כימות עלויות כושר ביתושים מהונדסים, Aedes aegypti

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד למדוד נתוני פרמטרי חיים נפוצים אצל יתושי Aedes aegypti , כולל פריון, גודל כנפיים, פוריות, יחס מין, כדאיות, זמני התפתחות, תרומת גברים ואריכות ימים של מבוגרים. מדידות אלה יכולות לשמש להערכת כשירותם של יתושים טרנסגניים.

Abstract

יתושים טרנסגניים מציגים לעתים קרובות עלויות כושר בהשוואה לעמיתיהם הפראיים. בהקשר זה, מחקרי עלות כושר כרוכים באיסוף נתוני פרמטרי חיים מיתושים מהונדסים גנטית והשוואתם ליתושים חסרי טרנסגנים מאותו רקע גנטי. כתב יד זה ממחיש כיצד למדוד תכונות נפוצות בתולדות החיים של היתוש Aedes aegypti, כולל פריון, גודל וצורת כנפיים, פוריות, יחס בין המינים, כדאיות, זמני התפתחות, תרומת גברים ואריכות ימים של מבוגרים. פרמטרים אלה נבחרו משום שהם משקפים הצלחה ברבייה, פשוטים למדידה, ומדווחים בדרך כלל בספרות. התוצאות המייצגות מכמתות את עלויות הכושר הקשורות לנוק-אאוט גנטי או להחדרה יחידה של רכיב דחף גנטי. סטנדרטיזציה של אופן איסוף נתוני פרמטרי החיים חשובה מכיוון שניתן להשתמש בנתונים כאלה כדי להשוות את בריאותם של יתושים טרנסגניים שנוצרו במחקרים או למדל את קצב קיבוע הטרנסגנים באוכלוסיית יתושים מסוג בר מדומה. למרות שפרוטוקול זה הוא ספציפי עבור Aedes aegypti מהונדס, הפרוטוקול עשוי לשמש גם עבור מיני יתושים אחרים או תנאי טיפול ניסיוניים אחרים, עם אזהרה כי הקשרים ביולוגיים מסוימים עשויים לדרוש התאמות מיוחדות.

Introduction

הישרדותם של החזקים ביותר היא הרעיון הדרוויניסטי שפרטים המכילים גנים המותאמים ביותר לסביבתם יעבירו גנים אלה לדורות הבאים¹. משמעות הדבר היא שהכושר הוא שקובע אם הגנים שלהם ישרדו. תפיסה זו, בת יותר מ-150 שנה, היא אולי הגורם המשמעותי ביותר בהנדסת דחף גנטי מוצלח ביתושים טרנסגניים. דחפי גנים, או דפוס התורשה הסופר-מנדליאני של יסוד גנטי אנוכי המאפשר לו להתפשט באוכלוסיות², נחקרים לצורך הדברה גנטית³. בהקשר של שליטה וקטורית, אסטרטגיה זו שואפת להחליף פרוקי רגליים מסוג בר (WT) באלה העמידים לפתוגנים (שינוי אוכלוסיה) או לחסל את כולם יחד (דיכוי אוכלוסיה)⁴. עם זאת, יתושים טרנסגניים מפגינים לעתים קרובות עלויות כושר (הנקראות גם עומס גנטי) בהשוואה לעמיתיהם WT, מה שאומר שהטרנסגן יאבד באוכלוסיות שיכולות להתחרות בהם. צימוד טרנסגנים עם מערכת דחיפת גנים נחוץ אפוא כדי לקזז את עלויות הכושר ולדחוף את הטרנסגן דרך האוכלוסייה ברמות גבוהות מהצפוי מתורשה מנדליאנית טיפוסית⁴.

מחקרי מעבדה על פני מיני וקטורים של יתושים הראו כי טרנסגנים מציגים לעתים קרובות עלויות כושר ^5,6,7. לדוגמה, Irvin et al. מדדו פרמטרי חיים שונים ב-Aedes (Ae.) aegypti שהונדסו לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) או גנים טרנספוזאז תחת מקדמי Drosophila actin 5C או 3XP3 סינתטי, והשוו אותם לזן אורלנדו פראי (אותו רקע גנטי שממנו הם נגזרו)⁵. בעיקר, הם מצאו כי כל הזנים הטרנסגניים הפחיתו באופן משמעותי את כושר הרבייה⁵. בהתאם לטרנסגן, חלק מיתושי אנופלס (An.) המבטאים טרנסגנים המעכבים התפתחות טפיל פלסמודיום הציגו גם הם עלויות כושר⁶. באופן ספציפי, An. stephensi המבטא ארס דבורים פוספוליפאז (PLA2) תחת מקדמים מכוננים או מעוררי דם הטיל באופן משמעותי פחות ביצים בהשוואה לקבוצת ביקורת⁶. מחברים אלה מצאו גם כי אנופלס מהונדס המבטא טרנסגן אחר, טטרמר דודקפפטיד SM1 לא הציג עלויות כושר, מה שהוביל אותם למסקנה כי עלויות הכושר המוענקות על ידי טרנסגן תלויות, לפחות סביר בחלקן, בהשפעת החלבון המהונדס המיוצר⁶. אכן, ניתן לייחס את עלויות הכושר לתוצרי טרנסגנים, השפעות מיקום, השפעות מחוץ למטרה, מוטגנזה החדרתית, או השפעות רבייה בזנים שגודלו במעבדה⁷. לכן, כונני גנים חייבים להיות חזקים מספיק כדי לקזז את עלויות הכושר המושרות על ידי טרנסגנים, תוך הימנעות מהתפתחות של החדרות ומחיקות (indels) שחוסמות את הכונן עצמו.

עלויות כושר התפתחותי או רבייה ניתן למדוד במחקרי מעבדה או כלוב⁷, עם אזהרה כי גורמים לא ידועים בתחום עשויים גם להשפיע. עם זאת, מחקרי כושר מבוקרים הם צעד ראשון חשוב בעת תכנון או הערכה של שחרור יתושים מהונדסים גנטית, כגון תוכנית דחיפת גנים, כדי לקבוע אם הקו המהונדס יימשך בדורות הבאים. לדוגמה, האמונד ואחרים. נבדק כונני גנים מבוססי CRISPR/Cas9 שנועדו לשבש את הגנים הדרושים לפוריות האישה⁸. באמצעות מחקרי כלובים שנשמרו במשך 25 דורות לפחות, מצאו המחברים כי היתושים צברו אללים עמידים לדחף גנטי שחסמו את המחשוף ממוקד הקריספר והחזירו את פוריות האישה⁸. מאמצי המידול שלהם הציעו כי לפוריות אצל נקבות הטרוזיגוטיות לדחף הגנטי היו ההשפעות הדרמטיות ביותר על קיבוע כונן גנים בתנאים מדומים⁸. באותו קו, Ae. aegypti (זן העין הלבנה של היגס, HWE) שהונדס לבטא קלטות אוטונומיות של דחיפת גנים תחת מקדמים שונים או במוקדים אינטרגניים שונים הציג שיעורים שונים של קיבוע כונן גנים באוכלוסיות מדומות⁹. באמצעות מודלים של MGDrivE¹⁰, בשילוב עם שיעורים מדודים של היווצרות אינדל, השפעות אימהיות ונתוני פרמטרי חיים שנאספו במעבדה, המחברים מצאו כי כושר היתושים השפיע בצורה החזקה ביותר על התמדת דחף הגן בתנאים מדומים⁹. עלויות הכושר שסביר להניח שיפגעו ביעילות דחיפת הגנים מיוחסות לביטוי סומטי Cas9 (יתר) או מהגן הממוקד, במיוחד בהטרוזיגוטים, ולא מהדחף הפנימי עצמו 11,12,13,14,15,16,17.

בהתחשב בחשיבותו, כושר גופני הוא גורם חשוב ליכולתו של קו מהונדס להתמיד בדורות הבאים, והוא יכול לשמש אינדיקטור לכל ההשפעות הפיזיולוגיות הקשורות לטרנסגן. לדוגמה, השפעות מחוץ ליעד עשויות להיות קשורות לעלויות כושר. במקרה זה, מומלץ לחצות קו מהונדס במשך מספר דורות. יתר על כן, חציית הקו המהונדס עם קו המשקף אוכלוסיית שדה עשויה להיות נחוצה גם כדי לחקור עד כמה האוכלוסייה המהונדסת יכולה להתחרות בעולם האמיתי. כדי לכמת את עלויות הכושר כך שניתן יהיה להשוות ביניהן, כתב יד זה מספק פרוטוקולים פשוטים למדידת תכונות נפוצות בתולדות החיים ביתושי Ae. aegypti, עם דגש מיוחד על עלויות כושר הקשורות לטרנסגנים, כך שניתן יהיה לשחזר מחקרים כאלה ביתר קלות. הפרוטוקולים כוללים פוריות, פוריות, יחס בין המינים, כדאיות, זמני התפתחות, תרומת גברים ואריכות ימים של מבוגרים. מדידת אורך ושטח הכנף נבחרה גם כמדידת כושר מכיוון שהיא מתואמת עם אורך בית החזה^18,19 ומדידות גודל הגוף, אשר קשורות ישירות לגודל ארוחת הדם, צואה וחסינות^20,21. למרות שישנן דרכים רבות להעריך כושר, פרמטרים אלה נבחרו מכיוון שהם משקפים הצלחה ברבייה, פשוטים למדידה, ומדווחים בדרך כלל בספרות.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה נכתב עבור קווי Ae מהונדס ופראי מסוג Ae. aegypti שאומתו והוקמו בעבר. למידע נוסף על יצירת Ae. aegypti מהונדס, ראו Kistler et al.²² ו Coates et al.²³. כל הניסויים המפורטים להלן בוצעו תחת נהלי גידול Ae. aegypti סטנדרטיים. יתושים נשמרו ב 28 ° C עם לחות יחסית 75%-80% ומחזור אור / 12 שעות חושך. מינימום של 100 ניירות ביצים בודדים לכל כתם יתוש מומלץ מאוד למטרות סטטיסטיות. מחקרי כושר מקיפים נמשכים כ-3 חודשים (איור 1).

1. מדידת צואה אצל נקבות יתושים

1. בוקעים יתושים טרנסגניים ויתושי WT (בעלי אותו רקע גנטי אך חסרי טרנסגן) על ידי הכנסת ניירות ביצים למים סטריליים למשך הלילה בחרק, בהתאם לתנאי גידול סטנדרטיים. אפשרו לזחלים להאכיל אד ליביטום , על ידי מתן מספר טיפות (כל אחת כ-50 מיקרוליטר) של מזון דגים טחונים (טטרמין) (בערך 30% w/v). הזחלים הראשונים ניתנים לזיהוי יום אחד לאחר הבקיעה. מניחים את הזחלים במיכלים גדולים יותר כדי שלא תהיה צפיפות, בדרך כלל ניתן לגדל 100-150 זחלים בנפח 1 ליטר מים עם שטח פנים של כ 250 ס"מ². המשיכו לספק תרחיף טטרמין כמקור מזון, המאפשר לזחלים להאכיל אד ליביטום. מוסיפים את תרחיף המזון בטיפות נפרדות, כך שתמיד יהיה מספיק מזון זמין לזחלים, וכדי שהמים לא ייראו מעוננים. הזחלים יגדלו עם כל כוכב ובסופו של דבר ייכנסו לגור במחבתות הזחל.
2. ברגע שהגלמים מתחילים להופיע, ~5-6 ימים לאחר הבקיעה, הפרידו אותם לפי מין כדי להבטיח שהבוגרים יהיו בתולים ברגע שהם יוצאים (להזדווגות לאחר מכן), כמתואר להלן.
   1. כדי למיין את הגלמים לפי מין, התחילו בקטיף הגלמים באמצעות פיפטורים מפלסטיק של 3 מ"ל לתוך כוסות פלסטיק קטנות המכילות מי ברז נקיים. הגלמים הזכרים נוטים להיות קטנים יותר ונוטים לצאת ראשונים בהשוואה לנקבות. ראשית, מיין את הגלמים לפי גודל, ולאחר מכן אשר את המסך הראשוני לפי מורפולוגיה.
   2. העבירו את הגלמים למגלשת מיקרוסקופ זכוכית והוציאו עודפי מים בעזרת רקמה. זה משתק את הגולם. תחת סטריאוסקופ בהגדלה של פי 2-4, מקמו את הצד הגחוני של הגלמים כלפי מעלה באמצעות מברשת צבע בעלת קצוות עדינים.
   3. לנתח חזותית את הזנב עבור הבדלים בצורת האונה איברי המין (בקצה קטעי הבטן גולם מאחורי המשוטים; איור 2). לנקבות יש סנפירים מחודדים המשתרעים מעבר לאונות איברי המין, הדומים בערך לכתר או לשיני ערפד, בעוד שאונות איברי המין הזכריות מעוגלות ואין להן מבנים מחודדים אלה. ראו Carvalho et al.²⁴ לנתונים נוספים.
3. הניחו גלמים זכרים ונקבות בכוסות מים נפרדות והניחו אותם בהכלה נכונה, לדוגמה, קרטונים בנפח 1.9 ליטר (1/2 גלון או 64 אונקיות) עם 0.2 מ' x 0.2 מ' (8 אינץ' x 8 אינץ') בד אורגנדי לבן, שכל אחד מהם מכיל ~150 גלמים.
4. לספק מקור סוכר ומים על גבי הכלובים (למשל, צימוקים וכוס מלאה במים מכוסה בגזה, מאובטחת בשתי גומיות). חתכו חור בגודל עט לתוך הקרטונים וכסו אותו בפקק גומי כדי שניתן יהיה להוסיף גלמים נוספים לכלובים כשהם יוצאים.
5. ב 3-5 ימים לאחר הופעת הבוגר, להרדים את היתושים על ידי הנחת הקרטונים ב 4 ° C במשך ~ 2-5 דקות. למרות שהם עדיין עשויים להתעוות, היתושים מורדמים מספיק ברגע שרובם נופלים לתחתית הקרטון. מניחים את היתושים על צלחת פטרי זכוכית על קרח במשך ~ 30 דקות - 1 שעות.
   הערה: השארת היתושים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך זמן רב מדי עלולה להשפיע באופן משמעותי על בריאותם, אם כי לא מצאנו השפעות אם הם נשארים על קרח עד שעה אחת.
6. לחצות WT או GD1 מהונדס או GD2⁹ (כונן גנים מבוסס CRISPR/Cas-9) בהמוניהם עם נקבות WT בתוליות (בקרה) על ידי הוספת יתושים מורדמים ביחס של חמישה זכרים WT או טרנסגניים לנקבת WT אחת לקרטוני יתושים, שכל אחד מהם מכיל ~ 150 יתושים. הקפידו לתייג את הכלובים לפי סוג זכר.
   הערה: סכמת מעבר זו נועדה לקבוע את הכשירות של GD1 או GD2⁹ המיזיגוטים (כלומר, יתושים המכילים עותק אחד של הטרנסגן). כדי לקבוע את הכשירות לקווים טרנסגניים הומוזיגוטיים, ניתן להתאים את סכימת המעבר כך שזכרים ונקבות טרנסגניים יורשו להזדווג בהשוואה לצלבים של זכרים ונקבות WT.
7. לאחר 2-3 ימים, הדם מאכיל את הנקבות בהתאם לשיטות גידול סטנדרטיות²⁵ על ידי מתן מקור דם על גבי הכלוב. הסר את מקור הסוכר 24 שעות לפני האכלת הדם ואת מקור המים ~ 2-3 שעות לפני האכלת הדם כדי להגביר את יעילות ההאכלה.
8. לאחר האכלת הדם, להרדים את היתושים על ידי הצבתם ב 4 ° C, כמו בשלב 1.5.
9. מיין את הנקבות המוזנות בדם (מעורב לחלוטין) מנקבות שלא ניזונו על ידי סינון חזותי של הבטן שלהן לגודש. השליכו את הלא-מוזנים, הניזונים חלקית והזכרים.
10. החזירו את הנקבות החרוטות לכלובים שלהן וספקו מקור סוכר ומים על גבי הכלובים.
11. לאחר 2-3 ימים, הניחו נקבות בודדות בתוך צינורות חרוטיים בנפח 50 מ"ל המרופדים בנייר סינון שסומן מראש בעיפרון (איור 3). מכסים את הצינורות החרוטיים ברשת ואוטמים בשתי גומיות.
12. ברגע שהנקבות ערות, מלא את כל הצינורות עם ~ 5 מ"ל של מי ברז. מניחים חתיכה קטנה של צימוקים או כדור צמר גפן ספוג סוכר על גבי כל צינור חרוט. השאירו את הנקבות במשך 1-2 ימים בחרק ולאפשר להם oviposit.
13. לאחר 1-2 ימים, לנקז כל צינור חרוטי להרדים את היתושים על ידי הצבתם ב 4 ° C. לעיבוד מהיר, השתמש בקצה של פיפטור פלסטיק 3 מ"ל שנלחץ על הרשת כדי לנקז את המים מכל צינור חרוט. סובבו את הצינורות הפוך והניחו אותם על גבי מגבת נייר לניקוז. הניחו את הצינורות החרוטיים בנפח 50 מ"ל במחזיק צינור והניחו את המדף בטמפרטורה של 4°C.
14. אספו את נייר הביצים וספרו את מספר הביצים על כל נייר. ספרו את הנקבות שאינן מטילות ביצים כ-0 וכללו אותן בניתוח. חשב את הפריון הממוצע כמספר הכולל של ביצים שנספרו בכל נייר חלקי המספר הכולל של נקבות שנבדקו.
    הערה: תמונות דיגיטליות של ניירות ביצים בודדים עשויות לשמש כתיעוד חזותי לאישור ספירה (איור 4).
15. יבשו את ניירות הביצים והחזירו אותם לחרק. מומלץ שניירות הביצים יתייבשו לפחות 3-5 ימים לבקיעה אופטימלית²⁵.

2. מדידת אורך כנף, שטח וגודל צנטרואיד

1. יש להקפיא לפחות 25 WT או נקבות המוזנות בדם מהונדס תואם גיל ממחקר הצואה שהושלם על ידי הצבת כלובי היתושים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך כ-15 דקות.
   הערה: אין להקפיא לפרק זמן ארוך יותר ואין לנער או להפיל את המיכל, מכיוון שהדבר עלול לגרום לכנפיים ליפול מהיתושים.
2. יש לנתח את הכנף השמאלית של כל יתוש, לכרות את מפרק הכנף ובית החזה, ולהסיר את כל הכנף, בהתאם לפרוטוקול שלהלן.
   1. ביד אחת, להחזיק את היתוש עם מלקחיים, לתפוס את אזור בית החזה מתחת לכנפיים.
   2. בעזרת זוג מלקחיים נוסף ביד השנייה, מנתחים את הכנף השמאלית של כל יתוש, תוך כריתה של מפרק הכנף ובית החזה באמצעות לחץ עדין כדי למשוך את הכנף, תוך הסרת כל הכנף מבלי לקרוע את ורידי הכנף.
3. בעזרת מלקחיים, מניחים את הכנף על מגלשת זכוכית, שוכבת שטוחה. בעזרת פיפטת העברה, הוסיפו טיפה אחת מתמיסת ציר של 15 מ"ל, המורכבת מ-70% אתנול, וטיפה אחת של סבון כלים לכנף במגלשה.
4. הוסיפו טיפה אחת של 80% גליצרול למכסה והניחו על גבי הכנף בתמיסת סבון אתנול.
5. צלם את הכנפיים המותקנות על המגלשות באמצעות מצלמה עם עדשת 65 מ"מ (7D-65 מ"מ-1x; זום = 1, 200, 6.3, ISO = 100). שים לב לקנה המידה של פיקסל/מ"מ וודא שהוא נשאר זהה עבור כל התמונות. אם מספר כנפיים מצולמות יחד, חתוך את התמונות לכנפיים בודדות והוסף פסי קנה מידה לכל תמונה. שמור את התמונות בפורמט TIFF עם דחיסת LZW, כאשר כל תמונה מסומנת בבירור עם כל המידע עבור האגף הבודד.
   הערה: ניתן לצלם את הכנפיים באמצעות מצלמה שונה והגדלה אחרת או באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ עבור מחקרים אחרים, אם ההגדרות נשארות זהות וקנה המידה של פיקסל/מ"מ נשאר זהה עבור כל כנף מצולמת במחקר. יחס הפיקסלים/מ"מ יילקח בחשבון בעת קביעת המדידות.
6. הורד את tpsUtil ו- tpsDig, שהן תוכנות עיבוד תמונה מורפומטריות ללא תשלום. ראה Rohlf ^26,27 לקבלת מידע מפורט יותר על התוכנה.
7. דיגיטציה של הכנפיים באמצעות tpsUtil כדי ליצור קובץ TPS של תצלומי הכנף לשלב הבא של הדיגיטציה.
   1. לשם כך, פתח את tpsUtil ותחת פעולה, בחר בנה קובץ tps מתמונות. לחץ על קלט, בחר בקובץ הכולל את תמונות הכנף הבודדות, ולאחר מכן בחר תמונה כלשהי כדי לבחור בתיקייה זו. לחץ על פלט ותן שם לקובץ שייווצר בתבנית .tps. לחץ על שמור.
   2. לאחר מכן, תחת פעולות, לחץ על הגדרה. בחר כלול הכל, לחץ על צור וסגור את התיבה הנפתחת. תחת פעולה, כעת בחר דגימות סדר אקראי. לחץ על קלט ובחר את קובץ ה- .tps שזה עתה נוצר. לחץ על פלט, שנה את שם קובץ ה- .tps כדי לציין שזוהי גירסת הקובץ עם הדגימות אקראיות ולחץ על שמור. לאחר מכן, לחץ על צור. סגור את התוכנית tpsUtil.
      הערה: כדי להפחית את טעות המדידה, ניתן לשכפל את תמונות הכנף ולהשתמש בהן פעמיים לשכפול טכני.
8. השתמש בתוכנת tpsDig כדי לזהות קואורדינטות קרטזיות דו-ממדיות עבור ציוני הדרך. תחת קלט, בחר את קובץ ה- .tps שנוצר בשלב 2.7. הגדר את קנה המידה לסולם שנקבע בשלב 2.5; תחת אפשרויות, בחר כלי תמונה ולאחר מכן לחץ על מדידה.
9. הוסף ציוני דרך לתמונה על-ידי לחיצה על סמל הצלב הכחול המייצג ציוני דרך דיגיטליים, ולאחר מכן לחץ על מפרקי הכנפיים המצוינים באיור 5, לפי הסדר מלנדמרק 1 ללנדמרק 14.
   הערה: ציוני דרך אלה נבחרו מכיוון שהם שימשו בעבר בדיגיטציה וניתוח של ציוני דרך בכנף¹⁹, קל לאתר אותם במפרקי ורידי הכנף על פני דגימות רבות, ומספקים מספיק ציוני דרך בכנף כדי ללכוד את גודל וצורת הכנף.
10. בעת סימון ציוני דרך, סמן ציוני דרך חסרים או מוסתרים (עקב קיפול כנף או נזק) כחסרים ב- tpsDig על ידי לחיצה על סמל M כדי לא לכלול אותם בניתוח ולשמור על הסדר הנכון של ציוני הדרך. לחץ על החץ האדום הפונה ימינה כדי לחזור על הדיגיטציה של ציון הדרך עבור התמונות הבאות עד להשלמת כל התמונות בקובץ. שמור וסגור את הקובץ.
    הערה: יש להוסיף את ציוני הדרך לתמונת הכנף בסדר הנכון עבור כל תמונה כדי שהחישובים של אורך הכנף, שטחה וגודלה יהיו נכונים.
11. חשב את אורך הכנף ושטחה באמצעות סקריפט R שסופק בקובץ משלים 1, תוך שינוי עבור מיקום קובץ ה- .tps וקנה המידה של התמונה בהתאם לניסוי.
12. חישוב גודל צנטרויד כנף, מדד לגודל שאינו תלוי סטטיסטית בצורה, המוגדר כשורש הריבועי של סכום המרחקים הריבועיים של כל אחד מציוני הדרך מנקודת המרכז של הכנף^28,29.
13. השתמש ביישור פרוקרוסטס כללי כדי להסיר וריאציות שאינן צורה וקואורדינטות ציון דרך של קווי התווייה, באמצעות כנפיים שכל ציוני הדרך שלהן שלמים. הן עבור גודל צנטרויד הכנף והן עבור קביעת ציון דרך ממוצע, השתמש בסקריפט R שסופק בקובץ משלים 2, ושנה עבור מיקום קובץ ה- .tps וקנה המידה של התמונה בהתאם לניסוי.

3. הערכת פוריות הביציות

1. בוקעות ביצי F₁ בודדות מהניירות שנאספו מנקבות בודדות (שנאספו בשלב 1) למיכלי מעדנייה שקופים מפוליפרופילן המכילים ~100 מ"ל של מים מעוקרים טריים. הוסיפו שתיים או שלוש טיפות של תרחיף מזון דגים טחונים להאכלת אד ליביטום . רפדו את החלק העליון של המיכלים ברשת או אורגנדי, והדקו באמצעות גומייה.
2. 2-3 ימים לאחר הבקיעה, מוציאים את ניירות הביצים מהמים ומניחים להם להתייבש למשך הלילה על ידי הכנסתם למיכל חדש המכוסה במכסה או רשת ומשאירים אותם בחרק.
3. בקעו מחדש את ניירות הביצים באותם מכלים שבהם בקעו לראשונה על ידי הכנסתם חזרה למיכל המים.
   הערה: ייבוש ובקיעה מחדש של ניירות הביצים משפרים מאוד את יעילות הבקיעה. ייתכן שזה לא יהיה נחוץ עבור מיני יתושים אחרים.
4. 3-5 ימים לאחר הבקיעה הראשונית, בדקו ויזואלית את הזחלים (2^nd עד 4^th instar) עבור סמן מהונדס (אם רלוונטי; איור 6). בדקו מספר זחלים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בו זמנית על ידי הנחתם על פיסת נייר פילטר המונחת על גבי אורגנדי או רשת מרופדת במגבות נייר. מגבות הנייר סופגות עודפי מים, כך שניתן להשתמש בנייר הסינון כדי לסנן ולתפעל את הזחלים המשותקים.
5. רשום את מספר הזחלים הטרנסגניים החיוביים או השליליים. השליכו את הזחלים השליליים.
6. נקו את מי הזחל כדי להבטיח זמני התפתחות אופטימליים. כדי לעשות זאת, פיפטה את הזחלים לתוך קטנה, להשליך את המים המלוכלכים, ולהחליף אותו עם מי ברז טריים להוסיף את הזחלים החיוביים ולוודא מספיק מזון דגים הקרקע זמין.
7. חישוב פוריות כמספר הזחלים הטרנסגניים או זחלי הבקרה חלקי המספר הכולל של הביציות.

4. קביעת יחס המינים בגלמים

1. עד 14 יום לאחר הבקיעה, המשך לאסוף ולתעד את מספר הגלמים הזכרים והנקבות (כמתואר בשלב 1.2.3). נקבות או זכרים יכולים להיאגר, לפי מין, לכוסות קטנות השוכנות במיכלים של 1.9 ליטר.
2. כדי לקבוע את יחס המינים, הוסף את מספר נקבות F₁ או את מספר זכרי F₁ שנאספו לאורך ציר הזמן של המחקר לכל יתוש בוגר בודד. חלק מספר זה במספר הכולל של הגלמים שנאספו עבור אותו קו יתושים שנוצר מנקבה אחת.

5. קביעת כדאיות הזחלים

1. כדי לקבוע את כדאיות הזחלים, הוסף את המספר הכולל של הגלמים שנאספו לאורך ציר הזמן של המחקר לכל יתוש בוגר בודד.
2. חלק מספר זה במספר הכולל של הזחלים שנספרו לכל נקבת יתוש בוגרת בודדת עבור אותה שורה שנספרת בשלב 3.

6. קביעת זמן התפתחות הזחלים לגלמים

1. כדי לקבוע את התפתחות הזחלים לגלמים, עקבו אחר מספר הזחלים ומספר הגלמים בשורה מדי יום.
2. חישוב התפתחות הזחלים לגלמים כזמן הממוצע להתפתחות הגלמים לאחר הבקיעה.

7. קביעת תרומת הגברים

1. באמצעות זכרים תואמי גיל, מרדימים יתושים זכרים טרנסגניים בתולים בוגרים על קרח, כמו גם יתושים בוגרים זכרים ונקבות הדברה.
2. חצו את הבוגרים הטרנסגניים או את זכרי הביקורת עם נקבות ביקורת בוגרות על ידי הוספת 50 זכרי ביקורת או 50 זכרי ביקורת (תואמי גיל) עם 100 נקבות ביקורת לקרטונים של 64 אונקיות, כך שיש בסך הכל 50 זכרים עם 100 נקבות (שתי נקבות ביקורת: זכר ביקורת אחד או זכר מהונדס). הקפידו לתייג איזה קרטון מכיל זכרים טרנסגניים ואיזה קרטון מכיל זכרי ביקורת.
3. אפשרו להזדווגות להתרחש במשך 2-3 ימים. לאחר זמן זה, הציעו ליתושים ארוחת דם בהתאם לשיטות הגידול הסטנדרטיות.
4. שלושה ימים לאחר הזנת הדם, יש להפריד נקבות בודדות חרוטות במלואן לתוך צינורות חרוטיים בנפח 50 מ"ל המרופדים בנייר סינון לבן מסומן מראש, כמתואר בשלב 1 (בדיקת צואה). השליכו את הנקבות שלא ניזונו או הציעו להן ארוחת דם נוספת למחרת. מלא את כל הצינורות עם ~ 5 מ"ל של מי ברז. מניחים חתיכה קטנה של צימוק על הרשת מונחת על גבי כל צינור חרוט.
5. השאירו את הנקבות למשך 1-2 ימים בחרק ואפשרו להן לבצע אוביפוזיט. בדקו ויזואלית את ניירות הביצים במשך 4-5 ימים לאחר ארוחת הדם לביצים. תנו לנקבות יום נוסף כדי להגדיל את קצב הטלת הביצים.
6. כדי לאסוף את ניירות הביצה, לנקז את המים להרדים את הנקבות על ידי הצבת צינורות חרוטי ב 4 ° C, כפי שתואר קודם לכן. השליכו נקבות יתושים על ידי הכנסת אתנול 70%.
7. השאירו את הניירות בצינורות בחרק לפחות 5 ימים לייבוש. השתמש במלקחיים כדי להסיר את הניירות והניחו אותם במיכלי מעדנייה שקופים מפוליפרופילן המכילים ~ 100 מ"ל של מים מעוקרים טריים לבקיעה. יש להוסיף 2-3 טיפות של תרחיף מזון דגים טחונים להאכלת אד ליביטום . מרפדים את החלק העליון של המיכלים ברשת או אורגנדי, מאובטחים בגומייה.
8. 2-3 ימים לאחר הבקיעה, מוציאים את ניירות הביצים מהמים ומניחים להם להתייבש למשך הלילה על ידי הכנסתם למיכל חדש המכוסה במכסה או רשת והכנסתם חזרה לחרק.
9. בקעו מחדש את ניירות הביצים באותם מיכלים על ידי הכנסתם חזרה למיכל המים.
10. 3-5 ימים לאחר הבקיעה הראשונית, בדקו ויזואלית את הזחלים (2^nd עד 4^th instar) עבור סמן מהונדס (אם רלוונטי). חשב את תרומת הזכר כמספר הזחלים הטרנסגניים F₂ חלקי מספר הזחלים הכולל לכל קו יתושים.

8. קביעת אריכות ימים של יתושים

1. העבירו 50 זכרים ו-50 נקבות WT או יתושים מהונדסים שאינם מוזנים בדם למתחם מתאים. השתמשו בקרטונים של 64 אונקיות, כשהפתח העליון מרופד בצינור גרבונים, מעוות וסגור, לגישה קלה ומניפולציה ליתושים ככל שהניסוי מתקדם (איור 7).
   הערה: מומלץ לעשות זאת בשלשה למטרות סטטיסטיות.
2. לספק מקור סוכר ומים. כאן נעשה שימוש בצימוקים ובכוס מלאה במים מרופדת בגזה, מאובטחת בשתי גומיות.
3. עקוב אחר מספר היתושים הזכרים והנקבות המתים בכל יום. חישוב תוחלת החיים כמספר הימים הממוצע שחלפו לפני שהיתושים מתים על פני הכלובים, השמטת יתושים שמתים מסיבות שאינן אינפורמטיביות (סיבות שאינן נובעות מתוחלת החיים של היתושים, כגון מעיכה או טביעה בסוכר) והשמטת יתושים שעדיין חיים בסוף המחקר.
   הערה: הישרדות מוגדרת כהסתברות לחיות עד זמן t, או הפונקציה S(t) = Pr(T>t). הישרדות חציונית היא הזמן שבו ההסתברות להישרדות היא 0.5, או T_0.5 = ^S-1 x 0.5.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול הנ"ל הוערכה כשירותם של שני קווי יתושים: (1) נוק בתיווך CRISPR/Cas9 מתוך Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424) חלבון רוק ו-(2) Ae. קווים מצריים המבטאים כונני גנים אוטונומיים בתיווך CRISPR/Cas9⁹. במקרה של הראשון, נוצר קו נוק-אאוט הומוזיגוטי D7L1 על ידי ניצול מסלול הצטרפות הקצה הלא הומולוגי (N...

Discussion

Ae. מחקרי כושר מצריים מבוצעים לעתים קרובות במעבדה כדי להעריך את עלויות הכושר הקשורות למטען מהונדס (למשל, אלמנטים מניעי גנים) או נוקאאוטים גנטיים, כפי שנדון בכתב יד זה; עם זאת, מחקרים אלה עשויים להתבצע למגוון מטרות - כל מטרה שמטרתה להעריך את בריאותו של Ae. קבוצה מצרית, כגון וולב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 oz. translucent plastic souffle cups	WebstaurantStore	301100PC
2 oz. translucent polystyrene souffle cups	WebstaurantStore	760P200N
3 mL plastic pipettors	Cornin	357524
50 mL conical tubes	Any brand
64 oz. white double poly-coated paper food cup	WebstaurantStore	999SOUP64WB	for mosquito enclosement
65 mm lens	Canon	MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo	Canon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
Aedes aegypti mosquitoes	BEI	multiple strains as eggs are available
Artifical membrane feeders	https://lillieglassblowers.com/	Meduim membrane feeder, Custom made, 33mm	Chemglass also offers, but sizes are wrong for us. Ours are about 3 cm?
ATP	MP Biomedical	ICN15026605	Any good quality ATP, 10mM filter sterile aliquots at -20
Autoclave			for sterilizing water for hatching
Canon EOS 7D camera	Canon	3814B004	for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
defibrinated sheep blood	Colorado Serum Co.	60 ml, every 2 weeks	https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
Dual Gooseneck Microscope Illuminator	Dolan Jenner Fiber-Lite 180	181-1 System
Ethanol
Forceps	Dumont	5SF
Gauze		omnisorb ii	4" non-woven sponges
glass microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Glass Petri dishes, 100 × 15 mm	VWR	75845-546	for anesthesizing/manipulating mosquitoes on ice
Hogs' gut	Any Deli		we buy in bulk, split, wash and store in small aliquots of ~4X12" at -20 in 50 ml conical
Ice
Ice bucket
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Leica GZ4 StereoZoom microscope			for screening transgenic mosquitoes (if applicable)
Paintbrush	AIT synthetic brush	size 10-0	for manipulating larvae/pupae (Amazon)
Panty hose	Walmart	L'eggs Everyday	Women's Nylon Plus Knee Highs Sheer Toe, 16 pairs (plus fits the carton)
Pencils	Any brand
Plastic containers for 2° storage of cartons	Walmart		Sterilite 58 Qt Storage Box Clear Base White Lid Set of 8
Plastic containers for growing larvae	Walmart		Sterilite 28 Qt. Storage Box Plastic, White, Set of 10
Plastic containers for hatching larvae	Walmart		Sterilite 6 Qt. Storage Box Plastic, White
polypropylene clear deli containers	WebstaurantStore	127DM12BULK	12 oz, or 16 oz if needed for bigger (127RD16BULK)
Rubber bands	Office Max	#100736/#909606 /#3777415	12", #64 and #10
Rubber stopper	VWR	217-0515	for mosquito enclosement
Sugar source, such as sugar cubes or raisins
Tetramin flake food	Tetramin	16106
tpsDig	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
tpsUtil	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
White organza fabric 8” × 8”	FabricWholesale.com	4491676	Joann Casa Collection Organza Fabric by Casa Collection
Whitman Grade 1 Qualitative Filter paper	Whitman	1001-824	for egg papers. The white color makes it easier to see the black eggs.