Cuantificación de los costos de aptitud en mosquitos transgénicos Aedes aegypti

Resumen

El presente protocolo describe cómo medir los datos de los parámetros de vida comunes en los mosquitos Aedes aegypti , incluyendo la fecundidad, el tamaño de las alas, la fertilidad, la proporción de sexos, la viabilidad, los tiempos de desarrollo, la contribución de los machos y la longevidad adulta. Estas mediciones se pueden utilizar para evaluar la aptitud de los mosquitos transgénicos.

Resumen

Los mosquitos transgénicos a menudo muestran costos de aptitud en comparación con sus contrapartes de tipo salvaje. En este sentido, los estudios de costos de aptitud implican la recopilación de datos de parámetros de vida de mosquitos modificados genéticamente y compararlos con mosquitos que carecen de transgenes del mismo fondo genético. Este manuscrito ilustra cómo medir los rasgos comunes de la historia de vida en el mosquito Aedes aegypti, incluyendo la fecundidad, el tamaño y la forma de las alas, la fertilidad, la proporción de sexos, la viabilidad, los tiempos de desarrollo, la contribución de los machos y la longevidad adulta. Se eligieron estos parámetros porque reflejan el éxito reproductivo, son fáciles de medir y se reportan comúnmente en la literatura. Los resultados representativos cuantifican los costos de aptitud asociados con un knock-out de genes o con una sola inserción de un elemento de impulsor genético. Es importante estandarizar la forma en que se recopilan los datos de los parámetros de vida, ya que dichos datos pueden utilizarse para comparar la salud de los mosquitos transgénicos generados en estudios o para modelar la tasa de fijación de transgenes en una población de mosquitos de tipo salvaje simulada. Aunque este protocolo es específico para Aedes aegypti transgénico, también puede utilizarse para otras especies de mosquitos u otras condiciones de tratamiento experimental, con la salvedad de que ciertos contextos biológicos pueden requerir adaptaciones especiales.

Introducción

La supervivencia del más apto es la idea darwiniana de que los individuos que albergan genes mejor adaptados a su entorno transmitirán esos genes^{a las generaciones} posteriores. Esto significa que es la aptitud la que determina si sus genes sobrevivirán. Este concepto de más de 150 años de antigüedad es quizás el determinante más significativo de la ingeniería de un impulso genético exitoso en mosquitos transgénicos. Los impulsores genéticos, o el patrón de herencia supermendeliano de un elemento genético egoísta que le permite propagarse a través de las poblaciones², están siendo explorados para el manejo genético de plagas³. En el contexto del control de vectores, esta estrategia tiene como objetivo reemplazar los artrópodos de tipo salvaje (WT) por aquellos resistentes a los patógenos (modificación de la población) o eliminarlos por completo (supresión de la población)⁴. Sin embargo, los mosquitos transgénicos a menudo exhiben costos de aptitud (también llamados carga genética) en comparación con sus contrapartes WT, lo que significa que el transgén se perderá en poblaciones que pueden superarlos. Por lo tanto, el acoplamiento de los transgenes con un sistema de impulsores genéticos es necesario para compensar los costos de aptitud y empujar el transgén a través de la población a niveles mayores que los esperados de la herencia mendeliana^típica.

Los estudios de laboratorio en especies de mosquitos vectores han demostrado que los transgenes a menudo muestran costos de aptitud ^5,6,7. Por ejemplo, Irvin et al. midió varios parámetros de vida en Aedes (Ae.) aegypti modificados para expresar genes mejorados de proteína verde fluorescente (eGFP) o transposasa bajo Drosophila actina 5C o promotores sintéticos 3XP3, y los comparó con la cepa Orlando de tipo salvaje (el mismo fondo genético del que se derivaron)⁵. En particular, encontraron que todas las cepas transgénicas habían reducido significativamente la aptitud reproductiva⁵. Dependiendo del transgén, algunos mosquitos Anopheles (An.) que expresaban transgenes que inhibían el desarrollo del parásito Plasmodium también exhibieron costos de aptitud⁶. Específicamente, An. stephensi que expresa una fosfolipasa de veneno de abeja (PLA2) bajo promotores constitutivos o inducibles por harina de sangre puso significativamente menos huevos en comparación con los controles⁶. Esos autores también encontraron que los Anopheles transgénicos que expresaban un transgén diferente, un tetrámero de dodecapéptido SM1, no exhibían costos de aptitud, lo que los llevó a concluir que los costos de aptitud conferidos por el transgén dependen, al menos en parte, del efecto de la proteína transgénica producida⁶. De hecho, los costos de aptitud pueden atribuirse a productos transgénicos, efectos posicionales, efectos fuera del objetivo, mutagénesis insercional o efectos de endogamia en cepas criadas en laboratorio⁷. Por lo tanto, los impulsores genéticos deben ser lo suficientemente robustos como para compensar estos costos de aptitud inducidos por transgenes y, al mismo tiempo, evitar el desarrollo de inserciones y deleciones (indels) que bloqueen el propio impulso.

Los costos de desarrollo o aptitud reproductiva pueden medirse en estudios de laboratorio o en jaulas⁷, con la salvedad de que factores desconocidos en el campo también pueden tener un impacto. No obstante, los estudios de aptitud controlada son un primer paso importante cuando se planifica o evalúa la liberación de mosquitos modificados genéticamente, como un programa de impulsores genéticos, para determinar si la línea transgénica persistirá durante las generaciones siguientes. Por ejemplo, Hammond et al. evaluado Un impulsor genético basado en CRISPR/Cas9 de gambiae destinado a alterar los genes necesarios para la fertilidad femenina⁸. A través de estudios en jaulas mantenidos durante al menos 25 generaciones, los autores encontraron que los mosquitos incurrieron en alelos resistentes a los impulsores genéticos que bloquearon la división dirigida a CRISPR y restauraron la fertilidad^femenina. Sus esfuerzos de modelado sugirieron que la fertilidad en las hembras heterocigóticas para el impulso genético tuvo los impactos más dramáticos en la fijación del impulso genético en condiciones simuladas⁸. En esta misma línea, Ae. aegypti (cepa del ojo blanco de Higgs, HWE) modificada para expresar casetes de impulsores genéticos autónomos bajo diferentes promotores o en diferentes loci intergénicos exhibió diferentes tasas de fijación de impulsores genéticos en poblaciones simuladas⁹. Utilizando el modelo MGDrivE¹⁰, combinado con las tasas medidas de formación de indel, los efectos maternos y los datos de parámetros de vida recopilados en laboratorio, los autores encontraron que la aptitud del mosquito influyó más fuertemente en la persistencia del impulsor genético en condiciones simuladas⁹. Los costos de aptitud que probablemente perjudiquen la eficiencia del impulso genético son atribuibles a la (sobre) expresión somática de Cas9 o del gen al que se dirige, particularmente en heterocigotos, en lugar del impulso intrínseco en sí 11,12,13,14,15,16,17.

Dada su importancia, la aptitud es un factor importante para la capacidad de una línea transgénica de persistir durante las generaciones subsiguientes, y puede utilizarse como indicador de cualquier efecto fisiológico asociado con un transgén. Por ejemplo, los efectos fuera del objetivo pueden estar asociados con los costos de aptitud física. En este caso, se recomienda el retrocruzamiento de una línea transgénica durante varias generaciones. Además, también puede ser necesario cruzar la línea transgénica con una que refleje una población de campo para investigar qué tan bien puede competir la población transgénica en el mundo real. Con el fin de cuantificar los costos de aptitud para que puedan ser comparables, este manuscrito proporciona protocolos simples para medir los rasgos comunes de la historia de vida en mosquitos Ae. aegypti, con un énfasis particular en los costos de aptitud asociados con transgenes, de modo que tales estudios puedan reproducirse más fácilmente. Los protocolos incluyen fecundidad, fertilidad, proporción de sexos, viabilidad, tiempos de desarrollo, contribución masculina y longevidad adulta. La medición de la longitud y el área del ala también se eligió como una medida de aptitud física, ya que se correlaciona con la longitud del tórax^18,19 y las mediciones del tamaño corporal, que está directamente relacionado con el tamaño de la harina de sangre, la fecundidad y la inmunidad^20,21. Aunque hay muchas maneras de evaluar la aptitud, estos parámetros se eligieron porque reflejan el éxito reproductivo, son fáciles de medir y se informan comúnmente en la literatura.

Protocolo

NOTA: Este protocolo está escrito para líneas transgénicas y de tipo salvaje Ae. aegypti que han sido previamente validadas y establecidas. Para más información sobre la generación de Ae. aegypti transgénica, véase Kistler et al.²² y Coates y cols.²³. Todos los experimentos que se describen a continuación se llevaron a cabo con arreglo a los procedimientos estándar de cría de Ae. aegypti . Los mosquitos se mantuvieron a 28 °C con 75%-80% de humedad relativa y un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad. Se recomienda encarecidamente un mínimo de 100 papeles de huevo individuales por mancha de mosquito con fines estadísticos. Los estudios completos de acondicionamiento físico tardan aproximadamente 3 meses en completarse (Figura 1).

1. Medición de la fecundidad en mosquitos hembra

1. Eclosionan mosquitos transgénicos y WT (del mismo fondo genético pero sin el transgén) colocando papel de huevo en agua estéril durante la noche en el insectario, siguiendo las condiciones estándar de cría. Permita que las larvas se alimenten ad libitum proporcionando varias gotas (cada una de aproximadamente 50 μL) de purín de alimento para peces molidos (Tetramin) (aproximadamente 30% p/v). Las larvas del primer estadio son reconocibles 1 día después de la eclosión. Coloque las larvas en recipientes más grandes para que no haya aglomeración, generalmente se pueden criar de 100 a 150 larvas en un volumen de agua de 1 L con una superficie de aproximadamente 250 cm². Continúe proporcionando purín de Tetramin como fuente de alimento, permitiendo que las larvas se alimenten ad libitum. Agregue la suspensión de comida en gotas discretas para que las larvas siempre tengan suficiente alimento disponible y para que el agua no parezca turbia. Las larvas aumentarán de tamaño con cada estadio y, finalmente, entrarán en pupación en las bandejas de las larvas.
2. Una vez que las pupas comiencen a emerger, ~ 5-6 días después de la eclosión, sepárelas por sexo para asegurarse de que los adultos sean vírgenes una vez que emerjan (para el apareamiento posterior), como se describe a continuación.
   1. Para clasificar las pupas por sexo, comience por recogerlas con pipetas de plástico de 3 ml en pequeños vasos de plástico que contengan agua limpia del grifo. Las pupas de los machos tienden a ser más pequeñas y tienden a emerger primero en comparación con las hembras. Primero, clasifique las pupas por tamaño y luego confirme esta pantalla inicial por morfología.
   2. Mueva la pupa a un portaobjetos de microscopio de vidrio y elimine el exceso de agua con un pañuelo de papel. Esto inmoviliza la pupa. Bajo un estereoscopio con un aumento de 2x-4x, coloque la pupa con el lado ventral hacia arriba con un pincel de punta fina.
   3. Analice visualmente la cola para detectar diferencias en la forma del lóbulo genital (al final de la pupa, segmentos abdominales detrás de las paletas; Figura 2). Las hembras tienen aletas puntiagudas que se extienden más allá de los lóbulos genitales, que se asemejan aproximadamente a una corona o dientes de vampiro, mientras que los lóbulos genitales masculinos son redondeados y no tienen estas estructuras puntiagudas. Véase Carvalho y cols.²⁴ para cifras adicionales.
3. Coloque las pupas masculinas y femeninas en tazas de agua separadas y colóquelas en una contención adecuada, por ejemplo, cajas de cartón de 1,9 L (1/2 galón o 64 oz) con tela de organdí blanco de 0,2 m x 0,2 m (8 pulgadas x 8 pulgadas), cada una con ~ 150 pupas.
4. Proporcione una fuente de azúcar y agua en la parte superior de las jaulas (por ejemplo, pasas y una taza llena de agua cubierta con gasa, asegurada con dos bandas elásticas). Corta un agujero del tamaño de un bolígrafo en las cajas y cúbrelo con un tapón de goma para que se puedan agregar pupas adicionales a las jaulas a medida que emerjan.
5. A los 3-5 días después de la emergencia de los adultos, anestesiar los mosquitos colocando los cartones a 4 °C durante ~2-5 min. A pesar de que todavía pueden retorcerse, los mosquitos están suficientemente anestesiados una vez que la mayoría cae al fondo de la caja. Coloque los mosquitos en una placa de Petri de vidrio sobre hielo durante ~ 30 min-1 h.
   NOTA: Dejar a los mosquitos a 4 °C durante demasiado tiempo puede afectar significativamente su salud, aunque no hemos encontrado ningún impacto si se dejan en el hielo hasta 1 h.
6. Cruza machos WT o transgénicos GD1 o GD2⁹ (impulsores genéticos basados en CRISPR/Cas-9) en masa con hembras WT vírgenes (control) añadiendo mosquitos anestesiados en proporciones de cinco WT o machos transgénicos por una hembra WT en cartones de mosquitos, cada uno de los cuales contiene ~150 mosquitos. Asegúrese de etiquetar las jaulas por tipo de macho.
   NOTA: Este esquema de cruzamiento es para determinar la aptitud para los hemicigotos GD1 o GD2⁹ (es decir, mosquitos que albergan una copia del transgén). Para determinar la aptitud de las líneas transgénicas homocigóticas, el esquema de cruzamiento puede adaptarse de modo que se permita el apareamiento de machos y hembras transgénicos en comparación con los cruces de machos y hembras WT.
7. Después de 2-3 días, alimenta a las hembras con sangre siguiendo las prácticas estándar de cría²⁵ proporcionando una fuente de sangre en la parte superior de la jaula. Retire la fuente de azúcar 24 horas antes de la alimentación con sangre y la fuente de agua ~ 2-3 horas antes de la alimentación con sangre para aumentar la eficiencia de la alimentación.
8. Después de la alimentación con sangre, anestesiar a los mosquitos colocándolos a 4 °C, como en el paso 1.5.
9. Separe las hembras alimentadas con sangre (completamente congestionadas) de las hembras no alimentadas examinando visualmente su abdomen para detectar congestión. Deseche los machos no alimentados, parcialmente alimentados y machos.
10. Vuelva a colocar a las hembras hinchadas en sus respectivas jaulas y proporcione una fuente de azúcar y agua en la parte superior de las jaulas.
11. Después de 2-3 días, coloque las hembras individuales en tubos cónicos de 50 mL forrados con papel de filtro que haya sido preetiquetado con lápiz (Figura 3). Cubra los tubos cónicos con malla y selle con dos gomas elásticas.
12. Una vez que las hembras estén despiertas, llene todos los tubos con ~ 5 ml de agua del grifo. Coloque un pequeño trozo de pasas o una bola de algodón empapada en azúcar encima de cada tubo cónico. Deje las hembras durante 1-2 días en el insectario y déjelas ovipositar.
13. Después de 1-2 días, drene cada tubo cónico y anestesie los mosquitos colocándolos a 4 ° C. Para un procesamiento rápido, use la punta de una pipeta de plástico de 3 ml presionada contra la malla para drenar el agua de cada tubo cónico. Gira los tubos boca abajo y colócalos encima de una toalla de papel para escurrir. Coloque los tubos cónicos de 50 ml en un soporte para tubos y coloque la rejilla a 4 °C.
14. Recoja el papel de huevo y cuente el número de huevos en cada papel. Cuente las hembras que no ponen huevos como 0 e inclúyalas en el análisis. Calcule la fecundidad promedio como el número total de huevos contados en cada papel dividido por el número total de hembras examinadas.
    NOTA: Las imágenes digitales de los papeles de huevo individuales pueden servir como un registro visual para la confirmación del conteo (Figura 4).
15. Seca los papeles de huevo y colócalos de nuevo en el insectario. Se recomienda que los papeles de huevo se sequen durante al menos 3-5 días para una eclosión óptima²⁵.

2. Medición de la longitud del ala, el área y el tamaño del centroide

1. Congele al menos 25 hembras alimentadas con sangre de la misma edad que hayan sido alimentadas con sangre y que hayan sido transgénicas del estudio de fecundidad completado, colocando las jaulas para mosquitos a -20 °C durante aproximadamente 15 minutos.
   NOTA: No congele durante un período de tiempo más largo y no agite ni deje caer el recipiente, ya que esto puede hacer que las alas se caigan de los mosquitos.
2. Diseccionar el ala izquierda de cada mosquito, extirpando en la articulación del ala y el tórax, eliminando la totalidad del ala, siguiendo el siguiente protocolo.
   1. En una mano, sostenga el mosquito con fórceps, agarrando la región del tórax debajo de las alas.
   2. Usando otro par de pinzas en la otra mano, diseccione el ala izquierda de cada mosquito, extirpando la articulación del ala y el tórax usando una presión suave para tirar del ala, quitando la totalidad del ala sin rasgar las venas del ala.
3. Con pinzas, coloque el ala en un portaobjetos de vidrio, acostado. Con una pipeta de transferencia, agregue una gota de una solución madre de 15 ml, compuesta por un 70% de etanol, y una gota de jabón para platos en el ala del portaobjetos.
4. Agregue una gota de glicerol al 80% al cubreobjetos y colóquelo encima del ala en la solución de etanol y jabón.
5. Fotografíe las alas montadas en las diapositivas con una cámara con una lente de 65 mm (7D-65 mm-1x; zoom = 1, 200, 6.3, ISO = 100). Tenga en cuenta la escala de píxeles/mm y asegúrese de que permanezca igual para todas las imágenes. Si se visualizan varias alas juntas, recorte las fotos a alas individuales y agregue barras de escala a cada foto. Guarde las imágenes en formato TIFF con compresión LZW, con cada imagen claramente etiquetada con toda la información de cada ala.
   NOTA: Las alas pueden ser fotografiadas usando una cámara y un aumento diferentes o con una cámara conectada a un microscopio para otros estudios, si los ajustes siguen siendo los mismos y la escala de píxeles/mm sigue siendo la misma para cada ala fotografiada en el estudio. La relación píxel/mm se tendrá en cuenta a la hora de determinar las mediciones.
6. Descargue tpsUtil y tpsDig, que son softwares gratuitos de procesamiento de imágenes morfométricas. Consulte Rohlf ^26,27 para obtener información más detallada sobre el software.
7. Digitalice las alas usando tpsUtil para crear un archivo TPS de las fotografías de las alas para el siguiente paso de digitalización.
   1. Para ello, abra tpsUtil y, en operación, seleccione Compilar archivo tps a partir de imágenes. Haga clic en la entrada, seleccione el archivo que contiene las imágenes de ala individuales y, a continuación, seleccione cualquier imagen para elegir esta carpeta. Haga clic en salida y asigne un nombre al archivo que se creará en formato .tps. Haga clic en Guardar.
   2. A continuación, en Acciones, haga clic en configuración. Seleccione Incluir todo, haga clic en Crear y cierre el cuadro emergente. En operación, ahora seleccione Ordenar muestras aleatoriamente. Haga clic en la entrada y seleccione el archivo .tps que se acaba de crear. Haga clic en salida, cambie el nombre del archivo .tps para indicar que se trata de la versión del archivo con los ejemplos aleatorizados y haga clic en Guardar. A continuación, haga clic en Crear. Cierre el programa tpsUtil.
      NOTA: Para reducir el error de medición, las fotos de las alas pueden duplicarse y utilizarse dos veces para una réplica técnica.
8. Utilice el software tpsDig para identificar coordenadas cartesianas bidimensionales para los puntos de referencia. En entrada, seleccione el archivo .tps creado en el paso 2.7. Establezca la escala en la escala determinada por el paso 2.5; En Opciones, seleccione Herramientas de imagen y, a continuación, haga clic en Medir.
9. Agregue puntos de referencia a la imagen haciendo clic en el icono de cruz azul que representa digitalizar puntos de referencia y, a continuación, haga clic en las articulaciones de las alas indicadas en la Figura 5, en orden desde el hito 1 hasta el hito 14.
   NOTA: Estos puntos de referencia se eligieron porque se han utilizado previamente en la digitalización y el análisis de puntos de referencia de las alas¹⁹, son fáciles de localizar en las uniones de las venas de las alas en muchas muestras y proporcionan suficientes puntos de referencia de las alas para capturar el tamaño y la forma del ala.
10. Al marcar puntos de referencia, marque los puntos de referencia faltantes u oscurecidos (debido al plegado o daño de las alas) como faltantes en tpsDig haciendo clic en el icono M para excluirlos del análisis y conservar el orden correcto de los puntos de referencia. Haga clic en la flecha roja hacia la derecha para repetir la digitalización del punto de referencia para las siguientes imágenes hasta que se hayan completado todas las imágenes del archivo. Guarde y cierre el archivo.
    NOTA: Los puntos de referencia deben agregarse a la imagen del ala en el orden correcto para cada imagen para que los cálculos de la longitud, el área y el tamaño del ala sean correctos.
11. Calcule la longitud y el área del ala utilizando el script R proporcionado en el Archivo Complementario 1, modificando la ubicación del archivo .tps y la escala de la imagen según el experimento.
12. Calcule el tamaño del centroide del ala, una medida de tamaño estadísticamente independiente de la forma, definida como la raíz cuadrada de la suma de las distancias al cuadrado de cada uno de los puntos de referencia desde el punto central del ala^28,29.
13. Utilice una alineación generalizada de Procusto para eliminar la variación que no es de forma y trazar las coordenadas medias de los puntos de referencia, utilizando alas que tengan todos los puntos de referencia intactos. Tanto para el tamaño del centroide del ala como para la determinación del punto de referencia medio, utilice el script R proporcionado en el archivo complementario 2, modificando la ubicación del archivo .tps y la escala de la imagen según el experimento.

3. Evaluación de la fertilidad de los óvulos

1. Eclosionar huevos individuales F₁ de los papeles recolectados de hembras individuales (recolectados en el paso 1) en recipientes de polipropileno transparente que contienen ~ 100 mL de agua desionizada recién esterilizada. Agregue dos o tres gotas de lechada de alimento para peces molidos para la alimentación ad libitum . Cubra la parte superior de los recipientes con malla u organdí y asegúrelos con una banda elástica.
2. A los 2-3 días después de la eclosión, retire los papeles de huevo del agua y déjelos secar durante la noche colocándolos en un recipiente nuevo que esté cubierto con una tapa o red y dejándolos en el insectario.
3. Vuelva a incubar los papeles de huevo en los mismos recipientes en los que se incubaron inicialmente colocándolos nuevamente en el recipiente de agua.
   NOTA: Secar y volver a incubar los papeles de huevo mejora en gran medida la eficiencia de la eclosión. Esto puede no ser necesario para otras especies de mosquitos.
4. A los 3-5 días después de la eclosión inicial, inspeccione visualmente las larvas (^{2º a 4º} estadio) en busca de un marcador transgénico (si corresponde; Figura 6). Inspeccione varias larvas bajo un microscopio fluorescente al mismo tiempo colocándolas en un pedazo de papel de filtro colocado encima de un organdí o malla forrada con toallas de papel. Las toallas de papel absorben el exceso de agua, por lo que el papel de filtro se puede utilizar para cribar y manipular las larvas inmovilizadas.
5. Registrar el número de larvas transgénicas positivas o negativas. Deseche las larvas negativas.
6. Limpiar el agua de las larvas para asegurar tiempos óptimos de desarrollo. Para hacer esto, pipetee las larvas en una taza pequeña, deseche el agua sucia y reemplácela con agua fresca del grifo. Agregue las larvas positivas y asegúrese de que haya suficiente lechada de alimento para peces molidos disponible.
7. Calcule la fertilidad como el número de larvas transgénicas o de control dividido por el número total de huevos.

4. Determinación de la proporción de sexos en las pupas

1. Hasta 14 días después de la eclosión, continúe recolectando y registrando el número de pupas machos y hembras (como se describe en el paso 1.2.3). Las hembras o los machos se pueden agrupar, por sexo, en pequeñas tazas alojadas en recipientes de 1,9 L.
2. Para determinar la proporción de sexos, agregue el número de hembras F₁ o el número de machos F₁ recolectados a lo largo de la línea de tiempo del estudio por mosquito hembra adulto individual. Divida este número por el número total de pupas recolectadas para la misma línea de mosquitos generadas a partir de una sola hembra.

5. Determinación de la viabilidad de las larvas

1. Para determinar la viabilidad de las larvas, agregue el número total de pupas recolectadas a lo largo de la línea de tiempo del estudio por mosquito hembra adulto individual.
2. Divida este número por el número total de larvas contadas por mosquito hembra adulto individual para esa misma línea contada en el paso 3.

6. Determinación del tiempo de desarrollo de la larva a la pupa

1. Para determinar el desarrollo de larvas a pupas, realice un seguimiento diario del número de larvas y el número de pupas por línea.
2. Calcule el desarrollo de larvas a pupas como el tiempo promedio hasta el desarrollo de pupas después de la eclosión.

7. Determinación de la contribución masculina

1. Usando machos de la misma edad, anestesiar mosquitos machos transgénicos vírgenes adultos en hielo, así como mosquitos de control machos y hembras vírgenes adultos.
2. Cruce los adultos varones transgénicos o de control con las hembras adultas de control agregando 50 machos transgénicos o 50 machos de control (de la misma edad) con 100 hembras de control en cajas de cartón de 64 oz, de modo que haya un total de 50 machos con 100 hembras (dos hembras de control: un macho de control o transgénico). Asegúrese de etiquetar qué caja contiene machos transgénicos y qué caja contiene machos de control.
3. Permita que ocurra el apareamiento durante 2-3 días. Después de este tiempo, ofrezca a los mosquitos una comida de sangre siguiendo las prácticas estándar de cría.
4. Tres días después de la alimentación con sangre, separe las hembras individuales completamente congestionadas en tubos cónicos de 50 ml forrados con papel de filtro blanco preetiquetado, como se describe en el paso 1 (ensayo de fecundidad). Deseche las hembras no alimentadas u ofrézcales otra harina de sangre al día siguiente. Llene todos los tubos con ~ 5 ml de agua del grifo. Coloque un pequeño trozo de pasas en la malla colocada encima de cada tubo cónico.
5. Deje a las hembras durante 1-2 días en el insectario y déjelas ovipositar. Inspeccione visualmente los papeles de huevo durante 4-5 días después de la harina de sangre para ver si hay huevos. Permita que las hembras tengan un día adicional para ovipositar y aumentar las tasas de puesta de huevos.
6. Para recoger los papeles de huevo, drenar el agua y anestesiar a las hembras colocando tubos cónicos a 4 °C, como se describió anteriormente. Deseche los mosquitos hembra colocándolos en etanol al 70%.
7. Deje los papeles en tubos en el insectario durante al menos 5 días para que se sequen. Use pinzas para quitar los papeles y colóquelos en recipientes transparentes de polipropileno que contengan ~ 100 ml de agua desionizada recién esterilizada para la eclosión. Agregue 2-3 gotas de purín de alimento para peces molidos para la alimentación ad libitum . Cubra la parte superior de los recipientes con malla u organdí, asegurada con una banda elástica.
8. A los 2-3 días después de la eclosión, retire los papeles de huevo del agua y déjelos secar durante la noche colocándolos en un nuevo recipiente que esté cubierto con una tapa o red y volviéndolos a colocar en el insectario.
9. Vuelva a incubar los papeles de huevo en los mismos recipientes colocándolos nuevamente en el recipiente de agua.
10. A los 3-5 días después de la eclosión inicial, inspeccione visualmente las larvas (^{2º a 4º} estadio) en busca de un marcador transgénico (si corresponde). Calcule la contribución masculina como el número de larvas transgénicas F₂ dividido por el número de larvas totales por línea de mosquitos.

8. Determinación de la longevidad de los mosquitos

1. Transfiera 50 mosquitos machos y 50 hembras de WT o mosquitos transgénicos de la misma edad que no se alimentan con sangre a un recinto adecuado. Use cajas de cartón de 64 onzas, con la abertura superior forrada con pantimedias, retorcidas y anudadas, para facilitar el acceso y la manipulación de los mosquitos a medida que avanza el experimento (Figura 7).
   NOTA: Se recomienda hacer esto por triplicado con fines estadísticos.
2. Proporcione una fuente de azúcar y agua. Aquí, se usaban pasas y una taza llena de agua forrada con gasa, asegurada con dos gomas elásticas.
3. Lleve un registro del número de mosquitos machos y hembras muertos cada día. Calcule la longevidad como el número promedio de días que pasaron antes de que los mosquitos murieran en las jaulas, omitiendo los mosquitos que mueren por causas no informativas (causas que no se deben a la vida útil del mosquito, como ser aplastado o ahogado en azúcar) y omitiendo los mosquitos que aún están vivos al final del estudio.
   NOTA: La supervivencia se define como la probabilidad de estar vivo hasta el tiempo t, o la función S(t) = Pr(T>t). La mediana de supervivencia es el tiempo en el que la probabilidad de supervivencia es de 0,5, o T_0,5 = ^S-1 x 0,5.

Resultados

Siguiendo el protocolo anterior, se evaluó la aptitud de dos líneas de mosquitos: (1) knock out mediado por CRISPR/Cas9 de la proteína salival Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424) y (2) líneas Ae. aegypti que expresan impulsores genéticos autónomos mediados por CRISPR/Cas9⁹. En el caso del primero, se estableció una línea homocigota de knock-out D7L1 explotando la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) para generar la disrupción tras la microinyección de embriones con...

Discusión

Los estudios de aptitud de Ae. aegypti a menudo se realizan en el laboratorio para evaluar los costos de aptitud asociados con la carga transgénica (por ejemplo, elementos de impulsores genéticos) o eliminaciones de genes, como se discute en este manuscrito; sin embargo, estos estudios se pueden realizar para una variedad de propósitos, cualquiera que tenga como objetivo evaluar la salud de un grupo de Ae. aegypti, como el infectado por Wolbachia ^30,31

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 oz. translucent plastic souffle cups	WebstaurantStore	301100PC
2 oz. translucent polystyrene souffle cups	WebstaurantStore	760P200N
3 mL plastic pipettors	Cornin	357524
50 mL conical tubes	Any brand
64 oz. white double poly-coated paper food cup	WebstaurantStore	999SOUP64WB	for mosquito enclosement
65 mm lens	Canon	MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo	Canon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
Aedes aegypti mosquitoes	BEI	multiple strains as eggs are available
Artifical membrane feeders	https://lillieglassblowers.com/	Meduim membrane feeder, Custom made, 33mm	Chemglass also offers, but sizes are wrong for us. Ours are about 3 cm?
ATP	MP Biomedical	ICN15026605	Any good quality ATP, 10mM filter sterile aliquots at -20
Autoclave			for sterilizing water for hatching
Canon EOS 7D camera	Canon	3814B004	for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
defibrinated sheep blood	Colorado Serum Co.	60 ml, every 2 weeks	https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
Dual Gooseneck Microscope Illuminator	Dolan Jenner Fiber-Lite 180	181-1 System
Ethanol
Forceps	Dumont	5SF
Gauze		omnisorb ii	4" non-woven sponges
glass microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Glass Petri dishes, 100 × 15 mm	VWR	75845-546	for anesthesizing/manipulating mosquitoes on ice
Hogs' gut	Any Deli		we buy in bulk, split, wash and store in small aliquots of ~4X12" at -20 in 50 ml conical
Ice
Ice bucket
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Leica GZ4 StereoZoom microscope			for screening transgenic mosquitoes (if applicable)
Paintbrush	AIT synthetic brush	size 10-0	for manipulating larvae/pupae (Amazon)
Panty hose	Walmart	L'eggs Everyday	Women's Nylon Plus Knee Highs Sheer Toe, 16 pairs (plus fits the carton)
Pencils	Any brand
Plastic containers for 2° storage of cartons	Walmart		Sterilite 58 Qt Storage Box Clear Base White Lid Set of 8
Plastic containers for growing larvae	Walmart		Sterilite 28 Qt. Storage Box Plastic, White, Set of 10
Plastic containers for hatching larvae	Walmart		Sterilite 6 Qt. Storage Box Plastic, White
polypropylene clear deli containers	WebstaurantStore	127DM12BULK	12 oz, or 16 oz if needed for bigger (127RD16BULK)
Rubber bands	Office Max	#100736/#909606 /#3777415	12", #64 and #10
Rubber stopper	VWR	217-0515	for mosquito enclosement
Sugar source, such as sugar cubes or raisins
Tetramin flake food	Tetramin	16106
tpsDig	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
tpsUtil	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
White organza fabric 8” × 8”	FabricWholesale.com	4491676	Joann Casa Collection Organza Fabric by Casa Collection
Whitman Grade 1 Qualitative Filter paper	Whitman	1001-824	for egg papers. The white color makes it easier to see the black eggs.