Количественная оценка затрат на приспособленность трансгенных комаров Aedes aegypti

Резюме

В настоящем протоколе описывается, как измерить данные об общих жизненных параметрах комаров Aedes aegypti , включая плодовитость, размер крыльев, фертильность, соотношение полов, жизнеспособность, время развития, вклад самцов и продолжительность жизни взрослых особей. Эти измерения могут быть использованы для оценки приспособленности трансгенных комаров.

Аннотация

Трансгенные комары часто демонстрируют затраты на приспособленность по сравнению со своими дикими собратьями. В связи с этим исследования затрат на приспособленность включают в себя сбор данных о параметрах жизни генетически модифицированных комаров и сравнение их с комарами, лишенными трансгенов из того же генетического фона. В данной рукописи показано, как измерить общие черты жизненного цикла комара Aedes aegypti, включая плодовитость, размер и форму крыльев, фертильность, соотношение полов, жизнеспособность, время развития, вклад самцов и продолжительность жизни взрослых особей. Эти параметры были выбраны потому, что они отражают репродуктивный успех, просты в измерении и часто упоминаются в литературе. Репрезентативные результаты количественно оценивают затраты на приспособленность, связанные либо с нокаутом гена, либо с однократной вставкой элемента генного драйва. Стандартизация способов сбора данных о жизненных параметрах важна, поскольку такие данные могут быть использованы для сравнения здоровья трансгенных комаров, полученных в ходе исследований, или для моделирования скорости фиксации трансгенов в смоделированной популяции комаров дикого типа. Хотя этот протокол специфичен для трансгенных Aedes aegypti, он также может быть использован для других видов комаров или других экспериментальных условий лечения, с оговоркой, что определенные биологические контексты могут потребовать специальной адаптации.

Введение

Выживание наиболее приспособленных — это дарвиновская идея о том, что индивидуумы, обладающие генами, наиболее приспособленными к окружающей среде, передадут эти гены последующим^{поколениям.} Это означает, что именно приспособленность определяет, выживут ли их гены. Эта более чем 150-летняя концепция, возможно, является наиболее важным фактором, определяющим успешный генный драйв у трансгенных комаров. Генные драйвы, или суперменделевская модель наследования эгоистичного генетического элемента, которая позволяет ему распространяться в популяциях^, исследуются для^{генетической борьбы} с вредителями. В контексте борьбы с переносчиками эта стратегия направлена либо на замену членистоногих дикого типа (WT) на устойчивых к патогенам (модификация популяции), либо на их полную ликвидацию (подавление популяции)⁴. Тем не менее, трансгенные комары часто демонстрируют затраты на приспособленность (также называемые генетической нагрузкой) по сравнению со своими собратьями WT, что означает, что трансген будет потерян в популяциях, которые могут их превзойти. Таким образом, сопряжение трансгенов с системой генного драйва необходимо для компенсации любых затрат на приспособленность и продвижения трансгена через популяцию на уровнях, превышающих ожидаемые от типичного менделевского наследования^.

Лабораторные исследования на видах комаров-переносчиков показали, что трансгены часто демонстрируют затраты на приспособленность ^5,6,7. Например, Irvin et al. измеряли различные жизненные параметры у Aedes (Ae.) aegypti, сконструированных для экспрессии генов усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP) или транспозазы под действием Drosophila actin 5C или синтетических промоторов 3XP3, и сравнивали их с диким типом штамма Orlando (тот же генетический фон, из которого они были получены)⁵. В частности, они обнаружили, что у всех трансгенных штаммов значительно снижена^{репродуктивная} приспособленность. В зависимости от трансгена, некоторые комары Anopheles (An.), экспрессирующие трансгены, которые ингибируют развитие паразита Plasmodium^{, также} демонстрировали затраты на приспособленность. В частности, An. stephensi, экспрессирующий фосфолипазу пчелиного яда (PLA2) под действием конститутивных или индуцируемых кровяной мукой промоторов, откладывал значительно меньше яиц по сравнению с контролем⁶. Эти авторы также обнаружили, что трансгенные Anopheles, экспрессирующие другой трансген, тетрамер додекапептида SM1, не демонстрируют затрат на приспособленность, что привело их к выводу, что затраты на приспособленность, связанные с трансгеном, зависят, по крайней мере вероятно, частично, от^{эффекта производимого} трансгенного белка. Действительно, затраты на приспособленность могут быть связаны с продуктами трансгенов, позиционными эффектами, нецелевыми эффектами, инсерционным мутагенезом или эффектами инбридинга^{в штаммах}, выращенных в лаборатории. Поэтому генные драйвы должны быть достаточно надежными, чтобы компенсировать эти затраты на приспособленность, вызванные трансгенами, а также предотвращать развитие вставок и делеций (инделов), которые блокируют сам драйв.

Затраты на развитие или репродуктивную приспособленность могут быть измерены в лабораторных исследованиях или исследованиях в^{клетке7}, с оговоркой, что неизвестные факторы в полевых условиях также могут оказывать влияние. Тем не менее, контролируемые исследования приспособленности являются важным первым шагом при планировании или оценке выпуска генетически модифицированных комаров, таких как программа генного драйва, чтобы определить, сохранится ли трансгенная линия в последующих поколениях. Например, Hammond et al. оценено Гамбийские генные драйвы на основе CRISPR/Cas9, предназначенные для разрушения генов, необходимых для женской фертильности⁸. В ходе исследований в клетках, проводившихся в течение как минимум 25 поколений, авторы обнаружили, что комары обладали устойчивыми к генному драйву аллелями, которые блокировали расщепление, нацеленное на CRISPR, и восстанавливали женскую фертильность^. Их усилия по моделированию показали, что фертильность у самок, гетерозиготных по генному драйву, оказывает наиболее значительное влияние на фиксацию генного драйва в смоделированных^{условиях.} В том же ключе Ae. aegypti (штамм белого глаза Хиггса, HWE), сконструированный для экспрессии автономных кассет генного драйва под разными промоторами или в разных межгенных локусах, продемонстрировал различную скорость фиксации генного драйва в смоделированных популяциях⁹. Используя моделирование MGDrivE¹⁰ в сочетании с измеренными темпами образования инделов, материнскими эффектами и собранными в лаборатории данными о жизненных параметрах, авторы обнаружили, что приспособленность комаров наиболее сильно влияет на персистенцию генного драйва в смоделированных условиях^. Затраты на приспособленность, которые с наибольшей вероятностью ухудшают эффективность генного драйва, обусловлены соматической экспрессией Cas9 (чрезмерной) или геном, который является мишенью, особенно у гетерозигот, а не самим внутренним драйвом 11,12,13,14,15,16,17.

Учитывая его значимость, приспособленность является важным фактором для способности трансгенной линии сохраняться в последующих поколениях, и его можно использовать в качестве индикатора любых физиологических эффектов, связанных с трансгеном. Например, побочные эффекты могут быть связаны с затратами на фитнес. В этом случае рекомендуется обратное скрещивание трансгенной линии в течение нескольких поколений. Кроме того, пересечение трансгенной линии с линией, отражающей популяцию поля, также может быть необходимо для исследования того, насколько хорошо трансгенная популяция может конкурировать в реальном мире. Для количественной оценки затрат на приспособленность и их сопоставимости в данной рукописи представлены простые протоколы измерения общих черт жизненного цикла комаров Ae. aegypti, с особым акцентом на затраты на приспособленность, связанные с трансгенами, чтобы такие исследования можно было легче воспроизвести. Протоколы включают плодовитость, фертильность, соотношение полов, жизнеспособность, время развития, вклад самцов и продолжительность жизни взрослого человека. Измерение длины и площади крыльев также было выбрано в качестве измерения физической формы, поскольку оно коррелирует с длиной грудной клетки^18,19 и размерами тела, которые напрямую связаны с размером кровяной муки, плодовитостью и иммунитетом ^20,21. Несмотря на то, что существует множество способов оценки приспособленности, эти параметры были выбраны, потому что они отражают репродуктивный успех, просты в измерении и часто упоминаются в литературе.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол написан для трансгенных линий и линий дикого типа Ae. aegypti , которые были ранее валидированы и установлены. Для получения дополнительной информации о создании трансгенного Ae. aegypti см. Kistler et al.²² и Coates et al.²³. Все эксперименты, описанные ниже, проводились в соответствии со стандартными процедурами выращивания Ae. aegypti . Комары содержались при температуре 28 °C при относительной влажности 75%-80% и цикле 12 часов света / 12 часов в темноте. Для статистических целей настоятельно рекомендуется иметь не менее 100 отдельных бумаг от яиц на одно пятно от комаров. Комплексные исследования физической формы занимают около 3 месяцев (Рисунок 1).

1. Измерение плодовитости у самок комаров

1. Выводите трансгенных и WT комаров (с тем же генетическим фоном, но без трансгена), помещая яичные листы в стерильную воду на ночь в инсектарии, следуя стандартным условиям выращивания. Позвольте личинкам питаться в неограниченном количестве , давая несколько капель (каждая около 50 мкл) суспензии корма для измельченных рыб (Tetramin) (примерно 30% по массе). Личинки первого возраста узнаваемы через 1 день после вылупления. Поместите личинок в большие контейнеры, чтобы не было скученности, как правило, 100-150 личинок можно вырастить в объеме 1 л воды с площадью поверхности около 250^см2. Продолжайте обеспечивать суспензию Tetramin в качестве источника пищи, позволяя личинкам питаться в неограниченном количестве. Добавляйте пищевую кашицу отдельными каплями, чтобы личинкам всегда было доступно достаточное количество пищи и чтобы вода не казалась мутной. Личинки будут увеличиваться в размерах с каждым возрастом и в конечном итоге окуклятся в личиночных чашах.
2. Как только куколки начнут появляться, через ~5-6 дней после вылупления, разделите их по половому признаку, чтобы убедиться, что взрослые особи являются девственниками после появления (для последующего спаривания), как описано ниже.
   1. Чтобы отсортировать куколок по половому признаку, начните с их сбора с помощью пластиковых пипеток объемом 3 мл в небольшие пластиковые стаканчики, содержащие чистую воду из-под крана. Куколки самцов, как правило, меньше и имеют тенденцию появляться первыми по сравнению с самками. Сначала отсортируйте куколок по размеру, а затем подтвердите этот первоначальный отсев по морфологии.
   2. Переместите куколку на предметное стекло микроскопа и удалите лишнюю воду салфеткой. Это обездвиживает куколку. Под стереоскопом при увеличении 2x-4x расположите куколку брюшной стороной вверх с помощью кисти с тонким наконечником.
   3. Визуально проанализируйте хвост на предмет различий в форме генитальных долей (на конце куколки, брюшных сегментов за лопатками; Рисунок 2). У самок заостренные плавники, которые выходят за пределы половых долей, примерно напоминая корону или зубы вампира, в то время как мужские половые доли округлые и не имеют этих заостренных структур. Carvalho et al.²⁴ для дополнительных цифр.
3. Поместите куколок мужского и женского пола в отдельные стаканчики для воды и поместите их в надлежащие контейнеры, например, картонные коробки объемом 1,9 л (1/2 галлона или 64 унции) с белой тканью органди размером 0,2 м x 0,2 м (8 дюймов x 8 дюймов), каждая из которых содержит ~150 куколок.
4. Предусмотрите источник сахара и воды в верхней части клеток (например, изюм и наполненную водой чашку, накрытую марлей, защищенную двумя резинками). Прорежьте отверстие размером с загон в картонных коробках и закройте его резиновой пробкой, чтобы в клетки можно было добавить дополнительных куколок по мере их появления.
5. Через 3-5 дней после появления взрослых особей обезболите комаров, поместив картонные коробки при температуре 4 °C на ~2-5 минут. Хотя они все еще могут дергаться, комары достаточно обезболиваются, как только большинство из них падают на дно картонной коробки. Поместите комаров на стеклянную чашку Петри на лед на ~30 мин-1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком долгое пребывание комаров при температуре 4 °C может значительно повлиять на их здоровье, хотя мы не обнаружили никаких последствий, если оставить их на льду на срок до 1 часа.
6. Скрещивание самцов WT или трансгенных GD1 или GD2⁹ (CRISPR/Cas-9-based geno drive) в массовом порядке с девственными самками WT (контрольной группы), добавляя обезболенных комаров в соотношении пять самцов WT или трансгенных самцов на одну самку WT в картонные коробки от комаров, каждая из которых содержит ~150 комаров. Обязательно маркируйте клетки по типу самца.
   Примечание: Эта схема скрещивания предназначена для определения пригодности гемизигот GD1 или GD2⁹ (т.е. комаров, несущих одну копию трансгена). Для определения приспособленности к гомозиготным трансгенным линиям схема скрещивания может быть адаптирована таким образом, чтобы трансгенные самцы и самки допускались к спариванию по сравнению с скрещиваниями самцов и самок WT.
7. Через 2-3 дня самки получают кровь, следуя стандартным методам выращивания²⁵ , обеспечивая источник крови в верхней части клетки. Исключите источник сахара за 24 часа до кормления кровью и источник воды ~ за 2-3 часа до кормления кровью для повышения эффективности кормления.
8. После кормления кровью обезболите комаров, поместив их при температуре 4 °C, как в шаге 1.5.
9. Отсортируйте накормленных кровью (полностью набухших) самок от ненасытных самок, визуально проверив их брюшко на предмет набухания. Отбраковывайте некормленных, недокормленных и самцов.
10. Поместите набухших самок обратно в соответствующие клетки и обеспечьте источник сахара и воды в верхней части клеток.
11. Через 2-3 дня поместите отдельных самок в конические пробирки объемом 50 мл, выстланные фильтровальной бумагой, которая была предварительно помечена карандашом (рис. 3). Накройте конические трубки сеткой и уплотните двумя резинками.
12. Как только самки проснутся, наполните все трубки ~5 мл водопроводной воды. Положите небольшой кусочек изюма или пропитанный сахаром ватный шарик на вершину каждой конической трубки. Оставьте самок на 1-2 дня в инсектарии и дайте им отяйцеваться.
13. Через 1-2 дня слейте воду из каждой конической трубки и обезболите комаров, поместив их при температуре 4 °C. Для быстрой обработки используйте наконечник пластиковой пипетки объемом 3 мл, прижатый к сетке, чтобы слить воду из каждой конической трубки. Переверните трубки вверх дном и положите их поверх бумажного полотенца для стекания. Поместите конические пробирки объемом 50 мл в держатель для пробирок и установите штатив при температуре 4 °C.
14. Соберите бумагу для яиц и посчитайте количество яиц на каждой бумаге. Посчитайте самок, которые не откладывают яйца, как 0 и включите их в анализ. Рассчитайте среднюю плодовитость как общее количество яиц, подсчитанных на каждой бумаге, деленное на общее количество самок, прошедших скрининг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цифровые изображения отдельных листов с яйцеклетками могут служить визуальной записью для подтверждения подсчета (Рисунок 4).
15. Высушите бумаги для яиц и положите их обратно в инсектарий. Рекомендуется просушить бумаги для яиц не менее 3-5 дней для оптимального вылупления²⁵.

2. Измерение длины, площади и размера центроида крыла

1. Заморозьте не менее 25 самок, которых кормили кровью WT или трансгенных самок соответствующего возраста, из завершенного исследования плодовитости, поместив клетки с комарами при температуре -20 °C примерно на 15 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не замораживайте в течение длительного периода времени, не трясите и не роняйте контейнер, так как это может привести к тому, что крылья комаров упадут.
2. Рассеките левое крыло каждого комара, иссекая его на стыке крыла и грудной клетки, удаляя крыло целиком, следуя приведенному ниже протоколу.
   1. В одной руке держите комара щипцами, захватывая область грудной клетки под крыльями.
   2. Используя еще одну пару щипцов в другой руке, рассеките левое крыло каждого комара, иссекая на стыке крыла и грудной клетки, слегка надавливая, чтобы оторвать крыло, удаляя крыло целиком, не разрывая вены крыла.
3. С помощью щипцов поместите крыло на предметное стекло, лежа ровно. С помощью переводной пипетки добавьте одну каплю из 15 мл исходного раствора, состоящего на 70% из этанола, и одну каплю средства для мытья посуды в крыло на предметном стекле.
4. Добавьте одну каплю 80% глицерина в покровный стекло и поместите сверху крыла в раствор этанола-мыла.
5. Сфотографируйте крылья, установленные на слайдах, с помощью фотоаппарата с объективом 65 мм (7D-65 мм-1x; zoom = 1, 200, 6.3, ISO=100). Обратите внимание на масштаб в пикселях/мм и убедитесь, что он остается одинаковым для всех изображений. Если несколько крыльев изображены вместе, обрежьте фотографии до отдельных крыльев и добавьте масштабные линейки к каждой фотографии. Сохраните изображения в формате TIFF со сжатием LZW, при этом каждое изображение должно быть четко помечено всей информацией об отдельном крыле.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крылья могут быть сфотографированы с помощью другой камеры и увеличения или с помощью камеры, прикрепленной к микроскопу для других исследований, если настройки остаются прежними, а масштаб пикселя/мм остается неизменным для каждого сфотографированного крыла в исследовании. Соотношение пикселей/мм будет учитываться при определении измерений.
6. Загрузите tpsUtil и tpsDig, которые являются бесплатными программами для обработки морфометрических изображений. Смотрите Rohlf^26,27 для получения более подробной информации о программном обеспечении.
7. Оцифруйте крылья с помощью tpsUtil, чтобы создать файл TPS с фотографиями крыльев для следующего этапа оцифровки.
   1. Для этого откройте tpsUtil, и в разделе "Операция" выберите пункт Построить файл tps из образов. Нажмите кнопку ввода, выберите файл, содержащий отдельные изображения крыльев, а затем выберите любое изображение, чтобы выбрать эту папку. Нажмите кнопку «Вывод» и назовите файл, который будет создан, в формате .tps. Нажмите «Сохранить».
   2. Затем в разделе «Действия» нажмите «Настроить». Выберите «Включить все», нажмите «Создать » и закройте всплывающее окно. В разделе "Операция" выберите "Случайно заказать экземпляры". Нажмите кнопку ввода и выберите только что созданный файл .tps. Нажмите кнопку «Вывод», переименуйте файл .tps, чтобы указать, что это версия файла с рандомизированными образцами, и нажмите кнопку «Сохранить». Затем нажмите кнопку Создать. Закройте программу tpsUtil.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить погрешность измерения, фотографии крыла могут быть продублированы и использованы дважды для технического воспроизведения.
8. Используйте программное обеспечение tpsDig для определения двумерных декартовых координат ориентиров. В разделе «Входные данные» выберите файл .tps, созданный на шаге 2.7. Установите масштаб в масштабе, определенном шагом 2.5; В разделе Параметры выберите Инструменты обработки изображений, а затем нажмите кнопку Измерить.
9. Добавьте ориентиры на изображение, нажав на синий значок перекрестия, представляющий оцифровать ориентиры, а затем нажмите на стыки крыльев, указанные на рисунке 5, в порядке от ориентира 1 до ориентира 14.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти ориентиры были выбраны потому, что они ранее использовались для оцифровки и анализа ориентиров^крыла19, их легко найти на стыках жилок крыла во многих образцах и они обеспечивают достаточное количество ориентиров крыла для фиксации размера и формы крыла.
10. При маркировке ориентиров отметьте все отсутствующие или затемненные ориентиры (из-за складывания крыла или повреждения) как отсутствующие в tpsDig, щелкнув значок M , чтобы исключить их из анализа и сохранить правильный порядок ориентиров. Щелкните красную стрелку вправо, чтобы повторить оцифровку для следующих изображений, пока все изображения в файле не будут завершены. Сохраните и закройте файл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентиры должны быть добавлены к изображению крыла в правильном порядке для каждого изображения, чтобы расчеты длины, площади и размера крыла были правильными.
11. Рассчитайте длину и площадь крыла с помощью скрипта R, представленного в дополнительном файле 1, изменяя местоположение файла .tps и масштаб изображения в соответствии с экспериментом.
12. Вычислите размер центроида крыла, меру размера, статистически независимую от формы, определяемую как квадратный корень из суммы квадратов расстояний каждого из ориентиров от центральной точки крыла ^28,29.
13. Используйте обобщенное выравнивание прокрустов, чтобы удалить неформальные вариации и построить координаты средних ориентиров, используя крылья, у которых все ориентиры не повреждены. Для определения как размера центроида крыла, так и среднего ориентира используйте скрипт R, представленный в дополнительном файле 2, изменяя расположение файла .tps и масштаб изображения в соответствии с экспериментом.

3. Оценка фертильности яйцеклеток

1. Выведите отдельные яйца F₁ из бумаги, собранной у одиночных самок (собранной на шаге 1), в полипропиленовые прозрачные контейнеры для деликатесов, содержащие ~100 мл свежестерилизованной деионизированной воды. Добавьте две-три капли навозной жижи измельченной рыбьей пищи для кормления в неограниченном количестве. Сверху емкости выстелите сеткой или органди, и закрепите резинкой.
2. Через 2-3 дня после вылупления выньте бумаги из яиц из воды и дайте им высохнуть в течение ночи, поместив их в новую емкость, накрытую крышкой или сеткой, и оставив в инсектарии.
3. Повторно вылупите яйцеклетки в тех же контейнерах, в которых они были первоначально вылуплены, поместив их обратно в емкость с водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сушка и повторная вылупление бумаги для яиц значительно повышает эффективность вывода. Для других видов комаров это может быть не обязательно.
4. Через 3-5 дней после первоначального вылупления визуально осмотрите личинки (со^2-го по^4-й возраст) на наличие трансгенного маркера (если применимо; Рисунок 6). Осмотрите несколько личинок под флуоресцентным микроскопом одновременно, поместив их на лист фильтровальной бумаги, помещенный сверху на органды или сетку, выстланную бумажными полотенцами. Бумажные полотенца впитывают лишнюю воду, так что фильтровальная бумага может использоваться для скрининга и манипулирования обездвиженными личинками.
5. Запишите количество положительных или отрицательных трансгенных личинок. Отбраковывайте отрицательные личинки.
6. Очистите воду для личинок, чтобы обеспечить оптимальное время развития. Для этого поместите личинки пипеткой в небольшую чашку, слейте грязную воду и замените ее свежей водой из-под крана.
7. Рассчитывайте фертильность как количество трансгенных или контрольных личинок, деленное на общее количество яиц.

4. Определение соотношения полов у куколок

1. В течение 14 дней после вылупления продолжайте собирать и регистрировать количество куколок самцов и самок (как описано в шаге 1.2.3). Самок или самцов можно объединять, по половому признаку, в небольшие чашки, помещенные в контейнеры объемом 1,9 л.
2. Чтобы определить соотношение полов, сложите количество самок F₁ или количество самцов F₁ , собранных на временной шкале исследования на одну отдельную взрослую самку комара. Разделите это число на общее количество куколок, собранных для той же линии комаров, полученной от одной самки.

5. Определение жизнеспособности личинок

1. Чтобы определить жизнеспособность личинок, сложите общее количество куколок, собранных за всю временную шкалу исследования на одну взрослую самку комара.
2. Разделите это число на общее количество личинок, подсчитанных на одну взрослую самку комара для той же линии, что и на шаге 3.

6. Определение времени развития от личинок до куколок

1. Чтобы определить развитие личинок в куколки, ежедневно отслеживайте количество личинок и количество куколок на линию.
2. Рассчитайте развитие от личинок до куколок как среднее время до развития куколок после вылупления.

7. Определение мужского вклада

1. Используя самцов соответствующего возраста, обезболить взрослых девственных трансгенных самцов комаров на льду, а также взрослых девственных самцов и самок контрольных комаров.
2. Скрестите трансгенных или контрольных самцов взрослых с контрольными самками, добавив 50 трансгенных или 50 контрольных самцов (соответствующего возраста) со 100 контрольными самками в картонные коробки по 64 унции, чтобы получить в общей сложности 50 самцов и 100 самок (две контрольные самки: одна контрольная или трансгенная самца). Обязательно пометьте, какая коробка содержит трансгенных мужчин, а какая — контрольные самцы.
3. Дайте произойти случке в течение 2-3 дней. По истечении этого времени предложите комарам кровяную муку в соответствии со стандартными методами выращивания.
4. Через три дня после кормления кровью разделите отдельных полностью набухших самок в конические пробирки объемом 50 мл, выстланные предварительно помеченной белой фильтровальной бумагой, как описано в шаге 1 (анализ плодовитости). Выбросьте некормленных самок или предложите им еще одну кровавую муку на следующий день. Наполните все трубки ~5 мл водопроводной воды. Положите небольшой кусочек изюма на сетку, помещенную поверх каждой конической трубки.
5. Оставьте самок на 1-2 дня в инсектарии и дайте им отяйцеваться. Визуально осмотрите бумаги о яйцах в течение 4-5 дней после кровавой муки на наличие яиц. Дайте самкам дополнительный день для откладки яиц, чтобы увеличить показатели яйцекладки.
6. Чтобы собрать бумаги от яиц, слейте воду и обезболите самок, поместив конические трубки при температуре 4 °C, как описано ранее. Откажитесь от самок комаров, поместив в них 70% этанол.
7. Оставьте бумаги в тюбиках в инсектарии минимум на 5 дней для высыхания. С помощью щипцов удалите бумаги и поместите их в полипропиленовые прозрачные контейнеры для деликатесов, содержащие ~100 мл свежестерилизованной деионизированной воды для вылупления. Добавьте 2-3 капли навозной жижи для измельченной рыбы для кормления в неограниченном количестве. Сверху емкости выстелите сеткой или органди, закрепленной резинкой.
8. Через 2-3 дня после вылупления выньте листы для яиц из воды и дайте им высохнуть в течение ночи, поместив их в новую емкость, накрытую крышкой или сеткой, и поместите обратно в инсектарий.
9. Повторно вылупите бумаги для яиц в тех же контейнерах, поместив их обратно в контейнер с водой.
10. Через 3-5 дней после первоначального вылупления визуально осмотрите личинки (со^2-го по^4-й возраст) на наличие трансгенного маркера (если применимо). Рассчитайте вклад самцов как количество трансгенных личинок_F2 , деленное на общее количество личинок на линию комаров.

8. Определение долголетия комаров

1. Пересадите 50 самцов и 50 самок WT или трансгенных комаров соответствующего возраста, не питающихся кровью, в подходящий вольер. Используйте картонные коробки по 64 унции, верхнее отверстие которых выстлано колготками, скрученными и завязанными узлом, для легкого доступа к комарам и манипуляций с ними по ходу эксперимента (Рисунок 7).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется делать это в трех экземплярах для статистических целей.
2. Обеспечьте источник сахара и воды. Здесь использовался изюм и наполненная водой чашка, выстланная марлей, закрепленная двумя резинками.
3. Отслеживайте количество погибших самцов и самок комаров каждый день. Рассчитайте продолжительность жизни как среднее количество дней, прошедших до того, как комары умрут в клетках, исключив комаров, которые умирают по неинформативным причинам (причинам, не связанным с продолжительностью жизни комаров, например, раздавливание или утопление в сахаре), и исключив комаров, которые все еще живы в конце исследования.
   Примечание: Выживание определяется как вероятность остаться в живых до момента t, или функция S(t) = Pr(T>t). Медиана выживаемости — это время, при котором вероятность выживания равна 0,5, или T_0,5 = ^S-1 x 0,5.

Результаты

В соответствии с приведенным выше протоколом оценивали приспособленность двух линий комаров: (1) CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута белка слюны Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424) и (2) линий Ae. aegypti , экспрессирующих автономные CRISPR/Cas9-опосредованные генные драйвы⁹. В первом случае гомозиг...

Обсуждение

Исследования приспособленности Ae. aegypti часто проводятся в лаборатории для оценки затрат на приспособленность, связанных с трансгенным грузом (например, элементами генного драйва) или нокаутами генов, как обсуждается в данной рукописи; Тем не менее, эти исследования могут быть...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 oz. translucent plastic souffle cups	WebstaurantStore	301100PC
2 oz. translucent polystyrene souffle cups	WebstaurantStore	760P200N
3 mL plastic pipettors	Cornin	357524
50 mL conical tubes	Any brand
64 oz. white double poly-coated paper food cup	WebstaurantStore	999SOUP64WB	for mosquito enclosement
65 mm lens	Canon	MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo	Canon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
Aedes aegypti mosquitoes	BEI	multiple strains as eggs are available
Artifical membrane feeders	https://lillieglassblowers.com/	Meduim membrane feeder, Custom made, 33mm	Chemglass also offers, but sizes are wrong for us. Ours are about 3 cm?
ATP	MP Biomedical	ICN15026605	Any good quality ATP, 10mM filter sterile aliquots at -20
Autoclave			for sterilizing water for hatching
Canon EOS 7D camera	Canon	3814B004	for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
defibrinated sheep blood	Colorado Serum Co.	60 ml, every 2 weeks	https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
Dual Gooseneck Microscope Illuminator	Dolan Jenner Fiber-Lite 180	181-1 System
Ethanol
Forceps	Dumont	5SF
Gauze		omnisorb ii	4" non-woven sponges
glass microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Glass Petri dishes, 100 × 15 mm	VWR	75845-546	for anesthesizing/manipulating mosquitoes on ice
Hogs' gut	Any Deli		we buy in bulk, split, wash and store in small aliquots of ~4X12" at -20 in 50 ml conical
Ice
Ice bucket
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Leica GZ4 StereoZoom microscope			for screening transgenic mosquitoes (if applicable)
Paintbrush	AIT synthetic brush	size 10-0	for manipulating larvae/pupae (Amazon)
Panty hose	Walmart	L'eggs Everyday	Women's Nylon Plus Knee Highs Sheer Toe, 16 pairs (plus fits the carton)
Pencils	Any brand
Plastic containers for 2° storage of cartons	Walmart		Sterilite 58 Qt Storage Box Clear Base White Lid Set of 8
Plastic containers for growing larvae	Walmart		Sterilite 28 Qt. Storage Box Plastic, White, Set of 10
Plastic containers for hatching larvae	Walmart		Sterilite 6 Qt. Storage Box Plastic, White
polypropylene clear deli containers	WebstaurantStore	127DM12BULK	12 oz, or 16 oz if needed for bigger (127RD16BULK)
Rubber bands	Office Max	#100736/#909606 /#3777415	12", #64 and #10
Rubber stopper	VWR	217-0515	for mosquito enclosement
Sugar source, such as sugar cubes or raisins
Tetramin flake food	Tetramin	16106
tpsDig	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
tpsUtil	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
White organza fabric 8” × 8”	FabricWholesale.com	4491676	Joann Casa Collection Organza Fabric by Casa Collection
Whitman Grade 1 Qualitative Filter paper	Whitman	1001-824	for egg papers. The white color makes it easier to see the black eggs.