형질전환 Aedes aegypti 모기의 피트니스 비용 정량화

요약

본 프로토콜은 Aedes aegypti 모기의 생식력, 날개 크기, 생식력, 성비, 생존 능력, 발달 시간, 수컷 기여도 및 성체 수명을 포함한 일반적인 생명 매개 변수 데이터를 측정하는 방법을 설명합니다. 이러한 측정은 유전자 변형 모기의 적합성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

형질전환 모기는 야생형 모기에 비해 체력 단련 비용이 많이 드는 경우가 많습니다. 이와 관련하여, 적합성 비용 연구는 유전자 변형 모기로부터 생명 매개변수 데이터를 수집하고, 이를 동일한 유전적 배경에서 전이유전자가 없는 모기와 비교하는 것을 포함한다. 이 원고는 번식력, 날개 크기 및 모양, 생식력, 성비, 생존 가능성, 발달 시간, 수컷 기여도 및 성인 수명을 포함하여 모기 Aedes aegypti의 일반적인 생활사 특성을 측정하는 방법을 보여줍니다. 이러한 매개변수는 번식 성공을 반영하고 측정이 간단하며 일반적으로 문헌에 보고되기 때문에 선택되었습니다. 대표적인 결과는 유전자 knock-out 또는 유전자 구동 요소의 단일 삽입과 관련된 적합성 비용을 정량화합니다. 생명 매개 변수 데이터 수집 방법을 표준화하는 것이 중요한데, 이러한 데이터는 여러 연구에서 생성된 형질전환 모기의 건강 상태를 비교하거나 시뮬레이션된 야생형 모기 개체군에서 전이유전자 고정률을 모델링하는 데 사용될 수 있기 때문입니다. 이 프로토콜은 유전자 변형 Aedes aegypti에 특이적이지만, 특정 생물학적 맥락에 따라 특별한 적응이 필요할 수 있다는 경고와 함께 다른 모기 종 또는 기타 실험적 치료 조건에도 사용될 수 있습니다.

서문

적자생존(survival of the fittest)은 환경에 가장 잘 적응된 유전자를 가진 개체가 그 유전자를 다음 세대에 물려준다는 다윈의 생각이다¹. 이것은 그들의 유전자가 생존할 것인지를 결정하는 것이 적합성이라는 것을 의미한다. 150년 이상 된 이 개념은 아마도 형질전환 모기에서 성공적인 유전자 드라이브를 엔지니어링하는 데 있어 가장 중요한 결정 요인일 것입니다. 유전자 드라이브(gene drives) 또는 이기적인 유전 요소가 개체군을 통해 퍼질 수 있도록 하는 슈퍼 멘델 유전 패턴(super-Mendelian inheritance pattern)²이 유전적 해^{충 관리를 위해} 연구되고 있다3. 매개체 통제의 맥락에서 이 전략은 야생형(WT) 절지동물을 병원체에 내성이 있는 절지동물로 대체하거나(개체군 수정) 모두 제거(개체군 억제)하는 것을 목표로 합니다(개체군 억제)⁴. 그러나 형질전환 모기는 WT 모기에 비해 적합성 비용(유전적 부하라고도 함)을 보이는 경우가 많으며, 이는 형질전환 유전자가 그들을 능가할 수 있는 개체군에서 손실될 것임을 의미합니다. 따라서 전이유전자를 유전자 구동 시스템과 결합하는 것은 적응 비용을 상쇄하고 전형적인 멘델 유전에서 기대되는 것보다 더 높은 수준으로 전이유전자를 집단을 통해 밀어내기 위해 필요하다⁴.

모기 매개체 종에 대한 실험실 연구는 전이 유전자가 종종 적합성 비용 ^5,6,7을 표시한다는 것을 보여주었습니다. 예를 들어, Irvin et al. Drosophila actin 5C 또는 합성 3XP3 프로모터에서 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP) 또는 transposase 유전자를 발현하도록 조작된 Aedes(Ae.) aegypti에서 다양한 생명 매개변수를 측정하고 이를 야생형 Orlando 균주(파생된 것과 동일한 유전적 배경)^와 비교했습니다5. 가장 주목할 만한 것은, 모든 유전자 변형 균주가 생식 적합성을 현저히 감소시킨다는 것을 발견했다⁵. 전이유전자에 따라, Plasmodium 기생충 발달을 억제하는 전이유전자를 발현하는 일부 Anopheles (An.) 모기도 적합성 비용을 나타냈다⁶. 구체적으로, 구성적 또는 혈액 가루 유발 프로모터에서 봉독 포스포리파아제(PLA2)를 발현하는 An. stephensi^{는 대조군}에 비해 현저히 적은 수의 난자를 낳았다6. 저자들은 또한 다른 전이유전자인 SM1 도데카펩타이드 테트라머를 발현하는 형질전환 아노펠레스(transgenic Anopheles)가 적합성 비용을 나타내지 않는다는 것을 발견했으며, 이로 인해 형질전환유전자가 부여하는 적합성 비용이 적어도 부분적으로는 생성된 형질전환 단백질의 효과에 의존한다는 결론을 내렸습니다⁶. 실제로, 적합성 비용은 전이유전자 산물, 위치 효과, off-target 효과, 삽입 돌연변이 유발 또는 실험실 사육 균주에서의 근친 교배 효과에 기인할 수 있다⁷. 따라서 유전자 드라이브는 이러한 유전자 변형으로 인한 적합성 비용을 상쇄할 수 있을 만큼 충분히 견고해야 하며, 드라이브 자체를 차단하는 삽입 및 삭제(indel)의 발생을 방지해야 합니다.

발달 또는 생식 적합성 비용은 실험실 또는 케이지 연구에서 측정할 수 있으며⁷ 현장에서 알려지지 않은 요인도 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의해야 한다. 그럼에도 불구하고, 통제된 적합성 연구는 유전자 드라이브 프로그램과 같은 유전자 변형 모기 방출을 계획하거나 평가할 때 형질전환 계통이 다음 세대에 걸쳐 지속되는지 여부를 결정하기 위한 중요한 첫 번째 단계입니다. 예를 들어, Hammond et al. 여성의 생식력에 필요한 유전자를 파괴하기 위한 감비아 CRISPR/Cas9 기반 유전자 드라이브 평가⁸. 적어도 25세대에 걸쳐 유지된 케이지 연구를 통해, 저자들은 모기가 CRISPR 표적 분열을 차단하고 암컷의 생식력을 회복시키는 유전자 구동 저항성 대립유전자를 발생시킨다는 것을 발견했다⁸. 그들의 모델링 노력은 유전자 드라이브에 대한 이형접합 암컷의 생식력이 시뮬레이션된 조건에서 유전자 드라이브 고정에 가장 극적인 영향을 미친다는 것을 시사했다⁸. 이와 같은 맥락에서, 서로 다른 프로모터 또는 다른 유전자 간 유전자좌에서 자율 유전자 구동 카세트를 발현하도록 설계된 Ae. aegypti(Higgs' White Eye strain, HWE)는 시뮬레이션된 집단에서 서로 다른 유전자 구동 고정률을 나타냈다⁹. 저자들은 MGDrivE 모델링¹⁰을 사용하여 측정된 indel 형성 속도, 모성 효과 및 실험실에서 수집한 생명 매개변수 데이터와 결합하여 모기의 적합성이 시뮬레이션된 조건에서 유전자 드라이브의 지속성에 가장 큰 영향을 미친다는 것을 발견했습니다⁹. 유전자 드라이브 효율성을 손상시킬 가능성이 가장 높은 적합성 비용은 내재적 드라이브 자체보다는 체세포 Cas9(과잉) 발현 또는 표적화된 유전자, 특히 이형접합체에서 기인합니다 11,12,13,14,15,16,17.

그 중요성을 감안할 때, 적합성은 형질전환 계통이 다음 세대에 걸쳐 지속될 수 있는 능력에 대한 중요한 요소이며, 전이 유전자와 관련된 모든 생리학적 효과에 대한 지표로 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 오프 타겟 효과는 피트니스 비용과 관련이 있을 수 있습니다. 이 경우, 여러 세대에 걸쳐 형질전환 계통을 역교배하는 것이 권장됩니다. 더욱이, 현장 집단을 반영하는 것과 형질전환 선을 교차하는 것은 형질전환 집단이 실제 세계에서 얼마나 잘 경쟁할 수 있는지 조사하기 위해 필요할 수도 있습니다. 적합성 비용을 정량화하여 비교할 수 있도록 하기 위해 이 원고는 Ae. Aegypti 모기의 일반적인 생활사 특성을 측정하기 위한 간단한 프로토콜을 제공하며, 특히 형질전환 유전자와 관련된 적합성 비용에 중점을 두어 이러한 연구를 보다 쉽게 재현할 수 있습니다. 프로토콜에는 생식력, 출산력, 성비, 생존 가능성, 발달 시간, 남성 기여도 및 성인 수명이 포함됩니다. 날개 길이와 면적을 측정하는 것은 흉부 길이^18,19 및 신체 크기 측정과 관련이 있기 때문에 체력 측정으로 선택되었으며, 이는 혈중 크기, 생식력 및 면역^20,21과 직접적인 관련이 있습니다. 체력을 평가하는 방법에는 여러 가지가 있지만, 이러한 매개변수는 생식 성공을 반영하고 측정이 간단하며 일반적으로 문헌에 보고되기 때문에 선택되었습니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜은 이전에 검증되고 확립된 형질전환 및 야생형 Ae. aegypti 라인에 대해 작성되었습니다. 형질전환 Ae. aegypti 생성에 대한 자세한 정보는 Kistler et al.²² 및 Coates et al.²³. 아래에 요약된 모든 실험은 표준 Ae. aegypti 사육 절차에 따라 수행되었습니다. 모기는 75%-80%의 상대 습도와 12시간 밝음/12시간 어두운 주기로 28°C로 유지되었습니다. 통계 목적으로 모기 염색 당 최소 100 개의 개별 계란 종이가 권장됩니다. 종합적인 피트니스 연구는 완료하는 데 약 3개월이 걸립니다(그림 1).

1. 암컷 모기의 번식력 측정

1. 형질전환 모기와 WT 모기(유전적 배경은 동일하지만 전이유전자가 없음)를 표준 사육 조건에 따라 곤충의 멸균수에 밤새 넣어 부화시킵니다. 갈은 생선 음식(테트라민) 슬러리(약 50% w/v)를 여러 방울(각각 약 30μL)을 제공하여 유충이 즉시 먹이를 먹을 수 있도록 합니다. 첫 번째 인스타 유충은 부화 후 1일 후에 알아볼 수 있습니다. 유충을 더 큰 용기에 넣어 붐비지 않도록 하며, 일반적으로 100-150마리의 유충을 약 250cm^의 표면적을 가진 1L의 물에서 키울 수 있습니다2. 테트라민 슬러리를 먹이 공급원으로 계속 제공하여 유충이 즉시 먹을 수 있도록 합니다. 유충이 항상 충분한 음식을 사용할 수 있고 물이 뿌옇게 보이지 않도록 식품 슬러리를 별개의 물방울에 추가하십시오. 유충은 각 인스타와 함께 크기가 커지고 궁극적으로 유충 팬에서 번데기로 들어갑니다.
2. 번데기가 나오기 시작하면 부화 후 5~6일 후에 성별로 분리하여 아래에 설명된 대로 성체가 출현할 때(후속 짝짓기를 위해) 처녀인지 확인합니다.
   1. 번데기를 성별에 따라 분류하려면 먼저 3mL 플라스틱 피펫터를 사용하여 깨끗한 수돗물이 들어 있는 작은 플라스틱 컵에 번데기를 집습니다. 수컷 번데기는 암컷에 비해 몸집이 작고 먼저 나오는 경향이 있습니다. 먼저 번데기를 크기별로 정렬한 다음 이 초기 화면을 형태별로 확인합니다.
   2. 번데기를 유리 현미경 슬라이드로 옮기고 티슈로 과도한 물을 제거합니다. 이것은 번데기를 움직이지 못하게 합니다. 2x-4x 배율의 입체경 아래에서 끝이 가늘게 파인 붓을 사용하여 번데기 복부 쪽을 위로 향하게 합니다.
   3. 생식기 엽 모양의 차이에 대해 꼬리를 육안으로 분석합니다(패들 뒤의 번데기 복부 분절 끝; 그림 2). 암컷은 생식기 로브를 지나 뻗어있는 뾰족한 지느러미를 가지고 있으며 대략 왕관이나 뱀파이어 이빨과 비슷하지만 남성의 생식기 엽은 둥글고 이러한 뾰족한 구조가 없습니다. Carvalho et al. 참조.추가 수치는 ²⁴입니다.
3. 수컷과 암컷 번데기를 별도의 물컵에 넣고 예를 들어 1.9m x 0.2m(8인치 x 8인치) 흰색 오건디 천이 들어 있는 1.9L 상자(1/2갤런 또는 64온스)에 각각 ~150개의 번데기가 들어 있습니다.
4. 케이지 위에 설탕과 물을 제공합니다(예: 건포도와 거즈로 덮인 물을 채운 컵, 두 개의 고무 밴드로 고정). 상자에 펜 크기의 구멍을 뚫고 고무 마개로 덮어 번데기가 나올 때 새장에 추가 번데기를 추가할 수 있습니다.
5. 성충 출현 후 3-5일이 지나면 상자를 4°C에서 ~2-5분 동안 두어 모기를 마취시킵니다. 여전히 경련을 일으킬 수 있지만 대다수가 상자 바닥에 떨어지면 모기는 충분히 마취됩니다. 얼음 위의 유리 페트리 접시에 모기를 ~ 30 분 -1 시간 동안 놓습니다.
   참고: 모기를 4°C에서 너무 오래 방치하면 건강에 상당한 영향을 미칠 수 있지만 최대 1시간 동안 얼음 위에 두면 영향을 받지 않았습니다.
6. 크로스 WT 또는 형질전환 GD1 또는 GD2⁹ (CRISPR/Cas-9 기반 유전자 드라이브) 수컷은 각각 ~150마리의 모기를 포함하는 모기통에 5명의 WT 또는 형질전환 수컷 1명의 비율로 마취된 모기를 추가함으로써 처녀 WT(대조군) 암컷과 대량 으로 결합합니다. 남성 유형에 의하여 감금소를 레테르를 붙이는 것을 확실하십시오.
   참고: 이 교차 체계는 GD1 또는 GD2⁹ 반접합체(즉, 전이유전자의 사본 1개를 보유한 모기)에 대한 적합성을 결정하기 위한 것입니다. 동형접합 형질전환 계통에 대한 적합성을 결정하기 위해, WT 수컷과 암컷의 교배종과 비교하여 형질전환 수컷과 암컷이 교배할 수 있도록 교배 계획을 조정할 수 있습니다.
7. 2-3일 후, 케이지 위에 혈액 공급원을 제공하여 표준 사육 방법²⁵ 에 따라 암컷에게 혈액을 공급합니다. 설탕 공급원 24시간 사전 수유와 수원 ~2-3시간 사전 수유를 제거하여 수유 효율을 높입니다.
8. 수유 후 4단계와 같이 1.5°C에 모기를 마취시킵니다.
9. 피를 먹은(완전히 충혈된) 암컷과 영양을 공급하지 않은 암컷의 복부를 육안으로 검사하여 충혈을 분류합니다. 먹이를 먹지 않은 동물, 부분적으로 먹이를 먹은 동물, 수컷을 버리십시오.
10. 충혈된 암컷을 각자의 우리에 다시 넣고 우리 위에 설탕과 물을 공급하십시오.
11. 2-3일 후, 연필로 미리 라벨이 부착된 여과지를 깐 50mL 원뿔형 튜브에 개별 암컷을 넣습니다(그림 3). 원뿔형 튜브를 메쉬로 덮고 두 개의 고무 밴드로 밀봉합니다.
12. 암컷이 깨어나면 모든 튜브에 ~5mL의 수돗물을 채웁니다. 각 원뿔형 튜브 위에 건포도나 설탕에 적신 면봉 조각을 놓습니다. 암컷을 곤충에 1-2일 동안 두고 산란을 허용합니다.
13. 1-2일 후 각 원추형 튜브를 배출하고 모기를 4°C에 두어 마취시킵니다. 빠른 처리를 위해 메쉬에 대고 눌린 3mL 플라스틱 피펫터의 끝을 사용하여 각 원뿔형 튜브에서 물을 배출합니다. 튜브를 거꾸로 돌려 종이 타월 위에 올려 배수합니다. 50mL 코니컬 튜브를 튜브 홀더에 넣고 랙을 4°C에 놓습니다.
14. 달걀 종이를 모으고 각 종이에 있는 달걀의 수를 세십시오. 알을 낳지 않는 암컷을 0으로 계산하고 분석에 포함합니다. 각 논문에 세어진 총 난자 수를 선별된 총 암컷 수로 나눈 값으로 평균 번식력을 계산합니다.
    알림: 개별 계란 종이의 디지털 사진은 계수 확인을 위한 시각적 기록 역할을 할 수 있습니다(그림 4).
15. 달걀 종이를 말리고 곤충에 다시 넣으십시오. 최적의 부화를 위해 계란 종이를 최소 3-5일 동안 건조시키는 것이 좋습니다²⁵.

2. 날개 길이, 면적 및 중심 크기 측정

1. 모기장을 약 25분 동안 -20°C에 두어 완료된 생식력 연구에서 최소 15 WT 또는 형질전환 연령 일치 혈액을 공급한 암컷을 동결합니다.
   알림: 모기에서 날개가 떨어질 수 있으므로 장기간 얼지 말고 용기를 흔들거나 떨어뜨리지 마십시오.
2. 각 모기의 왼쪽 날개를 절개하고 날개와 흉부의 관절을 절제하고 아래 프로토콜에 따라 날개 전체를 제거합니다.
   1. 한 손에는 집게로 모기를 잡고 날개 아래의 흉부 부위를 잡습니다.
   2. 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 각 모기의 왼쪽 날개를 해부하고 날개와 흉부의 관절을 절제하여 부드러운 압력을 가하여 날개를 잡아 당겨 날개 정맥을 찢지 않고 날개 전체를 제거합니다.
3. 집게를 사용하여 날개를 유리 슬라이드에 놓고 평평하게 눕힙니다. 전사 피펫을 사용하여 70% 에탄올로 구성된 15mL 원액에서 한 방울과 주방 세제 한 방울을 슬라이드의 날개에 추가합니다.
4. 커버슬립에 80% 글리세롤 한 방울을 떨어뜨리고 에탄올-비누 용액에 날개 위에 놓습니다.
5. 65mm 렌즈(7D-65mm-1x, 줌 = 1, 200, 6.3, ISO = 100)가 장착된 카메라를 사용하여 슬라이드에 장착된 날개를 촬영합니다. 픽셀/mm 스케일에 유의하고 모든 이미지에 대해 동일하게 유지되는지 확인합니다. 여러 날개를 함께 이미지화하는 경우 사진을 개별 날개로 자르고 각 사진에 축척 막대를 추가합니다. LZW 압축을 사용하여 이미지를 TIFF 형식으로 저장하고 각 이미지에는 개별 날개에 대한 모든 정보가 명확하게 레이블이 지정됩니다.
   참고: 설정이 동일하게 유지되고 연구에서 촬영된 각 날개에 대해 픽셀/mm 스케일이 동일하게 유지되는 경우 날개는 다른 카메라와 배율을 사용하거나 다른 연구를 위해 현미경에 부착된 카메라로 촬영할 수 있습니다. 픽셀/mm 비율은 측정을 결정할 때 고려됩니다.
6. 무료 형태 측정 이미지 처리 소프트웨어인 tpsUtil 및 tpsDig를 다운로드하십시오. 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 Rohlf^26,27을 참조하십시오.
7. tpsUtil을 사용하여 날개를 디지타이징하여 다음 디지타이징 단계를 위한 날개 사진의 TPS 파일을 만듭니다.
   1. 이렇게 하려면 tpsUtil을 열고 작업에서 이미지에서 tps 파일 빌드를 선택합니다. 입력을 클릭하고 개별 날개 이미지가 포함된 파일을 선택한 다음 이미지를 선택하여 이 폴더를 선택합니다. 출력을 클릭하고 .tps 형식으로 만들 파일의 이름을 지정합니다. 저장을 클릭합니다.
   2. 그런 다음 actions(작업)에서 setup(설정)을 클릭합니다. 모두 포함을 선택하고 만들기 를 클릭한 다음 팝업 상자를 닫습니다. operation(작업)에서 이제 Randomly order specimens(표본 무작위 순서)를 선택합니다. 입력 을 클릭하고 방금 만든 .tps 파일을 선택합니다. 출력을 클릭하고, .tps 파일의 이름을 바꾸어 샘플이 무작위화된 파일 버전임을 나타내고, 저장을 클릭합니다. 그런 다음 만들기를 클릭합니다. tpsUtil 프로그램을 닫습니다.
      알림: 측정 오류를 줄이기 위해 날개 사진을 복제하여 기술 복제를 위해 두 번 사용할 수 있습니다.
8. tpsDig 소프트웨어를 사용하여 랜드마크에 대한 2차원 데카르트 좌표를 식별할 수 있습니다. 입력에서 2.7단계에서 만든 .tps 파일을 선택합니다. 2.5단계에서 결정한 눈금으로 눈금을 설정합니다. Options(옵션)에서 Image Tools(이미지 도구)를 선택하고 Measure(측정)를 클릭합니다.
9. 디지타이징 랜드마크를 나타내는 파란색 십자선 아이콘을 클릭하여 이미지에 랜드마크를 추가한 다음 그림 5에 표시된 날개 관절을 랜드마크 1에서 랜드마크 14까지 순서대로 클릭합니다.
   참고: 이러한 랜드마크는 이전에 날개 랜드마크 디지털화 및 분석⁽¹⁹)에 사용되었고, 많은 샘플에서 날개 맥의 접합부에서 쉽게 찾을 수 있으며, 날개의 크기와 모양을 캡처하기에 충분한 날개 랜드마크를 제공하기 때문에 선택되었다.
10. 랜드마크를 표시할 때 M 아이콘을 클릭하여 tfsDig에서 누락되거나 가려진 랜드마크(날개 접힘 또는 손상으로 인해)를 누락된 것으로 표시하여 분석에서 제외하고 랜드마크의 올바른 순서를 유지합니다. 빨간색 오른쪽 화살표를 클릭하여 파일의 모든 이미지가 완료될 때까지 다음 이미지에 대해 랜드마크 디지타이징을 반복합니다. 파일을 저장하고 닫습니다.
    참고: 날개 길이, 면적 및 크기를 올바르게 계산하려면 각 이미지에 대해 올바른 순서로 날개 이미지에 랜드마크를 추가해야 합니다.
11. 추가 파일 1에 제공된 R 스크립트를 사용하여 날개 길이와 면적을 계산하고 실험에 따라 .tps 파일 위치 및 이미지 배율을 수정합니다.
12. 날개 중심점(^28,29)에서 각 랜드마크의 거리 제곱합의 제곱근으로 정의되는 모양과 통계적으로 독립적인 크기의 척도인 날개 중심 크기를 계산합니다.
13. 일반화된 프로크루스테 정렬을 사용하여 비형태 변동을 제거하고 모든 랜드마크가 손상되지 않은 날개를 사용하여 평균 랜드마크 좌표를 플로팅합니다. 날개 중심 크기와 평균 랜드마크 결정을 위해 보충 파일 2에 제공된 R 스크립트를 사용하여 실험에 따라 .tps 파일 위치 및 이미지 배율을 수정합니다.

3. 난자 수정 능력 평가

1. 독신 암컷(1단계에서 수집)에서 수집한 종이에서 개별 F₁ 알을 ~100mL의 갓 멸균된 탈이온수가 들어 있는 폴리프로필렌 투명 델리 용기에 부화시킵니다. 즉 석 먹이를 위해 갈은 생선 음식 슬러리를 두세 방울 떨어뜨립니다. 용기 상단을 메쉬 또는 오건디로 깔고 고무 밴드로 고정합니다.
2. 부화 후 2-3일이 지나면 물에서 알 종이를 제거하고 뚜껑이나 그물로 덮인 새 용기에 넣고 곤충에 그대로 두어 밤새 건조시킵니다.
3. 달걀 종이를 처음에 부화한 것과 동일한 용기에 다시 부화시켜 물 용기에 다시 넣습니다.
   알림: 계란 종이를 건조시키고 다시 부화하면 부화 효율성이 크게 향상됩니다. 이것은 다른 모기 종에게는 필요하지 않을 수 있습니다.
4. 초기 부화 후 3-5일째에 유충(^2-4번째 instar)에서 형질전환 마커(해당되는 경우)를 육안으로 검사합니다. 그림 6). 형광 현미경으로 여러 유충을 동시에 검사하여 종이 타월을 깐 오건디 또는 메쉬 위에 놓인 여과지 조각에 놓습니다. 종이 타월은 과도한 물을 흡수하므로 여과지를 사용하여 고정 된 유충을 선별하고 조작 할 수 있습니다.
5. 양성 또는 음성 형질전환 유충의 수를 기록합니다. 부정적인 유충을 버리십시오.
6. 최적의 발달 시간을 보장하기 위해 유충 물을 청소하십시오. 이렇게 하려면 유충을 작은 컵에 피펫팅하고 더러운 물을 버리고 깨끗한 수돗물로 교체하십시오 양성 유충을 추가하고 충분한 분쇄 어류 식품 슬러리를 사용할 수 있는지 확인하십시오.
7. 생식력은 형질전환 또는 대조군 유충의 수를 총 난자 수로 나눈 값으로 계산합니다.

4. 번데기의 성비 결정

1. 부화 후 최대 14일까지 수컷과 암컷 번데기의 수를 계속 수집하고 기록합니다(1.2.3단계에서 설명). 암컷 또는 수컷은 성별에 따라 1.9L 용기에 담긴 작은 컵에 담을 수 있습니다.
2. 성비를 결정하려면 개별 성인 여성 모기 당 연구 일정 동안 수집된 F₁ 암컷의 수 또는 F₁ 수컷의 수를 추가합니다. 이 숫자를 단일 암컷에서 생성된 동일한 모기 계통에 대해 수집된 총 번데기 수로 나눕니다.

5. 유충 생존 가능성의 결정

1. 유충의 생존 가능성을 결정하려면 개별 성인 암컷 모기 당 연구 타임라인 동안 수집된 총 번데기 수를 추가합니다.
2. 이 숫자를 3단계에서 계산된 동일한 줄에 대해 개별 성인 암컷 모기당 계산된 총 유충 수로 나눕니다.

6. 유충에서 번데기까지의 발달 시간 결정

1. 유충에서 번데기로의 발달을 확인하려면 매일 유충의 수와 라인당 번데기 수를 추적하십시오.
2. 부화 후 번데기가 발달할 때까지의 평균 시간으로 유충에서 번데기로의 발달을 계산합니다.

7. 남성 기여도의 결정

1. 연령에 맞는 수컷을 사용하여 얼음 위에서 성체 처녀 형질 전환 수컷 모기와 성체 처녀 수컷 및 암컷 대조군 모기를 마취합니다.
2. 50 명의 형질 전환 남성 또는 50 명의 대조 남성 (연령 일치)을 100 명의 대조군 여성과 64 온스 상자에 추가하여 형질 전환 또는 대조군 남성 성인을 대조군 여성 성인과 교배하여 100 명의 여성과 총 50 명의 남성이 있도록합니다 (2 명의 대조군 여성 : 1 명의 대조군 또는 형질 전환 남성). 어떤 상자에 형질전환 남성이 들어 있고 어떤 상자에 대조군 남성이 포함되어 있는지 표시해야 합니다.
3. 2-3일 동안 짝짓기가 일어나도록 합니다. 이 시간이 지나면 표준 사육 관행에 따라 모기에게 혈액 식사를 제공하십시오.
4. 수유 3일 후, 1단계(생식력 분석)에 설명된 대로 완전히 충혈된 개별 암컷을 사전 라벨링된 흰색 여과지를 깐 50mL 원뿔형 튜브로 분리합니다. 먹이를 먹지 않은 암컷을 버리거나 다음날 다른 피 가루를 제공하십시오. 모든 튜브에 ~5mL의 수돗물을 채웁니다. 각 원추형 튜브 위에 놓인 메쉬에 작은 건포도 조각을 놓습니다.
5. 암컷을 곤충에 1-2일 동안 방치하고 산란을 허용합니다. 난자가 있는지 혈액 식사 후 4-5일 동안 난자 종이를 육안으로 검사합니다. 알을 낳는 속도를 높이기 위해 암컷이 산란할 수 있도록 하루 더 허용하십시오.
6. 난자를 수집하려면 물을 배출하고 앞서 설명한 대로 원추형 튜브를 4°C에 놓아 암컷을 마취합니다. 70% 에탄올을 넣어 암컷 모기를 버립니다.
7. 곤충의 튜브에 종이를 넣어 최소 5일 동안 건조시키십시오. 집게를 사용하여 종이를 제거하고 부화를 위해 ~100mL의 갓 멸균된 탈이온수가 들어 있는 폴리프로필렌 투명 델리 용기에 넣습니다. 즉 석 수유를 위해 갈은 생선 음식 슬러리 2-3방울을 추가합니다. 용기의 상단을 메쉬 또는 오건디로 깔고 고무 밴드로 고정하십시오.
8. 부화 후 2-3일이 지나면 물에서 알 종이를 제거하고 뚜껑이나 그물로 덮인 새 용기에 넣고 곤충에 다시 넣어 밤새 건조시킵니다.
9. 같은 용기에 담긴 달걀 종이를 물통에 다시 넣어 다시 부화시킵니다.
10. 초기 부화 후 3-5일이 지나면 유충(^2-4번째 인스타)에서 형질전환 마커(해당되는 경우)가 있는지 육안으로 검사합니다. 수컷 기여도를 F₂ 형질전환 유충의 수를 모기선당 총 유충의 수로 나눈 값으로 계산합니다.

8. 모기 수명의 결정

1. 50마리의 수컷과 50마리의 암컷 WT 또는 형질전환 연령에 맞는 비혈액 공급 모기를 적절한 인클로저로 옮깁니다. 실험이 진행됨에 따라 모기에 쉽게 접근하고 조작할 수 있도록 상단 입구에 팬티 호스가 늘어서 있고 꼬이고 매듭이 있는 64oz 상자를 사용합니다(그림 7).
   참고: 통계 목적으로 이 작업을 세 번에 걸쳐 수행하는 것이 좋습니다.
2. 설탕과 물 공급원을 제공하십시오. 여기에는 건포도와 물이 담긴 컵에 거즈를 깐 후 두 개의 고무 밴드로 고정했습니다.
3. 매일 죽은 수컷 및 암컷 모기의 수를 추적합니다. 모기가 케이지를 가로질러 죽기까지 경과한 평균 일수로 수명을 계산하고, 정보가 없는 원인(모기의 수명에 기인하지 않는 원인, 예를 들어 찌그러지거나 설탕에 익사하는 원인)으로 죽는 모기는 생략하고 연구가 끝날 때까지 아직 살아있는 모기는 생략합니다.
   참고: 생존은 시간 t 또는 함수 S(t) = Pr(T>t)까지 생존할 확률로 정의됩니다. 생존 중앙값은 생존 확률이 0.5 또는 T_0.5 = ^S-1 x 0.5인 시간입니다.

결과

위의 프로토콜에 따라 두 가지 모기 계통의 적합성을 평가했습니다: (1) CRISPR/Cas9 매개 knock out of the Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424) salivary protein 및 (2) Ae. Aegypti lines 발현 자율적인 CRISPR/Cas9 매개 유전자 드라이브⁹. 전자의 경우, D7L1 유전자에 특이적인 sgRNA를 배아에 미세주입한 후 파쇄를 생성하기 위해 NHEJ(non-homologous end-joining pathway)를 이용하여 동형접합 D7L1 knock-out line...

토론

Ae. aegypti 피트니스 연구는 이 원고에서 논의된 바와 같이 형질전환 화물(예: 유전자 구동 요소) 또는 유전자 녹아웃과 관련된 피트니스 비용을 평가하기 위해 실험실에서 종종 수행됩니다. 그러나, 이러한 연구는 다양한 목적으로 수행될 수 있으며, Wolbachia-infected 30,31, insecticide resistant^32,33 또는 arbovirus-infected

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 oz. translucent plastic souffle cups	WebstaurantStore	301100PC
2 oz. translucent polystyrene souffle cups	WebstaurantStore	760P200N
3 mL plastic pipettors	Cornin	357524
50 mL conical tubes	Any brand
64 oz. white double poly-coated paper food cup	WebstaurantStore	999SOUP64WB	for mosquito enclosement
65 mm lens	Canon	MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo	Canon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
Aedes aegypti mosquitoes	BEI	multiple strains as eggs are available
Artifical membrane feeders	https://lillieglassblowers.com/	Meduim membrane feeder, Custom made, 33mm	Chemglass also offers, but sizes are wrong for us. Ours are about 3 cm?
ATP	MP Biomedical	ICN15026605	Any good quality ATP, 10mM filter sterile aliquots at -20
Autoclave			for sterilizing water for hatching
Canon EOS 7D camera	Canon	3814B004	for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
defibrinated sheep blood	Colorado Serum Co.	60 ml, every 2 weeks	https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
Dual Gooseneck Microscope Illuminator	Dolan Jenner Fiber-Lite 180	181-1 System
Ethanol
Forceps	Dumont	5SF
Gauze		omnisorb ii	4" non-woven sponges
glass microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Glass Petri dishes, 100 × 15 mm	VWR	75845-546	for anesthesizing/manipulating mosquitoes on ice
Hogs' gut	Any Deli		we buy in bulk, split, wash and store in small aliquots of ~4X12" at -20 in 50 ml conical
Ice
Ice bucket
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Leica GZ4 StereoZoom microscope			for screening transgenic mosquitoes (if applicable)
Paintbrush	AIT synthetic brush	size 10-0	for manipulating larvae/pupae (Amazon)
Panty hose	Walmart	L'eggs Everyday	Women's Nylon Plus Knee Highs Sheer Toe, 16 pairs (plus fits the carton)
Pencils	Any brand
Plastic containers for 2° storage of cartons	Walmart		Sterilite 58 Qt Storage Box Clear Base White Lid Set of 8
Plastic containers for growing larvae	Walmart		Sterilite 28 Qt. Storage Box Plastic, White, Set of 10
Plastic containers for hatching larvae	Walmart		Sterilite 6 Qt. Storage Box Plastic, White
polypropylene clear deli containers	WebstaurantStore	127DM12BULK	12 oz, or 16 oz if needed for bigger (127RD16BULK)
Rubber bands	Office Max	#100736/#909606 /#3777415	12", #64 and #10
Rubber stopper	VWR	217-0515	for mosquito enclosement
Sugar source, such as sugar cubes or raisins
Tetramin flake food	Tetramin	16106
tpsDig	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
tpsUtil	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
White organza fabric 8” × 8”	FabricWholesale.com	4491676	Joann Casa Collection Organza Fabric by Casa Collection
Whitman Grade 1 Qualitative Filter paper	Whitman	1001-824	for egg papers. The white color makes it easier to see the black eggs.