Transgenik Aedes aegypti Sivrisineklerinde Kondisyon Maliyetlerinin Ölçülmesi

Özet

Mevcut protokol, Aedes aegypti sivrisineklerinde doğurganlık, kanat boyutu, doğurganlık, cinsiyet oranı, canlılık, gelişme süreleri, erkek katkısı ve yetişkin ömrü dahil olmak üzere ortak yaşam parametresi verilerinin nasıl ölçüleceğini açıklamaktadır. Bu ölçümler, transgenik sivrisineklerin uygunluğunu değerlendirmek için kullanılabilir.

Özet

Transgenik sivrisinekler genellikle vahşi tip muadillerine kıyasla fitness maliyetleri gösterir. Bu bağlamda, fitness maliyeti çalışmaları, genetik olarak değiştirilmiş sivrisineklerden yaşam parametresi verilerinin toplanmasını ve bunların aynı genetik geçmişe sahip transgenlerden yoksun sivrisineklerle karşılaştırılmasını içerir. Bu el yazması, sivrisinek Aedes aegypti'deki doğurganlık, kanat boyutu ve şekli, doğurganlık, cinsiyet oranı, canlılık, gelişme süreleri, erkek katkısı ve yetişkin ömrü dahil olmak üzere ortak yaşam öyküsü özelliklerinin nasıl ölçüleceğini göstermektedir. Bu parametreler üreme başarısını yansıttıkları, ölçülmeleri kolay oldukları ve literatürde yaygın olarak bildirildikleri için seçilmiştir. Temsili sonuçlar, bir gen nakavt edilmesi veya bir gen sürücü elemanının tek bir eklenmesi ile ilişkili uygunluk maliyetlerini ölçer. Yaşam parametresi verilerinin nasıl toplandığını standartlaştırmak önemlidir, çünkü bu tür veriler, çalışmalarda üretilen transgenik sivrisineklerin sağlığını karşılaştırmak veya simüle edilmiş bir vahşi tip sivrisinek popülasyonunda transgen fiksasyon oranını modellemek için kullanılabilir. Bu protokol transgenik Aedes aegypti için spesifik olsa da, protokol diğer sivrisinek türleri veya diğer deneysel tedavi koşulları için de kullanılabilir, ancak belirli biyolojik bağlamların özel adaptasyonlar gerektirebileceği uyarısı vardır.

Giriş

En uygun olanın hayatta kalması, çevrelerine en iyi şekilde adapte olmuş genleri barındıran bireylerin bu genleri sonraki nesillere aktaracağına dair Darwinci fikirdir¹. Bu, genlerinin hayatta kalıp kalmayacağını belirleyenin zindelik olduğu anlamına gelir. 150 yıldan daha eski olan bu kavram, transgenik sivrisineklerde başarılı bir gen sürücüsü mühendisliğinin belki de en önemli belirleyicisidir. Gen sürücüleri veya bencil bir genetik elementin popülasyonlara^{yayılmasına} izin veren süper Mendel kalıtım modeli 2, genetik haşere yönetimi³ için araştırılmaktadır. Vektör kontrolü bağlamında, bu strateji ya vahşi tip (WT) eklembacaklıları patojenlere dirençli olanlarla değiştirmeyi (popülasyon modifikasyonu) ya da hepsini birlikte ortadan kaldırmayı (popülasyon baskılama)⁴. Bununla birlikte, transgenik sivrisinekler, WT muadillerine kıyasla genellikle fitness maliyetleri (genetik yük olarak da adlandırılır) sergiler, bu da transgenin onları geride bırakabilecek popülasyonlarda kaybolacağı anlamına gelir. Bu nedenle, transgenlerin bir gen tahrik sistemi ile birleştirilmesi, herhangi bir uygunluk maliyetini dengelemek ve transgeni tipik Mendel kalıtımından beklenenden daha yüksek seviyelerde popülasyon boyunca itmek için gereklidir⁴.

Sivrisinek vektör türleri üzerinde yapılan laboratuvar çalışmaları, transgenlerin genellikle ^5,6,7 fitness maliyeti gösterdiğini göstermiştir. Örneğin, Irvin ve ark. Drosophila aktin 5C veya sentetik 3XP3 promotörleri altında gelişmiş yeşil floresan protein (eGFP) veya transpozaz genlerini eksprese etmek için tasarlanmış Aedes (Ae.) aegypti'de çeşitli yaşam parametrelerini ölçtü ve bunları vahşi tip Orlando suşu (türetildikleri aynı genetik arka plan) ile ^{karşılaştırdı5}. En önemlisi, tüm transgenik suşların üreme uygunluğunu önemli ölçüde azalttığını buldular⁵. Transgene bağlı olarak, Plasmodium parazit gelişimini inhibe eden transgenleri eksprese eden bazı Anopheles (An.) sivrisinekleri de fitness maliyetleri sergiledi⁶. Spesifik olarak, An. stephensi, yapısal veya kan unu ile indüklenebilir promotörler altında bir arı zehiri fosfolipazı (PLA2) eksprese ederek, kontrollere kıyasla önemli ölçüde daha az yumurta bıraktı⁶. Bu yazarlar ayrıca, farklı bir transgeni ifade eden transgenik Anofellerin, bir SM1 dodekapeptid tetramerinin uygunluk maliyetleri göstermediğini bulmuşlardır, bu da onları, transgen tarafından verilen uygunluk maliyetlerinin, en azından kısmen, üretilen transgenik proteinin etkisine bağlı olduğu sonucuna varmalarına yol açmıştır⁶. Gerçekten de, uygunluk maliyetleri, laboratuvarda yetiştirilen suşlarda transgen ürünlere, konumsal etkilere, hedef dışı etkilere, yerleştirme mutajenezine veya akrabalı yetiştirme etkilerine bağlanabilir⁷. Bu nedenle, gen sürücüleri, bu transgen kaynaklı uygunluk maliyetlerini dengeleyecek kadar sağlam olmalı ve aynı zamanda sürücünün kendisini bloke eden ekleme ve silmelerin (indels) geliştirilmesinden kaçınmalıdır.

Gelişimsel veya üreme uygunluğu maliyetleri, laboratuvar veya kafes çalışmalarında⁷ ölçülebilir, ancak alandaki bilinmeyen faktörlerin de bir etkisi olabileceği konusunda bir uyarı vardır. Bununla birlikte, kontrollü uygunluk çalışmaları, transgenik hattın sonraki nesiller boyunca devam edip etmeyeceğini belirlemek için bir gen sürücü programı gibi genetik olarak değiştirilmiş sivrisinek salınımlarını planlarken veya değerlendirirken önemli bir ilk adımdır. Örneğin, Hammond ve ark. Kadın doğurganlığı için gerekli genleri bozmayı amaçlayan bir gambiae CRISPR/Cas9 tabanlı gen sürücüleri^{değerlendirildi 8}. Yazarlar, en az 25 nesil boyunca sürdürülen kafes çalışmaları sayesinde, sivrisineklerin CRISPR hedefli bölünmeyi bloke eden ve kadın doğurganlığını geri kazandıran gen güdümlü dirençli alellere maruz kaldığını buldular⁸. Modelleme çabaları, gen sürücüsü için heterozigot olan dişilerde doğurganlığın, simüle edilmiş koşullarda gen sürücü fiksasyonu üzerinde en dramatik etkilere sahip olduğunu göstermiştir⁸. Aynı doğrultuda, farklı promotörler altında veya farklı intergenik lokuslarda otonom gen sürücü kasetlerini eksprese etmek için tasarlanan Ae. aegypti (Higgs'in Beyaz Göz suşu, HWE), simüle edilmiş popülasyonlarda farklı gen sürücü fiksasyonu oranları sergiledi⁹. Yazarlar, MGDrivE modelleme^10'u, ölçülen indel oluşum oranları, maternal etkiler ve laboratuvarda toplanan yaşam parametresi verileriyle birlikte kullanarak, sivrisinek uygunluğunun simüle edilmiş koşullarda gen sürücüsünün kalıcılığını en güçlü şekilde etkilediğini^{buldular 9}. Gen sürücü verimliliğini bozma olasılığı en yüksek olan uygunluk maliyetleri, içsel sürücünün kendisinden ziyade, somatik Cas9 (aşırı) ekspresyonuna veya özellikle heterozigotlarda hedeflenen genden kaynaklanabilir 11,12,13,14,15,16,17.

Önemi göz önüne alındığında, uygunluk, bir transgenik hattın sonraki nesiller boyunca devam etme yeteneği için önemli bir faktördür ve bir transgen ile ilişkili herhangi bir fizyolojik etki için bir gösterge olarak kullanılabilir. Örneğin, hedef dışı etkiler fitness maliyetleriyle ilişkilendirilebilir. Bu durumda, birkaç nesil boyunca transgenik bir çizginin geri çaprazlanması önerilir. Ayrıca, transgenik popülasyonun gerçek dünyada ne kadar iyi rekabet edebileceğini araştırmak için transgenik çizgiyi bir alan popülasyonunu yansıtan bir çizgiyle geçmek de gerekli olabilir. Uygunluk maliyetlerini karşılaştırılabilir olacak şekilde ölçmek için, bu el yazması, Ae. aegypti sivrisinekleri, transgenlerle ilişkili fitness maliyetlerine özel bir vurgu yaparak, bu tür çalışmaların daha kolay çoğaltılabilmesi için ortak yaşam öyküsü özelliklerini ölçmek için basit protokoller sağlar. Protokoller doğurganlık, doğurganlık, cinsiyet oranı, canlılık, gelişme süreleri, erkek katkısı ve yetişkin ömrünü içerir. Kanat uzunluğu ve alanının ölçülmesi de toraks uzunluğu^18,19 ve kan unu boyutu, doğurganlık ve bağışıklık^20,21 ile doğrudan bağlantılı olan vücut büyüklüğü ölçümleri ile ilişkili olduğu için bir kondisyon ölçümü olarak seçilmiştir. Uygunluğu değerlendirmenin birçok yolu olmasına rağmen, bu parametreler üreme başarısını yansıttıkları, ölçülmesi kolay oldukları ve literatürde yaygın olarak bildirildikleri için seçilmiştir.

Protokol

NOT: Bu protokol, daha önce doğrulanmış ve kurulmuş transgenik ve vahşi tip Ae için yazılmıştır. Transgenik Ae. aegypti üretimi hakkında daha fazla bilgi için, bakınız Kistler et al.²² ve Coates ve ark.²³. Aşağıda özetlenen tüm deneyler standart Ae altında gerçekleştirilmiştir . aegypti yetiştirme prosedürleri. Sivrisinekler 28 °C'de% 75 -% 80 bağıl nem ve 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık döngüsü ile tutuldu. İstatistiksel amaçlar için sivrisinek lekesi başına en az 100 ayrı yumurta kağıdı şiddetle tavsiye edilir. Kapsamlı fitness çalışmalarının tamamlanması yaklaşık 3 ay sürer (Şekil 1).

1. Dişi sivrisineklerde doğurganlığın ölçülmesi

1. Transgenik ve WT sivrisineklerini (aynı genetik geçmişe sahip ancak transgenden yoksun), standart yetiştirme koşullarını izleyerek yumurta kağıtlarını böcek içinde gece boyunca steril suya koyarak yumurtadan çıkarın. Birkaç damla (her biri yaklaşık 50 μL) öğütülmüş balık yemi (Tetramin) bulamacı (kabaca %30 a/h) sağlayarak larvaların ad libitum beslemesine izin verin. İlk instar larvaları yumurtadan çıktıktan 1 gün sonra tanınabilir. Larvaları kalabalık olmayacak şekilde daha büyük kaplara koyun, genellikle 1 L hacimde yaklaşık 250^cm2 yüzey alanına sahip bir suda 100-150 larva yetiştirilebilir. Tetramin bulamacını bir besin kaynağı olarak sağlamaya devam edin ve larvaların ad libitum beslemesine izin verin. Yiyecek bulamacını ayrı damlacıklar halinde ekleyin, böylece larvalar için her zaman yeterli yiyecek bulunur ve böylece su bulanık görünmez. Larvalar her girişte boyut olarak artacak ve sonuçta larva tavalarında pupaya girecektir.
2. Pupalar ortaya çıkmaya başladığında, yumurtadan çıktıktan ~ 5-6 gün sonra, aşağıda açıklandığı gibi, yetişkinlerin ortaya çıktıklarında (sonraki çiftleşme için) bakire olduklarından emin olmak için onları cinsiyetlerine göre ayırın.
   1. Pupaları cinsiyete göre sıralamak için, 3 mL plastik pipetleyiciler kullanarak pupaları temiz musluk suyu içeren küçük plastik kaplara toplayarak başlayın. Erkek pupalar daha küçük olma eğilimindedir ve dişilere kıyasla ilk önce ortaya çıkma eğilimindedir. İlk olarak, pupaları boyuta göre sıralayın ve ardından bu ilk ekranı morfolojiye göre onaylayın.
   2. Pupa'yı bir cam mikroskop lamına taşıyın ve fazla suyu bir mendille birlikte alın. Bu pupayı hareketsiz hale getirir. 2x-4x büyütmeli bir stereoskop altında, ince uçlu bir boya fırçası kullanarak pupa ventral tarafı yukarı gelecek şekilde konumlandırın.
   3. Genital lob şeklindeki farklılıklar için kuyruğu görsel olarak analiz edin (pupa karın segmentlerinin sonunda, küreklerin arkasında; Şekil 2). Dişiler, genital lobları aşan, kabaca bir taç veya vampir dişlere benzeyen sivri yüzgeçlere sahipken, erkek genital lobları yuvarlaktır ve bu sivri yapılara sahip değildir. Bkz. Carvalho ve ark.Ek rakamlar için ²⁴.
3. Erkek ve dişi pupaları ayrı su bardaklarına koyun ve uygun muhafazaya koyun, örneğin, her biri ~ 150 pupa içeren 0,2 m x 0,2 m (8 inç x 8 inç) beyaz organik kumaşla 1,9 L karton (1/2 galon veya 64 oz).
4. Kafeslerin üzerine bir şeker ve su kaynağı sağlayın (örneğin, kuru üzüm ve gazlı bezle kaplı, iki lastik bantla sabitlenmiş su dolu bir kap). Kartonlara kalem büyüklüğünde bir delik açın ve lastik bir tıpa ile örtün, böylece kafesler ortaya çıktıkça kafeslere ek pupa eklenebilir.
5. Erişkin çıkışından 3-5 gün sonra, kartonları ~ 2-5 dakika boyunca 4 ° C'ye yerleştirerek sivrisinekleri uyuşturun. Hala seğirebilseler de, sivrisinekler çoğunluk kartonun dibine düştüğünde yeterince uyuşturulur. Sivrisinekleri ~ 30 dk-1 saat boyunca buz üzerinde bir cam Petri kabına yerleştirin.
   NOT: Sivrisinekleri çok uzun süre 4 ° C'de bırakmak sağlıklarını önemli ölçüde etkileyebilir, ancak 1 saate kadar buz üzerinde bırakıldıklarında herhangi bir etki bulamadık.
6. WT veya transgenik GD1 veya GD2⁹ (CRISPR / Cas-9 tabanlı gen sürücüsü) erkekleri, her biri ~ 150 sivrisinek içeren sivrisinek kartonlarına beş WT veya transgenik erkeğe bir WT dişisine oranlarda anestezi uygulanmış sivrisinekler ekleyerek, bakire WT (kontrol) dişilerle toplu halde çaprazlayın. Kafesleri erkek türüne göre etiketlediğinizden emin olun.
   NOT: Bu geçiş şeması, GD1 veya GD2⁹ hemizigotların (yani, transgenin bir kopyasını barındıran sivrisinekler) uygunluğunu belirlemek içindir. Homozigot transgenik çizgilere uygunluğu belirlemek için, geçiş şeması, transgenik erkek ve dişilerin, WT erkek ve dişilerinin çaprazlamalarına kıyasla çiftleşmesine izin verilecek şekilde uyarlanabilir.
7. 2-3 gün sonra, kafesin üstünde bir kan kaynağı sağlayarak dişileri standart yetiştirme uygulamalarına²⁵ göre kanla besleyin. Besleme verimliliğini artırmak için şeker kaynağını 24 saat kan öncesi beslemeyi ve su kaynağını ~ 2-3 saat kan öncesi çıkarın.
8. Kanla beslendikten sonra, sivrisinekleri adım 1.5'teki gibi 4 °C'ye yerleştirerek uyuşturun.
9. Kanla beslenen (tamamen tıkanmış) dişileri, karınlarını büyüme açısından görsel olarak tarayarak beslenmemiş dişilerden ayırın. Beslenmemiş, kısmen beslenmiş ve erkekleri atın.
10. Tıkanmış dişileri kendi kafeslerine geri koyun ve kafeslerin üzerine bir şeker ve su kaynağı sağlayın.
11. 2-3 gün sonra, tek tek dişileri, kurşun kalemle önceden etiketlenmiş filtre kağıdı ile kaplı 50 mL'lik konik tüplere yerleştirin (Şekil 3). Konik boruları ağ ile örtün ve iki lastik bantla kapatın.
12. Dişiler uyandığında, tüm tüpleri ~ 5 mL musluk suyu ile doldurun. Her konik tüpün üzerine küçük bir parça kuru üzüm veya şekere batırılmış pamuk topu yerleştirin. Dişileri böcekte 1-2 gün bekletin ve yumurtlamalarına izin verin.
13. 1-2 gün sonra, her bir konik tüpü boşaltın ve sivrisinekleri 4 ° C'ye yerleştirerek uyuşturun. Hızlı işleme için, her bir konik tüpten suyu boşaltmak için ağa bastırılmış 3 mL'lik bir plastik pipetörün ucunu kullanın. Tüpleri ters çevirin ve boşaltmak için bir kağıt havlunun üzerine yerleştirin. 50 mL'lik konik tüpleri bir tüp tutucuya yerleştirin ve rafı 4 °C'ye yerleştirin.
14. Yumurta kağıdını toplayın ve her kağıda yumurta sayısını sayın. Yumurtlamayan dişileri 0 olarak sayın ve analize dahil edin. Ortalama doğurganlığı, her bir kağıtta sayılan toplam yumurta sayısının, taranan toplam dişi sayısına bölünmesiyle hesaplayın.
    NOT: Tek tek yumurta kağıtlarının dijital resimleri, sayım onayı için görsel bir kayıt görevi görebilir (Şekil 4).
15. Yumurta kağıtlarını kurutun ve tekrar böceğin içine yerleştirin. Optimum kuluçka için yumurta kağıtlarının en az 3-5 gün kuruması tavsiye edilir²⁵.

2. Kanat uzunluğunun, alanının ve merkez boyutunun ölçülmesi

1. Sivrisinek kafeslerini yaklaşık 15 dakika boyunca -20 ° C'ye yerleştirerek tamamlanan doğurganlık çalışmasından en az 25 WT veya transgenik yaşa uygun kanla beslenen dişileri dondurun.
   NOT: Daha uzun süre donmayın ve kabı sallamayın veya düşürmeyin, çünkü bu, kanatların sivrisineklerden düşmesine neden olabilir.
2. Her sivrisineğin sol kanadını inceleyin, kanadın ve göğüs kafesinin eklemini eksize edin, kanadın tamamını çıkarın, aşağıdaki protokolü izleyin.
   1. Bir elinde, sivrisinekleri forseps ile tutun, kanatların altındaki göğüs bölgesini kavrayın.
   2. Öte yandan, başka bir forseps çifti kullanarak, her sivrisineğin sol kanadını inceleyin, kanadı çıkarmak için hafif bir baskı kullanarak kanadın eklemini ve göğüs kısmını çıkarın, kanat damarlarını yırtmadan kanadın tamamını çıkarın.
3. Forseps kullanarak, kanadı düz bir şekilde uzanarak bir cam slayt üzerine yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak, slayttaki kanada% 70 etanol içeren 15 mL'lik bir stok çözeltisinden bir damla ve bir damla bulaşık deterjanı ekleyin.
4. Lameli bir damla% 80 gliserol ekleyin ve etanol-sabun çözeltisinde kanadın üzerine yerleştirin.
5. 65 mm lensli bir kamera kullanarak kızaklara monte edilmiş kanatları fotoğraflayın (7D-65 mm-1x; yakınlaştırma = 1, 200, 6.3, ISO = 100). Piksel/mm ölçeğine dikkat edin ve bunun tüm görüntüler için aynı kaldığından emin olun. Birden fazla kanat birlikte görüntüleniyorsa, fotoğrafları tek tek kanatlara kırpın ve her fotoğrafa ölçek çubukları ekleyin. Görüntüleri LZW sıkıştırmalı TIFF formatında kaydedin ve her görüntü ayrı kanat için tüm bilgilerle açıkça etiketlendi.
   NOT: Çalışmada fotoğrafı çekilen her kanat için ayarlar aynı kalırsa ve piksel/mm ölçeği aynı kalırsa, kanatlar farklı bir kamera ve büyütme kullanılarak veya diğer çalışmalar için mikroskoba bağlı bir kamera ile fotoğraflanabilir. Ölçümler belirlenirken piksel/mm oranı dikkate alınacaktır.
6. Ücretsiz, morfometrik görüntü işleme yazılımları olan tpsUtil ve tpsDig'i indirin. Yazılım hakkında daha ayrıntılı bilgi için Rohlf ^26,27'ye bakın.
7. Dijitalleştirmenin bir sonraki adımı için kanat fotoğraflarının bir TPS dosyasını oluşturmak için tpsUtil kullanarak kanatları dijitalleştirin.
   1. Bunu yapmak için tpsUtil'i açın ve işlem altında Görüntülerden tps dosyası oluştur'u seçin. Giriş'e tıklayın, tek tek kanat görüntülerini içeren dosyayı seçin ve ardından bu klasörü seçmek için herhangi bir görüntüyü seçin. Çıktıya tıklayın ve oluşturulacak dosyayı .tps biçiminde adlandırın. Kaydet'i tıklayın.
   2. Ardından, eylemler altında, Kurulum'a tıklayın. Tümünü dahil et'i seçin, oluştur'a tıklayın ve açılır kutuyu kapatın. İşlem altında, şimdi Numuneleri rastgele sırala'yı seçin. Girişe tıklayın ve yeni oluşturulan .tps dosyasını seçin. Çıktı'ya tıklayın, .tps dosyasını, örneklerin rastgele seçildiği dosya sürümü olduğunu belirtmek için yeniden adlandırın ve kaydet'e tıklayın. Ardından, Oluştur'u tıklayın. tpsUtil programını kapatın.
      NOT: Ölçüm hatasını azaltmak için, kanat fotoğrafları çoğaltılabilir ve teknik bir kopya için iki kez kullanılabilir.
8. Yer işaretleri için iki boyutlu Kartezyen koordinatları tanımlamak için tpsDig yazılımını kullanın. Giriş altında, adım 2.7'de oluşturulan .tps dosyasını seçin. Ölçeği adım 2.5'te belirlenen ölçeğe ayarlayın; Seçenekler'in altında Görüntü Araçları'nı seçin ve ardından Ölç'e tıklayın.
9. Yer işaretlerini sayısallaştırmayı temsil eden mavi artı işareti simgesine tıklayarak görüntüye yer işaretleri ekleyin ve ardından Şekil 5'te Yer İşareti 1'den Yer İşareti 14'e kadar sırayla gösterilen kanat bağlantılarına tıklayın.
   NOT: Bu yer işaretleri, daha önce kanat yer işareti sayısallaştırma ve analizinde¹⁹ kullanıldıkları, birçok örnekte kanat damarlarının birleşim yerlerinde bulunmalarının kolay olduğu ve kanadın boyutunu ve şeklini yakalamak için yeterli kanat yer işareti sağladıkları için seçilmiştir.
10. Yer işaretlerini işaretlerken, eksik veya belirsiz yer işaretlerini (kanat katlanması veya hasar nedeniyle) analizden çıkarmak ve yer işaretlerinin doğru sırasını korumak için M simgesini tıklayarak tpsDig'de eksik olarak işaretleyin. Dosyadaki tüm görüntüler tamamlanana kadar sonraki görüntüler için yer işareti sayısallaştırmayı tekrarlamak için sağa bakan kırmızı oka tıklayın. Dosyayı kaydedin ve kapatın.
    NOT: Kanat uzunluğu, alanı ve boyutu hesaplamalarının doğru olması için yer işaretlerinin kanat görüntüsüne her görüntü için doğru sırayla eklenmesi gerekir.
11. Ek Dosya 1'de sağlanan R betiğini kullanarak kanat uzunluğunu ve alanını hesaplayın, .tps dosya konumunu ve görüntü ölçeğini denemeye göre değiştirin.
12. Şekilden istatistiksel olarak bağımsız bir boyut ölçüsü olan kanat merkezi boyutunu hesaplayın ve^kanat 28,29'un merkez noktasından her bir yer işaretinin kare mesafelerinin toplamının karekökü olarak tanımlanır.
13. Şekil dışı varyasyonu kaldırmak için genelleştirilmiş bir procrustes hizalaması kullanın ve tüm yer işaretlerinin sağlam olduğu kanatları kullanarak ortalama yer işareti koordinatlarını çizin. Hem kanat merkezi boyutu hem de ortalama yer işareti belirlemesi için, Ek Dosya 2'de sağlanan R betiğini kullanın ve deneye göre .tps dosya konumunu ve görüntü ölçeğini değiştirin.

3. Yumurta verimliliğinin değerlendirilmesi

1. Tek dişilerden (1. adımda toplanan) toplanan kağıtlardan tek tek F₁ yumurtaları, ~100 mL taze sterilize edilmiş deiyonize su içeren polipropilen berrak şarküteri kaplarına yumurtadan çıkarın. Ad libitum besleme için iki veya üç damla öğütülmüş balık yemi bulamacı ekleyin. Kapların üst kısımlarını ağ veya organik ile hizalayın ve bir lastik bantla sabitleyin.
2. Yumurtadan çıktıktan 2-3 gün sonra, yumurta kağıtlarını sudan çıkarın ve bir kapak veya ağ ile kapatılmış yeni bir kaba koyarak ve böceğin içinde bırakarak gece boyunca kurumaya bırakın.
3. Yumurta kağıtlarını, tekrar su kabına koyarak, başlangıçta yumurtadan çıktıkları kaplarda yeniden çatlatın.
   NOT: Yumurta kağıtlarının kurutulması ve yeniden taranması, kuluçka verimliliğini büyük ölçüde artırır. Bu, diğer sivrisinek türleri için gerekli olmayabilir.
4. İlk yumurtadan çıktıktan 3-5 gün sonra, larvaları (2^{. ila 4}. instar) transgenik bir belirteç (varsa; Şekil 6). Birkaç larvayı aynı anda floresan mikroskop altında, kağıt havlularla kaplı bir organik veya ağın üzerine yerleştirilmiş bir filtre kağıdına yerleştirerek inceleyin. Kağıt havlular fazla suyu emer, böylece filtre kağıdı hareketsiz hale getirilmiş larvaları taramak ve manipüle etmek için kullanılabilir.
5. Pozitif veya negatif transgenik larva sayısını kaydedin. Negatif larvaları atın.
6. Optimum gelişme sürelerini sağlamak için larva suyunu temizleyin. Bunu yapmak için larvaları küçük bir kaba pipetleyin, kirli suyu atın ve taze musluk suyu ile değiştirin Pozitif larvaları ekleyin ve yeterli miktarda öğütülmüş balık yemi bulamacının mevcut olduğundan emin olun.
7. Doğurganlığı, transgenik veya kontrol larvalarının sayısının toplam yumurta sayısına bölünmesiyle hesaplayın.

4. Pupalarda cinsiyet oranının belirlenmesi

1. Yumurtadan çıktıktan 14 gün sonrasına kadar, erkek ve dişi pupa sayısını toplamaya ve kaydetmeye devam edin (adım 1.2.3'te açıklandığı gibi). Dişiler veya erkekler, cinsiyete göre 1,9 L'lik kaplarda bulunan küçük kaplara toplanabilir.
2. Cinsiyet oranını belirlemek için, her bir yetişkin dişi sivrisinek başına çalışma zaman çizelgesi boyunca toplanan F₁ dişi sayısını veya F₁ erkek sayısını ekleyin. Bu sayıyı, tek bir dişiden üretilen aynı sivrisinek hattı için toplanan toplam pupa sayısına bölün.

5. Larva canlılığının belirlenmesi

1. Larva canlılığını belirlemek için, her bir yetişkin dişi sivrisinek başına çalışma zaman çizelgesi boyunca toplanan toplam pupa sayısını ekleyin.
2. Bu sayıyı, 3. adımda sayılan aynı çizgi için her bir yetişkin dişi sivrisinek başına sayılan toplam larva sayısına bölün.

6. Larva-pupa gelişim zamanının belirlenmesi

1. Larvalardan pupalara gelişimini belirlemek için, larva sayısını ve hat başına pupa sayısını günlük olarak takip edin.
2. Larvadan pupaya gelişimini, yumurtadan çıktıktan sonra pupa gelişimine kadar geçen ortalama süre olarak hesaplayın.

7. Erkek katkı payının belirlenmesi

1. Yaş uyumlu erkekleri kullanarak, yetişkin bakire transgenik erkek sivrisinekleri buz üzerinde ve ayrıca yetişkin bakire erkek ve dişi kontrol sivrisineklerini uyuşturun.
2. 64 oz kartona 50 transgenik veya 50 kontrol erkeği (yaşa uygun) 100 kontrol dişisi ekleyerek transgenik veya kontrol dişi erkek yetişkinleri kontrol dişi yetişkinlerle çaprazlayın, böylece 100 dişi ile toplam 50 erkek olur (iki kontrol dişi: bir kontrol veya transgenik erkek). Hangi kartonda transgenik erkeklerde ve hangi kartonda kontrol erkekleri bulunduğunu etiketlediğinizden emin olun.
3. Çiftleşmenin 2-3 gün gerçekleşmesine izin verin. Bu süreden sonra, standart yetiştirme uygulamalarını izleyerek sivrisineklere kan unu verin.
4. Kan beslemesinden üç gün sonra, tamamen tıkanmış dişileri, adım 1'de (doğurganlık testi) açıklandığı gibi, önceden etiketlenmiş beyaz filtre kağıdı ile kaplı 50 mL'lik konik tüplere ayırın. Beslenmeyen dişileri atın veya ertesi gün onlara başka bir kan yemeği verin. Tüm tüpleri ~ 5 mL musluk suyu ile doldurun. Her bir konik borunun üzerine yerleştirilen ağın üzerine küçük bir parça kuru üzüm yerleştirin.
5. Dişileri böcekte 1-2 gün bekletin ve yumurtlamalarına izin verin. Yumurta kağıtlarını kan yemeğinden sonra 4-5 gün boyunca yumurta kağıtlarını görsel olarak inceleyin. Yumurtlama oranlarını artırmak için dişilerin yumurtlamaları için bir gün daha izin verin.
6. Yumurta kağıtlarını toplamak için suyu boşaltın ve daha önce tarif edildiği gibi 4 °C'de konik tüpler yerleştirerek dişileri uyuşturun. Dişi sivrisinekleri% 70 etanol içine koyarak atın.
7. Kağıtları kuruması için en az 5 gün böcekteki tüplerde bırakın. Kağıtları çıkarmak için forseps kullanın ve kuluçka için ~ 100 mL taze sterilize edilmiş deiyonize su içeren polipropilen şeffaf şarküteri kaplarına yerleştirin. Ad libitum besleme için 2-3 damla öğütülmüş balık yemi bulamacı ekleyin. Kapların üst kısımlarını bir lastik bantla sabitlenmiş ağ veya organik ile hizalayın.
8. Yumurtadan çıktıktan 2-3 gün sonra, yumurta kağıtlarını sudan çıkarın ve bir kapak veya ağ ile kapatılmış yeni bir kaba koyarak ve tekrar böceğin içine yerleştirerek gece boyunca kurumaya bırakın.
9. Yumurta kağıtlarını tekrar su kabına koyarak aynı kaplarda tekrar çatlatın.
10. İlk yumurtadan çıktıktan 3-5 gün sonra, larvaları (2^{. ila 4}. inç) transgenik bir belirteç (varsa) açısından görsel olarak inceleyin. Erkek katkısını,_F2 transgenik larva sayısının sivrisinek hattı başına toplam larva sayısına bölünmesiyle hesaplayın.

8. Sivrisinek ömrünün belirlenmesi

1. 50 erkek ve 50 dişi WT veya transgenik yaşa uygun kanla beslenmeyen sivrisinekleri uygun bir muhafazaya aktarın. Deney ilerledikçe sivrisineklere kolay erişim ve manipülasyon için üst açıklığı külotlu hortumla kaplanmış, bükülmüş ve düğümlenmiş 64 oz kartonlar kullanın (Şekil 7).
   NOT: İstatistiksel amaçlar için bunun üç nüsha halinde yapılması önerilir.
2. Şeker ve su kaynağı sağlayın. Burada kuru üzüm ve gazlı bezle kaplı, iki lastik bantla sabitlenmiş su dolu bir kap kullanıldı.
3. Her gün ölü erkek ve dişi sivrisineklerin sayısını takip edin. Uzun ömürlülüğü, sivrisineklerin kafesler boyunca ölmeden önce geçen ortalama gün sayısı olarak hesaplayın, bilgilendirici olmayan nedenlerden ölen sivrisinekleri atlayın (ezilme veya şekerde boğulma gibi sivrisinek ömrüne bağlı olmayan nedenler) ve çalışmanın sonunda hala hayatta olan sivrisinekleri atlayın.
   NOT: Hayatta kalma, t zamanına kadar hayatta kalma olasılığı veya S(t) = Pr(T>t) fonksiyonu olarak tanımlanır. Medyan sağkalım, hayatta kalma olasılığının 0.5 veya T_0.5 = ^S-1 x 0.5 olduğu zamandır.

Sonuçlar

Yukarıdaki protokolü takiben, iki sivrisinek hattının uygunluğu değerlendirildi: (1) Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424) tükürük proteininden CRISPR / Cas9 aracılı nakavt ve (2) Ae. otonom CRISPR / Cas9 aracılı gen sürücülerini ifade eden aegypti hatları⁹. İlki durumunda, D7L1 genine özgü sgRNA'larla embriyoların mikroenjekte edilmesinden sonra bozulmayı oluşturmak için homolog olmayan uç birleştirme yolundan (NHEJ) yararlanılarak homozigot bir D7L1 ...

Tartışmalar

Ae. aegypti uygunluk çalışmaları, bu yazıda tartışıldığı gibi, transgenik kargo (örneğin, gen sürücü elemanları) veya gen nakavtları ile ilişkili uygunluk maliyetlerini değerlendirmek için genellikle laboratuvarda gerçekleştirilir; bununla birlikte, bu çalışmalar çeşitli amaçlar için yapılabilir - Wolbachia ile enfekte^30,31, böcek ilacına dirençli^32,33

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 oz. translucent plastic souffle cups	WebstaurantStore	301100PC
2 oz. translucent polystyrene souffle cups	WebstaurantStore	760P200N
3 mL plastic pipettors	Cornin	357524
50 mL conical tubes	Any brand
64 oz. white double poly-coated paper food cup	WebstaurantStore	999SOUP64WB	for mosquito enclosement
65 mm lens	Canon	MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo	Canon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
Aedes aegypti mosquitoes	BEI	multiple strains as eggs are available
Artifical membrane feeders	https://lillieglassblowers.com/	Meduim membrane feeder, Custom made, 33mm	Chemglass also offers, but sizes are wrong for us. Ours are about 3 cm?
ATP	MP Biomedical	ICN15026605	Any good quality ATP, 10mM filter sterile aliquots at -20
Autoclave			for sterilizing water for hatching
Canon EOS 7D camera	Canon	3814B004	for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
defibrinated sheep blood	Colorado Serum Co.	60 ml, every 2 weeks	https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
Dual Gooseneck Microscope Illuminator	Dolan Jenner Fiber-Lite 180	181-1 System
Ethanol
Forceps	Dumont	5SF
Gauze		omnisorb ii	4" non-woven sponges
glass microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Glass Petri dishes, 100 × 15 mm	VWR	75845-546	for anesthesizing/manipulating mosquitoes on ice
Hogs' gut	Any Deli		we buy in bulk, split, wash and store in small aliquots of ~4X12" at -20 in 50 ml conical
Ice
Ice bucket
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Leica GZ4 StereoZoom microscope			for screening transgenic mosquitoes (if applicable)
Paintbrush	AIT synthetic brush	size 10-0	for manipulating larvae/pupae (Amazon)
Panty hose	Walmart	L'eggs Everyday	Women's Nylon Plus Knee Highs Sheer Toe, 16 pairs (plus fits the carton)
Pencils	Any brand
Plastic containers for 2° storage of cartons	Walmart		Sterilite 58 Qt Storage Box Clear Base White Lid Set of 8
Plastic containers for growing larvae	Walmart		Sterilite 28 Qt. Storage Box Plastic, White, Set of 10
Plastic containers for hatching larvae	Walmart		Sterilite 6 Qt. Storage Box Plastic, White
polypropylene clear deli containers	WebstaurantStore	127DM12BULK	12 oz, or 16 oz if needed for bigger (127RD16BULK)
Rubber bands	Office Max	#100736/#909606 /#3777415	12", #64 and #10
Rubber stopper	VWR	217-0515	for mosquito enclosement
Sugar source, such as sugar cubes or raisins
Tetramin flake food	Tetramin	16106
tpsDig	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
tpsUtil	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
White organza fabric 8” × 8”	FabricWholesale.com	4491676	Joann Casa Collection Organza Fabric by Casa Collection
Whitman Grade 1 Qualitative Filter paper	Whitman	1001-824	for egg papers. The white color makes it easier to see the black eggs.