando-os de volta no inseto.
9. Choque novamente os papéis de ovo nos mesmos recipientes, colocando-os de volta no recipiente de água.
10. Aos 3-5 dias após a eclosão inicial, inspecione visualmente as larvas (^2º a^4º ínstar) em busca de um marcador transgênico (se aplicável). Calcule a contribuição masculina como o número de larvas transgênicas F₂ dividido pelo número de larvas totais por linhagem de mosquito.

8. Determinação da longevidade do mosquito

1. Transfira 50 mosquitos WT machos e 50 fêmeas ou transgênicos alimentados com sangue para um recinto adequado. Use caixas de 64 onças, com a abertura superior forrada com meia-calça, torcida e fechada com nós, para facilitar o acesso e a manipulação dos mosquitos à medida que o experimento avança (Figura 7).
   NOTA: Recomenda-se fazer isso em triplicado para fins estatísticos.
2. Forneça uma fonte de açúcar e água. Aqui, foram utilizadas passas e um copo cheio de água forrado com gaze, preso com dois elásticos.
3. Rastreie o número de mosquitos machos e fêmeas mortos a cada dia. Calcule a longevidade como o número médio de dias passados antes que os mosquitos morram nas gaiolas, omitindo mosquitos que morrem de causas não informativas (causas não devidas à expectativa de vida do mosquito, como ser esmagado ou se afogar em açúcar) e omitindo mosquitos que ainda estão vivos no final do estudo.
   NOTA: A sobrevivência é definida como a probabilidade de estar vivo até o tempo t, ou a função S(t) = Pr(T>t). A sobrevida mediana é o momento em que a probabilidade de sobrevivência é de 0,5, ou T_0,5 = ^S-1 x 0,5.

Resultados

Seguindo o protocolo acima, a aptidão de duas linhagens de mosquitos foi avaliada: (1) knock out mediado por CRISPR/Cas9 da proteína salivar D7L1 (AAEL006424) de Ae. aegypti e (2) linhagens de Ae. aegypti expressando unidades gênicas autônomas mediadas por CRISPR/Cas9⁹. No caso do primeiro, uma linha de knock-out D7L1 homozigótica foi estabelecida explorando a via de junção final não homóloga (NHEJ) para gerar a interrupção após microinjetar embriões com sgRNAs espec...

Discussão

Os estudos de aptidão de Ae. aegypti são frequentemente realizados em laboratório para avaliar os custos de aptidão associados à carga transgênica (por exemplo, elementos de genética dirigida) ou nocautes genéticos, conforme discutido neste manuscrito; no entanto, esses estudos podem ser realizados para uma variedade de propósitos - qualquer um que vise avaliar a saúde de um grupo de Ae. aegypti, como infectado por Wolbachia ^30,31

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 oz. translucent plastic souffle cups	WebstaurantStore	301100PC
2 oz. translucent polystyrene souffle cups	WebstaurantStore	760P200N
3 mL plastic pipettors	Cornin	357524
50 mL conical tubes	Any brand
64 oz. white double poly-coated paper food cup	WebstaurantStore	999SOUP64WB	for mosquito enclosement
65 mm lens	Canon	MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo	Canon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
Aedes aegypti mosquitoes	BEI	multiple strains as eggs are available
Artifical membrane feeders	https://lillieglassblowers.com/	Meduim membrane feeder, Custom made, 33mm	Chemglass also offers, but sizes are wrong for us. Ours are about 3 cm?
ATP	MP Biomedical	ICN15026605	Any good quality ATP, 10mM filter sterile aliquots at -20
Autoclave			for sterilizing water for hatching
Canon EOS 7D camera	Canon	3814B004	for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
defibrinated sheep blood	Colorado Serum Co.	60 ml, every 2 weeks	https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
Dual Gooseneck Microscope Illuminator	Dolan Jenner Fiber-Lite 180	181-1 System
Ethanol
Forceps	Dumont	5SF
Gauze		omnisorb ii	4" non-woven sponges
glass microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Glass Petri dishes, 100 × 15 mm	VWR	75845-546	for anesthesizing/manipulating mosquitoes on ice
Hogs' gut	Any Deli		we buy in bulk, split, wash and store in small aliquots of ~4X12" at -20 in 50 ml conical
Ice
Ice bucket
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Leica GZ4 StereoZoom microscope			for screening transgenic mosquitoes (if applicable)
Paintbrush	AIT synthetic brush	size 10-0	for manipulating larvae/pupae (Amazon)
Panty hose	Walmart	L'eggs Everyday	Women's Nylon Plus Knee Highs Sheer Toe, 16 pairs (plus fits the carton)
Pencils	Any brand
Plastic containers for 2° storage of cartons	Walmart		Sterilite 58 Qt Storage Box Clear Base White Lid Set of 8
Plastic containers for growing larvae	Walmart		Sterilite 28 Qt. Storage Box Plastic, White, Set of 10
Plastic containers for hatching larvae	Walmart		Sterilite 6 Qt. Storage Box Plastic, White
polypropylene clear deli containers	WebstaurantStore	127DM12BULK	12 oz, or 16 oz if needed for bigger (127RD16BULK)
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Sugar source, such as sugar cubes or raisins
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